Name: Optical Imaging von Neuronen im Crab stomatogastrischen Ganglion mit spannungsabhängigen Farbstoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Lernen Sie die optische Bildgebung von Neuronen im stomatogastrischen Ganglion von Krebsen mit spannungsabhängigen Farbstoffen. Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung von Membranpotentialänderungen und synaptischen Interaktionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken für die Unterstützung von der School of Computing Science and Faculty of Science, Landwirtschaft und Engineering von der Universität Newcastle, von der Universität Ulm, und durch die SciMedia Ltd (Tokyo, Japan).

1. Vorbereitung des Crab stomatogastrischen Nervous System Adult Cancer pagurus L. wurden aus lokalen Quellen (Newcastle University, Dove Marine-Laboratories) zu beschaffen und in gefiltertes, Porenbeton Meerwasser (10 bis 12 ° C). Die Tiere wurden durch die Verpackung sie in Eis für 20 narkotisierten - 40 min vor ihrer Zerlegung. Wir verwendeten isolierten stomatogastrischen Nervensystem (Tln) 1. Die Tln wurde in einem Silikon-Elastomer-ausgekleidete (ELASTOSIL RT-601, Wacker, München, