Name: NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Mikrovolumen-Quantifizierung von Nukleinsäuren mit NanoDrop-Spektrometern. Diese Methode ermöglicht präzise Konzentrationsbestimmungen mit nur einem Mikroliter Probe ohne Verdünnung.

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Richard W. Beringer und David L. Ash, Applications Wissenschaftler, Thermo Scientific NanoDrop Produkte, für die technische Unterstützung und Filmen.

1. Mikrovolumen Nucleic Acid Quantifizierung Mit einem NanoDrop 2000c Spektrophotometer <ol><li> Um zu beginnen, reinigen Sie den oberen und unteren optischen Oberflächen der Mikrovolumens Spektralphotometer Probe Rückhaltesystem durch Pipettieren von 2 bis 3 ul von sauberem VE-Wasser auf die untere optische Oberfläche. </li><li> Schließen Sie den Hebelarm, sicherzustellen, dass die obere Podest in Kontakt mit dem VE-Wasser kommt. Heben Sie den Hebelarm und wischen Sie die beiden optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. </li><li> Öffnen Sie die NanoDrop Software und wählen Sie die Nukleinsäure-Anwendung. Verwenden Sie einen kleinvolumigen, kalibrierte Pipette, um eine leere Messung durch den Verzicht auf 1 ul des Puffers auf die untere optische Oberfläche durchzuführen. Senken Sie den Hebel, und wählen Sie "Blank" in der Nukleinsäure-Anwendung. </li><li> Sobald die Blank-Messung abgeschlossen ist, reinigen Sie beide optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. </li><li> Wählen Sie die entsprechende Konstante für die Probe, die gemessen werden soll. <table border="1"><tbody><tr><td> Sample Type </td><td> Wählen Sie die Option </td><td> Konstante, mit der Konzentration berechnen </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Brauch </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Typische Nukleinsäure Konzentrationsbereiche für direkte A280 Absorptionsmessungen mit einem NanoDrop Mikrovolumens Spektralphotometer, einem traditionellen Küvette-based-Spektralphotometer mit einem TrayCell Mikrozelle Küvette verwendet, und ein Mikrovolumens NanoDrop fluorospectrometer in Verbindung mit dem PicoGreen Assay. </li><li> Dispense 1 ul der Nukleinsäure-Probe auf die geringere optische Sockel und schließen Sie den Hebelarm. Da die Messung Volumen unabhängig, die Probe muss nur die Kluft zwischen den beiden optischen Oberflächen für eine Messung vorgenommen werden überbrücken. </li><li> Wählen Sie "Messen" in der Anwendungssoftware. Die Software berechnet automatisch die Nukleinsäure-Konzentration und Reinheit Verhältnisse. Nach Probenmessung, überprüfen Sie die spektrale Leistung. </li><li> Die Software berechnet automatisch die Nukleinsäure-Konzentration und Reinheit Verhältnisse. Nach Probenmessung, überprüfen Sie die spektrale Bild auf Probe Qualität zu beurteilen. </li><li> Ein typisches Nukleinsäureprobe haben ein sehr charakteristisches Profil. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein typisches Nukleinsäureprobe haben ein sehr charakteristisches Profil. </li><li> Häufige Quellen von Verunreinigungen mit spezifischen Nukleinsäure-Isolierung-Verfahren sind die Phenol / Trizol und Spalte Extraktion. Im Falle von Phenol / Trizol-Extraktion, können Rest-Reagenz Kontamination durch abnorme Spektren zwischen 220 bis 240 nm sowie durch Verschiebungen in der 260-280 nm-Bereich angegeben werden. Umgekehrt kann Rest-Guanidin aus Spalte Extraktion auf einen Spitzenwert in der Nähe 230 nm und eine Verschiebung in den Trog von 230 nm bis etwa 240 nm beitragen. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die Verschiebungen in den Höhen und Tiefen der Proben B und C im Vergleich zu Probe A zeigen, wie Verunreinigungen können die Spektren von Nukleinsäure-Proben beeinflussen. </li><li> Um genau zu beurteilen Probe Qualität, sollte 260/280 oder 260/230 Verhältnisse in Verbindung mit der tonalen Qualität analysiert werden. Reine Nukleinsäuren typischerweise ergeben eine 260/280 Ratio von etwa 1,8 und einem 260/280 Ratio von ~ 2,0 für DNA und RNA, bzw.. Dieses Verhältnis ist abhängig vom pH-Wert und Ionenstärke des Puffers verwendet, um den Leerwert und Probe-Messungen zu machen. Saure Lösungen werden unter-stellen das Verhältnis um 0,2-0,3, während einer basischen Lösung wird über-stellen das Verhältnis um 0,2-0,3. Signifikant verschieden Reinheit Verhältnisse können auf das Vorhandensein von Protein-, Phenol-oder andere Verunreinigungen, die stark absorbieren bei oder nahe bei 280 nm. Die 260/230 Reinheit Verhältnis ist eine zweite Maßnahme der DNA-Reinheit mit den Werten für eine "reine" Nukleinsäure üblicherweise im Bereich von 1,8-2,2. Purity-Verhältnisse, die deutlich niedriger als die erwarteten Werte sind möglicherweise für die Isolierung verwendete Technik kann weiter optimiert werden müssen. </li><li> NanoDrop Spektralphotometer kann auch verwendet werden, um Proteine ​​durch direkte Absorption oder durch Protein kolorimetrischen Assays quantifizieren. Um eine ordnungsgemäße Spalte Bildung und Reproduzierbarkeit, sind 2-ul-Proben für Protein-Proben empfohlen. Beachten Sie die folgenden JoVE Video: Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung Mit dem NanoDrop Spektralphotometer <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Um zu demonstrieren, mit hoher Empfindlichkeit Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung mit dem NanoDrop 3300, ist ein PicoGreen Fluoreszenz-Kit verwendet. Um zu beginnen, äquilibrieren dem Kit-Standards und aller Nukleinsäure-Proben auf Raumtemperatur. Fluoreszierende Proben sind lichtempfindlich und sollte in Bernstein oder Aluminium verpackt Röhren gehalten werden. </li><li> Bereiten Sie genug 1x TE-Puffer für alle Standards und Proben sowie für die PicoGreen funktionierende Lösung, die benötigt werden, gemessen werden. Bereiten 1xTE Puffer durch Verdünnen der bereitgestellten 20x TE-Puffer mit Nuklease-freiem Wasser pro Protokoll des Herstellers. Reaction Volumes können aus 200 ul, so wenig wie 10 ul-Bereich. In diesem Beispiel werden 10 ul Reaktionsvolumen vorbereitet werden. </li><li> Bereiten seriell verdünnt dsDNA-Standards bei 2x die endgültige gewünschte Konzentration in Nuklease-freies Fläschchen oder Tuben. Transfer-5 ul der verdünnten dsDNA-Standards in einen einzelnen markierten Nuklease-freies Bernstein oder Folie abgedeckten Röhre. </li><li> Aliquot 5 ul jeder dsDNA Probe von Interesse in entsprechend gekennzeichneten Nuklease-freies Bernstein oder Folie abgedeckten Rohre. </li><li> Bereiten PicoGreen funktionierende Lösung nach dem Protokoll des Herstellers. Übertragung der gleichen Menge des PicoGreen funktionierende Lösung in jedes Röhrchen, die entweder eine Standard-oder Probe von Interesse (5 ul in diesem Beispiel). </li><li> Die gleiche Menge 1x TE-Puffer und PicoGreen funktionierende Lösung, die negative Kontrolle, die als Referenz-Lösung dient vorzubereiten. </li><li> Mischen Sie die Inhalte der einzelnen Reaktionsgefäß durch leichtes Pipettieren und inkubieren Sie die Reaktionen bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Alle Standards und Proben sollten äquilibriert auf die gleiche Temperatur vor der Messung der Fluoreszenz-Signal von der Temperatur beeinflusst wird. </li><li> Zur Vorbereitung der Instrumente und Messungen durchführen, zuerst reinigen Sie den unteren und oberen Flächen der Probe Rückhaltesystem. Pipettieren von 2 bis 3 ul entionisiertem Wasser auf die untere optische Oberfläche, in der Nähe öffnen Sie dann den Hebelarm, und tupfen Sie den oberen und unteren Sockel mit einem sauberen, fusselfreien, wischen Labor. Sicherstellen, dass die Oberflächen sind frei von Flusen, bevor Sie fortfahren wie Flusen weisen in Gegenwart von einer Anregungsquelle Fluoreszenz und kann die Messung stören. </li><li> Öffnen Sie den Geräte-Software, wählen Sie die "Nukleinsäuren" Anwendung, und wählen Sie die "PicoGreen-dsDNA"-Option. </li><li> Um leere das Instrument, fügen Sie 2 &amp;mgr; l 1x TE auf den unteren Sockel, in der Nähe der Arm, und wählen Sie "Blank" in das Instrument Software-Bereich. Einmal leer abgeschlossen ist, abtupfen der Blindprobelösung von beiden Oberflächen der Probe Rückhaltesystem. </li><li> Mix der Referenz-Lösung durch vorsichtiges Pipettieren. Mit geringer Retention, Pipette 2 ul auf den unteren Sockel und schließen Sie den Arm. </li><li> Wählen Sie "Referenz" in die Messung ein, und wählen Sie die gewünschten Einheiten. Klicken Sie auf "Messen" der Messzyklus zu initiieren. </li><li> Wenn der Messzyklus abgeschlossen ist, öffnen Sie den Arm und gründlich abtupfen der Probe Rückhaltesystem Oberflächen. Distanzen bis zu fünf Wiederholungen der Referenz, mit einem frischen Aliquot für jede Wiederholung. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die weiteren Standards, um eine Standardkurve zu erstellen. Bis zu sieben Standards verwendet werden. Die Software wurde entwickelt, um bis zu fünf Wiederholungen für jede Norm. Repliziert der Standards werden gemittelt, um eine Standardkurve aus dem die Probe Konzentrationen automatisch ermittelt werden zu generieren. </li><li> Sobald der Standard-Kurve abgeschlossen ist, wählen Sie die "Samples" Registerkarte, geben Sie die jeweilige Probe-ID-Informationen und messen jede unbekannte Probe. </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

Philippe Desjardins und Debra Conklin von Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc, dass die Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Die Quantifizierung Protokolle hier präsentiert werden, auf die am meisten akzeptierte Mikrovolumens Systemen. Derartige Systeme bieten eine praktische Alternative für traditionelle Nukleinsäure Quantifizierung Methodik, die auf größere Probenvolumina und den Einsatz von Containment-Apparat angewiesen. NanoDrop Mikrovolumens Technologie verwendet eine Probe Rückhaltesystem, das auf die Oberflächenspannung Eigenschaften der Probe gemessen, um eine Flüssigkeitssäule Form setzt. Es ist wichtig, dass die Probe Kontakt mit dem oberen und unteren optische Messung Flächen für die richtige Spalte Bildung. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt die Messergebnisse ungenau oder nicht reproduzierbar scheint, ist es sehr wahrscheinlich das Ergebnis der Probe Heterogenität oder Flüssigkeitssäule Bruch. Wasch-und Isopropylalkohol werden nicht empfohlen, Reinigungsmittel, da sie das Podest Messflächen kann bedingungslos. Eine unbedingte Podest tritt auf, wenn die hydrophobe Oberfläche Eigenschaften des Sockels kompromittiert wurden, was zu einer Abflachung der Probe Tropfen. Unconditioned Sockel kann zum Bruch der Flüssigkeitssäule während der Messung führen. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Unconditioned Oberfläche wird durch eine Abflachung eines Wassertropfens aus. Uncondtioned Sockel Oberflächen können überholt mit NanoDrop Pedestal Überholung Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products) werden. Eine dünne Schicht der Wiederaufbereitung Verbindung der oberen und unteren Sockel Oberflächen, dürfen für ~ 30 Sekunden trocken angewendet wird, dann abgerieben mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. Ein erfolgreich überholt Zustand wird durch einen Wassertropfen Sicken auf, wenn auf den Boden Sockel Oberfläche aufgebracht wird. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Ein erneuerter Oberfläche wird durch eine Sicke bis eines Wassertropfens aus. Mikrovolumen Quantifizierung Systemen erheblich reduzieren Probe Verbrauch und einem dramatischen Anstieg der Konzentrationsbereich, wenn zu traditionellen Quantifizierung Systeme verglichen. Obwohl Mikrovolumens Quantifizierung ist oft eine grundlegende Technologie für bestimmte Umstände wie begrenzt Zellmasse wie Nadel-Biopsien und Laser-Mikrodissektion, die Effizienz und Einfachheit der Anwendung dieser Methode hat es eine weithin akzeptierte Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methoden werden auch wenn Probe ist reichlich.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop mikrovolumen quantifizierung von nukleinsäuren

