Effiziente Polyethylenglykol (PEG) vermittelten Transformation von der Moss Physcomitrella patens
19. April 2011
Eine einfache und effiziente Methode zur Umwandlung Physcomitrella pantens Protoplasten beschrieben. Diese Methode wird von Protokollen für angepasste Physocmitrella Protonema Protoplasten und Arabidopsis Mesophyll Protoplasten-Transformation 1.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Umwandlung von SCO Metre Protoplasten. Dies wird erreicht, indem die Pflanzen zuerst mit Drizly verdaut werden. Als nächstes werden die Protoplasten mit Mannitol gewaschen, um das Drozly zu entfernen, und dann mit DNA und Peg inkubiert.
Schließlich werden die transformierten Protoplasten auf Platten verteilt und inkubiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden. Das zeigt, dass transformierte Protoplasten fluoreszenzmarkierte Proteine durch Fluoreszenzmikroskopie exprimieren. Y lu, ein Postdoc aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie effektiv ist und konsistent Protoplasten erzeugt, die das Protein von Interesse exprimieren: Um Moos zu isolieren, beginnen Protoplasten damit, neun Milliliter 8%iges Mannitol mit einem Spatel in eine Petrischale zu geben Legen Sie fünf bis sieben Tage altes Moos von zwei bis drei PP NH vier Platten in das Mannitol. Bitte beachten Sie hierzu und weitere Reagenzienrezepte das beigefügte schriftliche Protokoll. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter 2%tröpfeln hinzu und inkubieren bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln eine Stunde lang.
Filtrieren Sie die Mischung durch ein 100-Mikron-Netz, um eine grüne, homogene Suspension zu erhalten. Dann schleudern Sie das Filtrat fünf Minuten lang bei 250 g. Entsorgen Sie den Überstand sehr vorsichtig.
Resuspendieren Sie die Protoplasten in 500 Mikrolitern 8%igem Mannitol. Fügen Sie dann weitere 9,5 Milliliter 8% Mannitol hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Protoplasten vollständig aufgehängt sind.
Führen Sie die Waschschritte zwei weitere Male durch, indem Sie die Lösung erneut fünf Minuten lang bei 250 g schleudern. Verwerfen des Überstands und Wiederbelebung der Protoplasten. Zuerst in 500 Mikrolitern.
Dann 9,5 Milliliter 8% Mannitol mit einem Hämozytometer. Zählen Sie die Anzahl der Protoplasten in 10 Mikrolitern der Suspension, um die DNA in die isolierten Protoplasten umzuwandeln. Zuerst die Protoplastenmischung bei 250 g fünf Minuten lang schleudern.
Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Protoplasten bei 1,6 Millionen pro Milliliter in MMG-Lösung. Inkubieren Sie die Suspension 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend 600 Mikroliter der Protoplasts-Lösung in ein Kulturröhrchen mit 60 Mikrogramm DNA. Schütteln.
Geben Sie vorsichtig 700 Mikroliter PEG-Kalziumlösung hinzu und schütteln Sie sie. Inkubieren Sie die Probe während dieser Wartezeit 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. PRMB-Platten mit Zellophan abdecken.
Dann wird die Suspension mit drei Millilitern W fünf Minuten lang bei 250 G geschleudert. Um die PEG-Resuspension zu entfernen, werden die Protoplasten in zwei Millilitern PRMT-Platte, einem Milliliter pro PRMB-Platte, mit Zellophan bedeckt. Bewahren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius in einer Wachstumskammer auf.
Schließlich, vier Tage nach der Verarbeitung, das Cellophan auf frische Auswahlplatten geben. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel von 18 Tage alten Pflanzen, die aus Protoplasten regeneriert wurden, die mit 15 Mikrogramm supergewickeltem Plasma, DNA, transformiert wurden und eine Hygromycin-Resistenzkassette trugen. Hier wurden 30 Mikrogramm des gleichen supergewickelten Plasmids, der DNA, in Protoplasten umgewandelt.
In dieser Probe wurden 60 Mikrogramm karierte DNA transformiert. Und schließlich wurden diese Pflanzen aus Protoplasten regeneriert, die mit 120 Mikrogramm derselben supergewickelten Plasma-DNA transformiert wurden, die die Hygromycin-Resistenzkassette trägt. Die Transformationseffizienz wird durch DNA-Konzentrationen von bis zu 60 Mikrogramm nicht beeinflusst.
Höhere Konzentrationen der DNA sind jedoch nachteilig für dieses Verfahren. Die Daten deuten darauf hin, dass diese Methode konsistente Ergebnisse über einen weiten Bereich von DNA-Mengen liefert. Diese Technik kann in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden wie transiente RNAi- und Gen-Knockouts durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Genfunktion zu beantworten.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Transformation von Protoplasten von Physcomitrella patens. Die Technik ist von bestehenden Protokollen für die Protoplastentransformation abgeleitet und zielt darauf ab, durchgängig erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- Genetische Ingenieurtechnik
- Zellbiologie
Hintergrund
- Protoplasten sind Pflanzenzellen, bei denen die Zellwände entfernt wurden.
