Name: Effiziente Polyethylenglykol (PEG) vermittelten Transformation von der Moss Physcomitrella patens /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente PEG-vermittelte Transformation von Physcomitrella patens-Protoplasten. Diese Methode ermöglicht zuverlässige genetische Studien und Expression fluoreszierender Proteine in nur drei Stunden.

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1. Making the Protoplasten <ol><li> Add 9 ml 8% Mannitol in eine Petrischale. </li><li> Mit einem Spatel, legte 7 Tage alt Moos 2 bis 3 PPNH4 Platten von 5 - in der Petrischale mit Mannitol. </li><li> 3 ml 2% Driselase (Sigma D9515-25G) auf der Petrischale. </li><li> Inkubieren Sie die Petrischale bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln für 1 Stunde. </li><li> Filter der Protoplastensuspension durch ein 100 um Sieb (BD Falcon 352350). </li><li> Drehen Sie das gefilterte Suspension bei 250 g für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Re-suspend die Protoplasten sehr sanft mit 500 ul 8% Mannitol. </li><li> Fügen Sie 9,5 ml 8% Mannitol in die Kultur Röhre. Stellen Sie sicher, Protoplasten vollständig ausgesetzt. </li><li> Wiederholen Sie die Filtration und Resuspension Schritten (1,6, 1,7 und 1,8) zwei weitere Male. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ul der Protoplasten-Lösung und zählen die Protoplasten in einer Zählkammer. </li><li> Multiplizieren Sie die Anzahl der Protoplasten in einem 16 Quadratmeter Fläche um 10.000, die Zahl der Protoplasten pro ml zu erhalten (siehe Abbildung 1). </li></ol> 2. Transformation <ol><li> Spin der Protoplastensuspension bei 250 g für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Re-suspend Protoplasten in der MMG-Lösung bei einer Konzentration von 1,6 Millionen Protoplasten / ml. </li><li> Inkubieren Sie die Protoplastensuspension bei Raumtemperatur für 20 Minuten. </li><li> Add 600 ul der Protoplastensuspension in eine Kultur Röhrchen mit 60 ug DNA. Swirl das Rohr vorsichtig. </li><li> Add 700 ul PEG / Ca-Lösung in die Protoplasten / DNA-Mischung. Swirl das Rohr vorsichtig, bis das gesamte Mischung homogen ist. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li><li> Während dieser Wartezeit, decken PRM-B-Platten mit Zellophan (80 mm Durchmesser Kreise, AA Packaging Limited, UK); ermöglichen Zellophan zu Hydrat auf der Plattenoberfläche für mindestens 5 min. </li><li> Mit einem Spatel, entfernen Sie alle Luftblasen zwischen dem Cellophan und der Platte. </li><li> Verdünnen Sie die Mischung mit 3 ml W5-Lösung. </li><li> Drehen Sie das Gemisch bei 250 g für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Re-suspend Protoplasten in geschmolzenem 2 mL der PRM-T (vor der Zugabe zu den Protoplasten dieser Lösung flüssig gehalten bei 42 ° C sein kann). Plate 1 ml resuspendieren Protoplasten pro PRM-B Platte durch Cellophan abgedeckt. Wickeln Sie die Platten mit Micropore (3M, Health Care). Halten Sie die Platten bei 25 ° C in einer Klimakammer. </li><li> Alternativ können Protoplasten in 1 ml Flüssigkeit plating mittel-und vernickelt 0,5 ml auf einem PRM-B-Platte mit Cellophan abgedeckt resuspendiert werden. Dies ermöglicht eine schnellere Regeneration, aber die Zahl der Regeneration von Pflanzen ist geringer. </li><li> Growth Kammer ist für einen 16 h eingestellt. Licht und 8 Stunden. Dunkel-Zyklus. </li><li> Bewegen Sie das Zellophan auf eine frische Auswahl Platte 4 Tage nach der Transformation. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel der Transformation ist in Abbildung 2 dargestellt. Die DNA in diesem Beispiel wurde ein supercoiled 7,8 kb Plasmid, ein Hygromycin resistent Kassette. Die Höhe der Protoplasten vergoldet wurde auf 50% für die Fotografie reduziert. Die Bilder wurden zwei Wochen nach dem Pflanzen, um die Auswahl Platten wurden verlegt. Die Transformationseffizienz wird nicht durch die DNA-Konzentration von bis zu 60 ug betroffen. Höhere Konzentrationen von DNA wirken sich nachteilig auf die Effizienz der Transformation. Die Daten zeigten, dass diese Methode konsistentes Ergebnis über einen weiten Bereich von DNA-Mengen liefert. Diese Methode kann auch zu generieren stabile Transformanten effektiv wie in Tabelle 1 dargestellt, können wir über 4 stabile Transformanten pro Mikrogramm linearisierte DNA, die viel höher sind als das, was bisher 14 gemeldet wird erhalten. Wir testeten auch die Wirkung von Hitzeschock auf die Transformationseffizienz durch Umwandlung eines supercoiled Plasmid ein Gen für ein fluoreszierendes Protein als Marker. Der Hitzeschock erfolgte 10 Minuten nach Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt (im Schritt 2,6) durch Inkubation der Mischung in einem 45 ° C Wasserbad für 3 Minuten. Die Mischung wurde in einer Raumtemperatur Wasserbad unmittelbar nach Hitzeschock für 17 min inkubiert. Die Ergebnisse wurden 22 Stunden nach der Transformation aufgenommen. Die Verhältnisse der erhaltenen Transformanten mit und ohne Hitzeschock sehr ähnlich waren (~ 25%), aber wir beobachten einen negativen Effekt von Hitzeschock auf die Lebensfähigkeit der Protoplasten (Daten nicht gezeigt). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Blick auf Protoplasten in Hämozytometer. Der Abschnitt für Protoplasten Zählen gebraucht wird durch ein rotes Quadrat angezeigt. Beachten Sie die 16 Quadrate zu zählen Protoplasten (vgl. 1,11) erforderlich, das Bild zeigt eine Anzahl von 24 Protoplasten (240.000 Zellen / ml). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Bilder von 18 Tage alten transiente Transformanten. Protoplasten wurden transgebildet mit der angegebenen Menge supercoiled Plasmid. A: 15μg; B: 30 &amp;mgr; g; C: 60μg; D: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> DNA-Menge (pg) </td><td> Efficiency (Transformanten / ug DNA) </td></tr><tr><td> 15, supercoiled Plasmid </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, supercoiled Plasmid </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, supercoiled Plasmid </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, supercoiled Plasmid </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, linearisierte Plasmid </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Transformation Effizienz auf verschiedenen DNA-Mengen.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine einfache und konsistente DNA-Transformation in Physcomitrella patens Protoplasten. Diese Methode wurde ursprünglich für Arabidopsis 1 entwickelt, aber hier haben wir gezeigt, dass es gut funktioniert mit Protoplasten von Physcomitrella patens, eine einfachere und verschiedene Pflanzenarten. Daher kann diese Methode auf andere Pflanzenarten mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Mögliche Modifikationen zur Optimierung gehören Protoplastenkonzentration in der MMG, Inkubationszeit in MMG und PEG / Ca-Lösung. Wir entscheiden uns für 60 ug DNA in unseren Routineversuche zu verwenden, da die Zahl der Transformanten steigt linear mit der DNA-Konzentration bis zu diesem Zeitpunkt (Tabelle 1). Wir konnten etwa 7000 transiente Transformanten oder 200 stabile Transformanten auf einer einzigen 60 ug DNA-Transformation, die zur weiteren Überprüfung und Analyse einer großen Population von Pflanzen ermöglicht. Die transformierten Protoplasten können entweder verteilt mit Flüssigkeit plating Medium oder PRM-T werden. Obwohl die Regeneration Wirkungsgrad ist niedriger, wenn flüssige Beschichtung Medium verwendet wird, wählen wir diese Methode, wenn die Protoplasten mit supercoiled Plasmiden transformiert wurden. Da zeigten die in Tabelle 1, erzeugen Transformationen mit supercoiled Plasmid-DNA erfolgt viel mehr Transformanten und somit können wir immer noch erhalten eine große Anzahl von Anlagen mit flüssigen Beschichtung Medium. Darüber hinaus verbreiten Protoplasten mit flüssigen Beschichtung Medium ermöglicht eine schnellere Regeneration, was wichtig ist für Experimente, die transiente Phänotypen, wie RNAi knock down Experimenten 9,15. Neben dem Fehlen von Top-Agar ermöglicht eine einfache Anlage Trennung für Immunfärbung und RT-PCR 9,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Zutat </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1,84 mM KH 2 PO 4 3,4 mM Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2,72 mM Diammonium Tartrat 54 um FeSO 4 .7 H 2 O 9,93 uM H 3 BO 3 1,97 pM MnCl 2 .4 H 2 O 0,23 um CoCl 2 .6 H 2 O 0,19 pM ZnSO 4. 7H 2 O 0,22 &amp;mgr; M CuSO 4. 5H 2 O 0,10 um Na 2 MoO 4 .2 H 2 O 0,168 uM KI Add 0,7% Agar für festes Medium. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> PPNH 4 mit 6% Mannitol und 0,8% Agar. Fügen Sie 10 ml 1M CaCl 2 bis 1 L vor dem Gießen-Platten. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> PPNH 4 mit 6% Mannitol und 0,6% Agar. Fügen Sie 0,5 ml 1M CaCl 2 bis 50 mL vor dem Gebrauch. </td></tr><tr><td> Flüssige Mittel Plating </td><td> PPNH 4 mit 8,5% Mannit ohne Agar. Fügen Sie 0,5 ml 1M CaCl 2 bis 50 mL vor dem Gebrauch. </td></tr><tr><td> 2% Driselase </td><td> 4 g Driselase (Sigma D9515-25G) auf 200 ml 8% Mannitol. Leicht umrühren für 30 min. bei Raumtemperatur inkubieren 30 min. bei 4 ° C, und sanft rühren 5 min. bei Raumtemperatur. Spin 2.500 g für 10 min, verwerfen Pellet. Filter mit 0,22 um, und speichern Sie bis zu 10 mL Aliquots eingefroren. Tauwetter in einer Raumtemperatur Wasserbad vor dem Gebrauch. </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0,4 M Mannitol 15 mM MgCl 2 4 mM MES (pH 5,7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 g PEG4000 3 mL H 2 O 2,5 ml 0,8 M Mannit 1 mL 1 M CaCl 2 </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM NaCl 125 mM CaCl 2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7) </td></tr></tbody></table>

