NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Das NanoDrop-Sample-Rückhaltesystem ist eine innovative Technologie, die die inhärente Oberflächenspannung von Flüssigkeiten nutzt, um Mikrovolumenproben zwischen zwei optischen Sockeln ohne Verwendung von QTS oder Kapillaren zu halten und zu messen. Schon ein Mikroliter Probe wird direkt auf die untere optische Oberfläche pipettiert. Beim Schließen des Spektrometerarms bildet sich eine Flüssigkeitssäule zwischen den oberen und unteren optischen Sockeln.

Aufgrund der Oberflächenspannung bildet sich ein vertikaler optischer Weg, dessen Länge sich während der Messung automatisch in Echtzeit ändern kann. Die Verkürzung der Weglänge ermöglicht die Messung höherer Konzentrationen und macht Verdünnungen bei den meisten Nukleinsäureproben effektiv überflüssig. Außerdem beschleunigt das Probeneinbehaltungssystem den experimentellen Ablauf durch eine schnelle Reinigung, die einfach im Abwischen der optischen Oberflächen mit einem Laborabwisch erfolgt.

Heute werden wir zwei Verfahren zur Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration mithilfe von Mikroliter-Messgeräten von Thermo Scientific demonstrieren. Das erste Protokoll ist eine direkte Nukleinsäuremessung mit dem NanoDrop 2000 C Spektrophotometer. Das zweite Protokoll ist eine indirekte fluorimetrische Nukleinsäuremessung mit dem NanoDrop 3300 Fluorospektrometer.

Zur Vorbereitung reinigen Sie die oberen und unteren optischen Oberflächen des Mikrovolumen-Spektrophotometer-Probenhalters, indem Sie zwei bis drei Mikroliter gereinigtes deionisiertes Wasser auf die untere optische Oberfläche pipettieren. Schließen Sie den Hebelarm, wobei sichergestellt werden muss, dass der obere Sockel mit dem deionisierten Wasser in Kontakt kommt. Heben Sie den Hebelarm an und wischen Sie beide optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Laborabwischmittel ab.

Als Nächstes öffnen Sie die NanoDrop-Software und wählen die Nukleinsäureanwendung aus. Führen Sie mit einer kalibrierten Mikroliterspipette eine Blindmessung durch, indem Sie einen Mikroliter Puffer auf die untere optische Oberfläche auftragen. Senken Sie den Hebelarm ab und wählen Sie in der Nukleinsäureanwendung „Blank“ aus.

Nach Abschluss der Leermessung beide optischen Oberflächen mit einem Laborabwisch reinigen. Wie zuvor wählen Sie die geeignete Konstante für die zu messende Probe aus. Geben Sie anschließend einen Mikroliter Nukleinsäureprobe auf das untere optische Sockelstück und schließen Sie den Hebelarm.

Da die Messung volumenunabhängig ist, muss die Probe lediglich die Lücke zwischen den beiden optischen Oberflächen überbrücken. Um eine Messung durchzuführen, wählen Sie in der Anwendungssoftware „Messen“ aus; die Software berechnet automatisch die Nukleinsäurekonzentration und die Reinheitsverhältnisse. Überprüfen Sie nach der Probenmessung die spektrale Ausgabe. Eine typische Nukleinsäureprobe weist ein sehr charakteristisches Profil auf.

Spektrale Hinweise auf eine minderwertige Probe umfassen Wellenlängenabschnitte im Tal und im 260-Nanometer-Peak. Zu den häufigen Quellen von Kontaminationen, die mit bestimmten Nukleinsäure-Isolationsverfahren verbunden sind, gehören Phenol, Triol und die Säulenchromatographie. Im Fall der Phenol-Triol-Extraktion kann eine verbleibende Reagenzkontamination durch abnormale Spektren zwischen 220 und 240 Nanometern sowie durch Verschiebungen im Bereich von 260 bis 280 Nanometern angezeigt werden.

Umgekehrt kann verbliebene Guanin aus der Säulenextraktion zu einem Peak nahe 230 Nanometer und einer Verschiebung des Tals von 230 Nanometer auf etwa 240 Nanometer beitragen. Zur genauen Beurteilung der Probereinheit sollten das 260/280- und das 260/230-Verhältnis in Kombination mit der gesamten spektralen Qualität analysiert werden. Reine Nukleinsäuren liefern typischerweise ein 260/280-Verhältnis von etwa 1,8 für DNA bzw. etwa 2,0 für RNA.

Dieses Verhältnis hängt vom pH-Wert und der Ionenstärke des Puffers ab, der für die Leer- und Probenmessungen verwendet wird. Das Banana Drop 3,300-Fluorospektrometer verwendet dasselbe patentierte Mikrovolumen-Probenrückhaltesystem wie das NanoDrop 2000 C-Spektrophotometer. Da Fluoreszenzmessungen mit lediglich einem Mikroliter Probe durchgeführt werden können, wählt der Anwender eine von drei LEDs als Anregungsquelle, die horizontal auf die Probe feuert.

Die nachfolgende Fluoreszenz der Probe wird dann in einem Winkel von 90 Grad vertikal in ein internes Spektrometer gesammelt. Um die hochsensitive Mikrovolumen-Quantifizierung von Nukleinsäuren mithilfe des NanoDrop 3300 zu demonstrieren, wird ein Pico-Green-Fluoreszenzkit verwendet, mit dem zunächst die Kit-Standards und alle Nukleinsäureproben auf Raumtemperatur gebracht werden. Fluoreszierende Proben sind lichtempfindlich und sollten in braunen oder mit Aluminiumfolie umwickelten Röhrchen aufbewahrt werden.

Bereiten Sie ausreichend 1x XTE-Puffer für alle zu messenden Standards und Proben sowie für die benötigte Pico-Green-Arbeitslösung vor. Stellen Sie den 1x XTE-Puffer her, indem Sie den beigefügten 20x XTE-Puffer gemäß Herstellervorschrift mit kernfreiem Wasser verdünnen. Die Reaktionsvolumina können zwischen 200 Mikrolitern und lediglich 10 Mikrolitern liegen.

In diesem Beispiel werden wir Reaktionsvolumina von 10 Mikrolitern vorbereiten. Bereiten Sie anschließend seriell verdünnte Doppelstrang-DNA-Standards sowie nukleasefreie Vials oder Röhrchen vor, um den erwarteten Konzentrationsbereich der unbekannten DNA-Proben abzudecken.

Übertragen Sie fünf Mikroliter jedes verdünnten doppelsträngigen DNA-Standards in jeweils ein separat beschriftetes, nukleasefreies braunes oder mit Aluminiumfolie abgedecktes Röhrchen. Anschließend entnehmen Sie fünf Mikroliter jeder doppelsträngigen DNA-Probe von Interesse und geben sie in das entsprechend vor Licht geschützte Röhrchen. Nach der Herstellung der Pico-Green-Arbeitslösung gemäß Herstellervorschrift pipettieren Sie ein gleiches Volumen der Lösung – in diesem Fall fünf Mikroliter – zu jedem Röhrchen, das entweder einen doppelsträngigen DNA-Standard oder eine doppelsträngige DNA-Probe enthält.

Vermischen Sie gleiche Volumina eines XTE-Puffers und der Pico-Green-Arbeitslösung. Um die negative Kontrolle vorzubereiten, die als Referenzlösung dient, mischen Sie den Inhalt jedes Röhrchens durch vorsichtiges Pipettieren gründlich und lassen Sie die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Alle Standards und Proben sollten vor der Messung auf die gleiche Temperatur gebracht werden, da das fluoreszente Signal von der Temperatur beeinflusst wird. Um das Gerät vorzubereiten und Messungen durchzuführen, reinigen Sie zunächst die untere und obere Fläche des Probeneinhaltesystems, pipettieren Sie zwei bis drei Mikroliter entionisiertes Wasser auf die untere optische Fläche in der Nähe. Öffnen Sie dann den Hebelarm und tupfen Sie die oberen und unteren Sockel mit einem sauberen, fusselfreien Laborabwischmittel ab.

Stellen Sie sicher, dass die Oberflächen frei von Flusen sind, bevor Sie fortfahren, da Flusen bei Anwesenheit einer Anregungsquelle Fluoreszenz zeigen und die Messung stören können. Öffnen Sie die Instrumentensoftware.

Wählen Sie die Nukleinsäureanwendung aus und wählen Sie die Pico-Green-Doppelstrang-DNA-Option. Pipettieren Sie zwei Mikroliter eines XTE auf das untere Podest. Schließen Sie den Hebelarm und wählen Sie „Leerwert“ im Softwarefeld des Geräts. Sobald die Leerwertmessung abgeschlossen ist, tupfen Sie die Leerwertlösung von beiden Oberflächen des Probenaufbewahrungssystems ab.

Mischen Sie anschließend die Referenzlösung vorsichtig durch Pipettieren unter Verwendung von Low-Retention-Spitzen. Pipettieren Sie zwei Mikroliter der Referenzlösung auf das untere Podest und schließen Sie den Hebelarm. Wählen Sie unter der Registerkarte „Standards“ die Referenz aus und stellen Sie die gewünschten Einheiten ein.

Klicken Sie auf „Messen“, um den Messzyklus zu starten. Nach Abschluss des Messzyklus öffnen Sie den Hebelarm und tupfen die Oberflächen des Probenträgers gründlich ab. Führen Sie bis zu fünf Wiederholungen der Referenzmessung durch, wobei für jede Wiederholung ein neues Eloqua verwendet wird.

Wiederholen Sie den Vorgang für die zusätzlichen Standards, um eine Standardkurve aufzubauen. Bis zu sieben Standards können verwendet werden. Die Software ist so konzipiert, dass sie bis zu fünf Wiederholungen für jeden Standard speichern kann.

Die Wiederholungen der Standards werden gemittelt, um eine Standardkurve zu erstellen, anhand derer die Probenkonzentrationen automatisch bestimmt werden. Sobald die Standardkurve vollständig ist, wählen Sie den Reiter „Proben“ aus, geben Sie die entsprechenden Proben-ID-Informationen ein und messen Sie jede unbekannte Probe. Eine gültige Kurve zeigt an, dass die Mindestanzahl an Standards erreicht wurde.

Die DNA-Konzentration basiert automatisch auf der Standardkurve. Mit der NanoDrop-Mikroliter-Technologie kann die Nukleinsäurekonzentration entweder durch direkte A260-Messungen oder indirekte fluorometrische Methoden bestimmt werden. Mit NanoDrop-Spektrophotometern kann auch die Proteinkonzentration durch direkte A280-Absorption oder durch proteinfarbmetrische Assays quantifiziert werden.