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolekulare Analysen werden kontinuierlich weiterentwickelt, dass die Verwendung immer kleiner Mengen von Material, oft entgegensteht, die Verwendung von konventionellen Küvette Instrumente für Nukleinsäure-Quantifizierung für diejenigen, die Mikrovolumens Quantifizierung durchführen können. Die NanoDrop Mikrovolumens Probenretention System (Thermo Scientific NanoDrop Products)-Funktionen durch die Kombination von LWL-Technik und natürliche Oberflächenspannung Eigenschaften zu erfassen und zu behalten winzige Mengen der Probe unabhängig von traditionellen Containment Geräte wie Küvetten oder Kapillaren. Darüber hinaus verwendet das System kürzere Weglängen, die sich in einer breiten Palette von Nukleinsäure-Konzentration Messungen im Wesentlichen entfällt die Notwendigkeit, Verdünnungen durchzuführen. Verringerung des Volumens der Probe für die spektroskopische Analyse erforderlich erleichtert auch die Aufnahme von zusätzlichen Qualitätskontrolle Schritten über viele molekulare Abläufe, Steigerung der Effizienz und letztlich zu mehr Vertrauen in nachgelagerten Ergebnisse. Die Notwendigkeit hoher Empfindlichkeit fluoreszierender Analyse der begrenzten Masse hat auch mit den jüngsten experimentellen Fortschritte hervor. Mit der gleichen Mikrovolumens Probenretention Technologie kann Fluoreszenz-Messungen mit 2 ul des Materials durchgeführt werden, so dass Fluoreszenzassays Volumen Anforderungen deutlich reduziert werden. Solche Mikroreaktionen von 10 ul oder weniger sind jetzt möglich mit einem dedizierten Mikrovolumens fluorospectrometer. Zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokolle zeigten, dass die Verwendung integrierter Probe Rückhaltesysteme als praktische Alternative zu herkömmlichen Küvetten-basierte Protokolle werden. Zunächst wird eine direkte A260 Absorption unter Verwendung eines Mikrovolumens Spektralphotometer beschrieben. Dies wird durch eine Demonstration eines Fluoreszenz-basierten Verfahren, das mit reduziertem Volumen Fluoreszenz Reaktionen ermöglicht mit einem Mikrovolumens fluorospectrometer gefolgt. Diese neuen Techniken ermöglichen die Beurteilung von Nukleinsäure-Konzentrationen von 1 pg / ul bis 15.000 ng / ul mit minimalem Verbrauch der Probe.

Die Verwendung von NanoDrop Mikrovolumens Systeme als praktische und effiziente Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methodik ist durch die Demonstration von zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokollen beschrieben.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Es werden kontinuierlich biomolekulare Assays entwickelt, die zunehmend geringere Materialmengen verwenden, was häufig den Einsatz konventioneller ...

Das NanoDrop-Sample-Rückhaltesystem ist eine innovative Technologie, die die inhärente Oberflächenspannung von Flüssigkeiten nutzt, um Mikrovolumenproben zwischen zwei optischen Sockeln ohne Verwendung von QTS oder Kapillaren zu halten und zu messen. Schon ein Mikroliter Probe wird direkt auf die untere optische Oberfläche pipettiert. Beim Schließen des Spektrometerarms bildet sich eine Flüssigkeitssäule zwischen den oberen und unteren optischen Sockeln. Aufgrund der Oberflächenspannung bildet sich ein vertikaler optischer Weg, dessen Länge sich während der Messung automatisch in Echtzeit ändern kann. Die Verkürzung der Weglänge ermöglicht die Messung höherer Konzentrationen und macht Verdünnungen bei den meisten Nukleinsäureproben effektiv überflüssig. Außerdem beschleunigt das Probeneinbehaltungssystem den experimentellen Ablauf durch eine schnelle Reinigung, die einfach im Abwischen der optischen Oberflächen mit einem Laborabwisch erfolgt.Heute werden wir zwei Verfahren zur Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration mithilfe von Mikroliter-Messgeräten von Thermo Scientific demonstrieren. Das erste Protokoll ist eine direkte Nukleinsäuremessung mit dem NanoDrop 2000 C Spektrophotometer. Das zweite Protokoll ist eine indirekte fluorimetrische Nukleinsäuremessung mit dem NanoDrop 3300 Fluorospektrometer.Zur