effiziente polyethylenglykol (peg) vermittelten transformation von der moss physcomitrella patens</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

<p class="jove_content"&gt; Eine einfache und effiziente Methode zur Umwandlung<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplasten beschrieben. Diese Methode wird von Protokollen für angepasste<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonema Protoplasten und<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Mesophyll Protoplasten-Transformation<sup&gt; 1</sup&gt;. Aufgrund seiner Fähigkeit, effiziente mitotischen unterziehen homologe Rekombination<em&gt;, Physcomitrella patens</em&gt; Hat als ein wichtiges Modellsystem in den letzten Jahren entstanden<sup&gt; 2</sup&gt;. Diese Fähigkeit erlaubt hohe Frequenzen von gene targeting<sup&gt; 3-9</sup&gt;, Die nicht in andere Modell Pflanzen wie man sieht<em&gt; Arabidopsis</em&gt;. Um den vollen Nutzen dieses Systems, brauchen wir eine effektive und einfache Methode, um DNA in Moos-Zellen liefern. Die gängigsten Methoden, um dieses Moos zu verwandeln sind Partikelbeschuss<sup&gt; 10</sup&gt; Und PEG-vermittelter DNA-Aufnahme<sup&gt; 11</sup&gt;. Obwohl Partikelbeschuss kann eine hohe Transformationseffizienz<sup&gt; 12</sup&gt; Sind Genkanonen nicht ohne weiteres verfügbar, viele Labors und das Protokoll ist schwer zu standardisieren. Auf der anderen Seite, ist PEG-vermittelte Transformation keine spezielle Ausrüstung, und kann in jedem Labor mit einem sterilen Abzug durchgeführt werden. Hier zeigen wir eine einfache und sehr effiziente Methode zur Umwandlung von Moos-Protoplasten. Diese Methode kann mehr als 120 transiente Transformanten pro Mikrogramm DNA, die eine Verbesserung der effizientesten Protokoll bereits berichtet wird<sup&gt; 13</sup&gt;. Aufgrund seiner Einfachheit, Effizienz und Reproduzierbarkeit, kann diese Methode, um Projekte, die große Zahl der Transformanten als auch für Routine-Transformation angewendet werden.</p

Eine einfache und effiziente Methode zur Umwandlung<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplasten beschrieben. Diese Methode wird von Protokollen für angepasste<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonema Protoplasten und<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Mesophyll Protoplasten-Transformation<sup&gt; 1</sup&gt;.