- Transformationsmethoden sind entscheidend, um die Genfunktion in Pflanzen zu untersuchen.
- Physcomitrella patens dient als Modellorganismus in der Pflanzenforschung.
- Bestehende Methoden zur Protoplastentransformation können komplex und zeitaufwendig sein.
Zweck der Studie
- Eine optimierte Protokollvariante für die Transformation von Physcomitrella patens-Protoplasten bereitstellen.
- Die Effizienz und Zuverlässigkeit der Protoplastentransformation verbessern.
- Weitere genetische Untersuchungen an Moosen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Verdauung von Moosgewebe mit Drizly zur Isolierung von Protoplasten.
- Waschen der Protoplasten mit Mannit zur Entfernung von Verunreinigungen.
- Transformation isolierter Protoplasten mit DNA unter Verwendung von PEG.
- Inkubation der transformierten Protoplasten auf selektivem Medium.
Hauptergebnisse
- Transformierte Protoplasten exprimierten erfolgreich fluoreszierende Proteine.
- Die Methode zeigte eine konsistente Transformations-Effizienz über verschiedene DNA-Konzentrationen hinweg.
- Höhere DNA-Konzentrationen erwiesen sich als nachteilig für den Transformationserfolg.
- Das gesamte Verfahren kann in etwa drei Stunden abgeschlossen werden.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Transformation von Physcomitrella patens-Protoplasten.
- Sie ermöglicht anschließende Experimente wie transiente RNAi und Gen-Knockouts.
- Das Protokoll kann wesentlich zum Verständnis der Genfunktion in Moosen beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die PEG-vermittelte Transformation von Physcomitrella patens-Protoplasten ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Genübertragung und unterstützt so die funktionelle Genomik mit hohem Durchsatz in Pflanzensystemen. Diese Fähigkeit ist entscheidend für frühe Entdeckungsteams, die die Genfunktion untersuchen, Zielstrukturen validieren und die Aufklärung von Signalwegen in einem genetisch zugänglichen Modell beschleunigen möchten. Die Skalierbarkeit und das Potenzial zur Standardisierung der Methode machen sie wertvoll für genetische Bildschirme und die mechanistische Risikominderung über das gesamte Portfolio hinweg.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die schnelle Untersuchung der Genfunktion durch effiziente DNA-Übertragung in Mooszellen.
- Ermöglicht eine Genzielmodifikation mit hoher Frequenz zur funktionellen Validierung von Zielstrukturen und zur Analyse von Signalwegen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem präzise genetische Modifikationen in einem Modellsystem ermöglicht werden.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit für nachgeschaltete biologische Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht einen standardisierten Protokollablauf zur Erzeugung einer großen Anzahl von Transformanten für Screening-Assays.
- Stellt reproduzierbare Transformations-Effizienz bereit und unterstützt damit die Zuverlässigkeit und Skalierbarkeit von Assays.
- Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme für die Bewertung von Verbindungen und phänotypische Screening-Verfahren.
- Verringert die Abhängigkeit von spezieller Ausrüstung und erhöht so die Zugänglichkeit für Teams, die an der Assay-Entwicklung arbeiten.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht downstream-Anwendungen wie transiente RNAi- und Gen-Knockout-Studien, die für die Krankheitsmodellierung relevant sind.
- Unterstützt die Kontinuität von der Genentdeckung bis zur präklinischen Validierung in pflanzlichen Systemen.
- Bietet eine Plattform zur translationellen Biomarkerforschung, wenn sie mit krankheitsrelevanten Signalwegen kombiniert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Transformationsprotokoll integriert sich in den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen und ermöglicht genetische Manipulationen, Zielvalidierung und Assay-Entwicklung in Pflanzenmodellen.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch effiziente Genübertragung und Expressionsanalyse.
- Screening: Unterstützt die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays durch die Erzeugung konsistenter transformierter Populationen.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse wie Transformationswirksamkeit und Proteinausprägung für den vergleichenden Analysenansatz.
- Translationale Forschung: Ermöglicht genetische Studien, die die Entwicklung präklinischer Modelle und die Identifizierung von Biomarkern unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine breit anwendbare, standardisierte Transformationsfähigkeit für vielfältige genetische Untersuchungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Untersuchung von Genfunktionen.
- Operationaler Wert: Bietet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für genetische Transformationsabläufe.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch von Projekten sowie die Kapitalnutzung, indem robuste Daten aus frühen Entwicklungsstadien generiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung genetischer Zielstrukturen und Signalwege.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur pflanzlicher Zellen und sterilen Techniken zur Isolierung und Transformation von Protoplasten.
- Benötigt Zugang zu einer grundlegenden Laborinfrastruktur, einschließlich Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie zur Validierung der Ergebnisse.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Transformationsparameter, um die Reproduzierbarkeit über verschiedene Projekte hinweg sicherzustellen.
- Kann Anpassungen erfordern, um in anderen Pflanzenarten oder Modellsystemen außerhalb von Physcomitrella patens eingesetzt zu werden.
- Die Transformationsrate ist empfindlich gegenüber der DNA-Konzentration, wobei höhere Mengen schädlich wirken können.