Vorbereitung reinigen Sie die oberen und unteren optischen Oberflächen des Mikrovolumen-Spektrophotometer-Probenhalters, indem Sie zwei bis drei Mikroliter gereinigtes deionisiertes Wasser auf die untere optische Oberfläche pipettieren. Schließen Sie den Hebelarm, wobei sichergestellt werden muss, dass der obere Sockel mit dem deionisierten Wasser in Kontakt kommt. Heben Sie den Hebelarm an und wischen Sie beide optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Laborabwischmittel ab.Als Nächstes öffnen Sie die NanoDrop-Software und wählen die Nukleinsäureanwendung aus. Führen Sie mit einer kalibrierten Mikroliterspipette eine Blindmessung durch, indem Sie einen Mikroliter Puffer auf die untere optische Oberfläche auftragen. Senken Sie den Hebelarm ab und wählen Sie in der Nukleinsäureanwendung „Blank“ aus.Nach Abschluss der Leermessung beide optischen Oberflächen mit einem Laborabwisch reinigen. Wie zuvor wählen Sie die geeignete Konstante für die zu messende Probe aus. Geben Sie anschließend einen Mikroliter Nukleinsäureprobe auf das untere optische Sockelstück und schließen Sie den Hebelarm.Da die Messung volumenunabhängig ist, muss die Probe lediglich die Lücke zwischen den beiden optischen Oberflächen überbrücken. Um eine Messung durchzuführen, wählen Sie in der Anwendungssoftware „Messen“ aus; die Software berechnet automatisch die Nukleinsäurekonzentration und die Reinheitsverhältnisse. Überprüfen Sie nach der Probenmessung die spektrale Ausgabe. Eine typische Nukleinsäureprobe weist ein sehr charakteristisches Profil auf.Spektrale Hinweise auf eine minderwertige Probe umfassen Wellenlängenabschnitte im Tal und im 260-Nanometer-Peak. Zu den häufigen Quellen von Kontaminationen, die mit bestimmten Nukleinsäure-Isolationsverfahren verbunden sind, gehören Phenol, Triol und die Säulenchromatographie. Im Fall der Phenol-Triol-Extraktion kann eine verbleibende Reagenzkontamination durch abnormale Spektren zwischen 220 und 240 Nanometern sowie durch Verschiebungen im Bereich von 260 bis 280 Nanometern angezeigt werden.Umgekehrt kann verbliebene Guanin aus der Säulenextraktion zu einem Peak nahe 230 Nanometer und einer Verschiebung des Tals von 230 Nanometer auf etwa 240 Nanometer beitragen. Zur genauen Beurteilung der Probereinheit sollten das 260/280- und das 260/230-Verhältnis in Kombination mit der gesamten spektralen Qualität analysiert werden. Reine Nukleinsäuren liefern typischerweise ein 260/280-Verhältnis von etwa 1,8 für DNA bzw. etwa 2,0 für RNA.Dieses Verhältnis hängt vom pH-Wert und der Ionenstärke des Puffers ab, der für die Leer- und Probenmessungen verwendet wird. Das Banana Drop 3,300-Fluorospektrometer verwendet dasselbe patentierte Mikrovolumen-Probenr&uuml;ckhaltesystem wie das NanoDrop 2000 C-Spektrophotometer. Da Fluoreszenzmessungen mit lediglich einem Mikroliter Probe durchgef&uuml;hrt werden k&ouml;nnen, w&auml;hlt der Anwender eine von drei LEDs als Anregungsquelle, die horizontal auf die Probe feuert.Die nachfolgende Fluoreszenz der Probe wird dann in einem Winkel von 90 Grad vertikal in ein internes Spektrometer gesammelt. Um die hochsensitive Mikrovolumen-Quantifizierung von Nukleinsäuren mithilfe des NanoDrop 3300 zu demonstrieren, wird ein Pico-Green-Fluoreszenzkit verwendet, mit dem zunächst die Kit-Standards und alle Nukleinsäureproben auf Raumtemperatur gebracht werden. Fluoreszierende Proben sind lichtempfindlich und sollten in braunen oder mit Aluminiumfolie umwickelten Röhrchen aufbewahrt werden.Bereiten Sie ausreichend 1x XTE-Puffer für alle zu messenden Standards und Proben sowie für die benötigte Pico-Green-Arbeitslösung vor. Stellen Sie den 1x XTE-Puffer her, indem Sie den beigefügten 20x XTE-Puffer gemäß Herstellervorschrift mit kernfreiem Wasser verdünnen. Die Reaktionsvolumina können zwischen 200 Mikrolitern und lediglich 10 Mikrolitern liegen.In diesem Beispiel werden wir Reaktionsvolumina von 10 Mikrolitern vorbereiten. Bereiten Sie anschließend seriell verdünnte Doppelstrang-DNA-Standards sowie nukleasefreie Vials oder Röhrchen vor, um den erwarteten Konzentrationsbereich der unbekannten DNA-Proben abzudecken.