Effiziente Polyethylenglykol (PEG) vermittelten Transformation von der Moss Physcomitrella patens</em

Es wird eine einfache und effiziente Methode zur Transformation von Physcomitrella patens-Protoplasten beschrieben. Diese Methode ist aus Protokollen für Physcomitrella ... adaptiert.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, SCO-Metre-Protoplasten zu transformieren. Dies wird erreicht, indem die Pflanzen zunächst mit Drizly verdaut werden. Anschließend werden die Protoplasten mit Mannit gewaschen, um das Drizly zu entfernen, und danach mit DNA und PEG inkubiert.Schließlich werden die transformierten Protoplasten auf Platten ausgestrichen und inkubiert. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die transformierte Protoplasten zeigen, welche fluoreszenzmarkierte Proteine durch Fluoreszenzmikroskopie exprimieren. Die Durchführung der Methode wird Y. Lu, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie wirksam ist und zuverlässig Protoplasten erzeugt, die das Protein der Interesse exprimieren. Um Moosprotoplasten zu isolieren, geben Sie zunächst neun Milliliter 8 % Mannitol mit einem Spatel in eine Petrischale. Geben Sie fünf bis sieben Tage altes Moos von zwei bis drei PP NH vier-Platten in das Mannitol. Weitere Informationen zu diesem und zusätzlichen Reagenzrezepturen finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Fügen Sie danach drei Milliliter 2 % Drizly hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.Filtrieren Sie die Mischung durch ein 100-Mikron-Sieb, um eine grüne homogene Suspension zu erhalten. Zentrifugieren Sie dann das Filtrat bei 250 ×g fünf Minuten lang. Entsorgen Sie das Überstandvolumen dabei sehr vorsichtig.Suspendieren Sie die Protoplasten in 500 Mikrolitern 8%igem Mannitol. Geben Sie anschließend weitere 9,5 Milliliter 8%iges Mannitol hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Protoplasten vollständig suspendiert sind.Führen Sie die Waschschritte noch zweimal durch, indem Sie die Lösung erneut bei 250 G fünf Minuten lang zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Protoplasten zunächst in 500 Mikrolitern.Dann 9,5 Milliliter 8 % Mannit mit einem Hämocytometer. Zählen Sie die Anzahl der Protoplasten in 10 Mikroliter der Suspension, um DNA in die isolierten Protoplasten einzubringen. Zentrifugieren Sie zunächst die Protoplastenmischung bei 250 ×g für fünf Minuten.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Protoplasten in MMG-Lösung mit einer Dichte von 1,6 Millionen pro Milliliter. Inkubieren Sie die Suspension 20 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie danach 600 Mikroliter der Protoplastenlösung in ein Kulturgefäß, das 60 Mikrogramm DNA enthält. Schütteln Sie vorsichtig.Geben Sie vorsichtig 700 Mikroliter PEG-Calciumlösung hinzu und schütteln Sie. Inkubieren Sie die Probe während dieser Wartezeit gründlich 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bedecken Sie die PRMB-Platten mit Cellophan. Anschließend die Suspension mit drei Millilitern W5-Lösung verdünnen und fünf Minuten bei 250 ×g zentrifugieren. Um das PEG zu entfernen, die Protoplasten in zwei Millilitern PRMT resuspendieren und je ein Milliliter pro PRMB-Platte, die mit Zellophan bedeckt ist, auftragen. Die Platten bei 25 Grad Celsius in einer Wachstumskammer aufbewahren.Schließlich die Zellulosemembran vier Tage nach der Transformation auf frische Selektionsplatten überführen. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für 18 Tage alte Pflanzen, die aus Protoplasten regeneriert wurden und mit 15 Mikrogramm supercoiled Plasmid-DNA transformiert wurden, die ein Hygromycin-Resistenzkassette trägt. Hier wurden 30 Mikrogramm desselben supercoiled Plasmids in Protoplasten transformiert.60 Mikrogramm Plaid-DNA wurden in dieser Probe transformiert. Und schließlich wurden diese Pflanzen aus Protoplasten regeneriert, die mit 120 Mikrogramm derselben supercoiled Plasmid-DNA, die die Hygromycin-Resistenzkassette trägt, transformiert wurden. Die Transformations-Effizienz wird durch DNA-Konzentrationen von bis zu 60 Mikrogramm nicht beeinträchtigt.Allerdings sind höhere DNA-Konzentrationen für dieses Verfahren nachteilig. Die Daten zeigen, dass diese Methode über einen weiten Bereich an DNA-Mengen hinweg konsistente Ergebnisse liefert Einmal pro Semester. Diese Technik kann innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Mit dieser Methode können zusätzliche Verfahren wie transiente RNAi und Gen-Knockouts durchgeführt werden, um weitere Fragen zur Genfunktion zu beantworten.

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