Übertragen Sie fünf Mikroliter jedes verdünnten doppelsträngigen DNA-Standards in jeweils ein separat beschriftetes, nukleasefreies braunes oder mit Aluminiumfolie abgedecktes Röhrchen. Anschließend entnehmen Sie fünf Mikroliter jeder doppelsträngigen DNA-Probe von Interesse und geben sie in das entsprechend vor Licht geschützte Röhrchen. Nach der Herstellung der Pico-Green-Arbeitslösung gemäß Herstellervorschrift pipettieren Sie ein gleiches Volumen der Lösung – in diesem Fall fünf Mikroliter – zu jedem Röhrchen, das entweder einen doppelsträngigen DNA-Standard oder eine doppelsträngige DNA-Probe enthält.Vermischen Sie gleiche Volumina eines XTE-Puffers und der Pico-Green-Arbeitslösung. Um die negative Kontrolle vorzubereiten, die als Referenzlösung dient, mischen Sie den Inhalt jedes Röhrchens durch vorsichtiges Pipettieren gründlich und lassen Sie die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Alle Standards und Proben sollten vor der Messung auf die gleiche Temperatur gebracht werden, da das fluoreszente Signal von der Temperatur beeinflusst wird. Um das Gerät vorzubereiten und Messungen durchzuführen, reinigen Sie zunächst die untere und obere Fläche des Probeneinhaltesystems, pipettieren Sie zwei bis drei Mikroliter entionisiertes Wasser auf die untere optische Fläche in der Nähe. Öffnen Sie dann den Hebelarm und tupfen Sie die oberen und unteren Sockel mit einem sauberen, fusselfreien Laborabwischmittel ab.Stellen Sie sicher, dass die Oberflächen frei von Flusen sind, bevor Sie fortfahren, da Flusen bei Anwesenheit einer Anregungsquelle Fluoreszenz zeigen und die Messung stören können. Öffnen Sie die Instrumentensoftware.Wählen Sie die Nukleinsäureanwendung aus und wählen Sie die Pico-Green-Doppelstrang-DNA-Option. Pipettieren Sie zwei Mikroliter eines XTE auf das untere Podest. Schließen Sie den Hebelarm und wählen Sie „Leerwert“ im Softwarefeld des Geräts. Sobald die Leerwertmessung abgeschlossen ist, tupfen Sie die Leerwertlösung von beiden Oberflächen des Probenaufbewahrungssystems ab.Mischen Sie anschließend die Referenzlösung vorsichtig durch Pipettieren unter Verwendung von Low-Retention-Spitzen. Pipettieren Sie zwei Mikroliter der Referenzlösung auf das untere Podest und schließen Sie den Hebelarm. Wählen Sie unter der Registerkarte „Standards“ die Referenz aus und stellen Sie die gewünschten Einheiten ein.Klicken Sie auf „Messen“, um den Messzyklus zu starten. Nach Abschluss des Messzyklus öffnen Sie den Hebelarm und tupfen die Oberflächen des Probenträgers gründlich ab. Führen Sie bis zu fünf Wiederholungen der Referenzmessung durch, wobei für jede Wiederholung ein neues Eloqua verwendet wird.Wiederholen Sie den Vorgang für die zusätzlichen Standards, um eine Standardkurve aufzubauen. Bis zu sieben Standards können verwendet werden. Die Software ist so konzipiert, dass sie bis zu fünf Wiederholungen für jeden Standard speichern kann.Die Wiederholungen der Standards werden gemittelt, um eine Standardkurve zu erstellen, anhand derer die Probenkonzentrationen automatisch bestimmt werden. Sobald die Standardkurve vollständig ist, wählen Sie den Reiter „Proben“ aus, geben Sie die entsprechenden Proben-ID-Informationen ein und messen Sie jede unbekannte Probe. Eine gültige Kurve zeigt an, dass die Mindestanzahl an Standards erreicht wurde.Die DNA-Konzentration basiert automatisch auf der Standardkurve. Mit der NanoDrop-Mikroliter-Technologie kann die Nukleinsäurekonzentration entweder durch direkte A260-Messungen oder indirekte fluorometrische Methoden bestimmt werden. Mit NanoDrop-Spektrophotometern kann auch die Proteinkonzentration durch direkte A280-Absorption oder durch proteinfarbmetrische Assays quantifiziert werden.

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Forschung

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Biologie

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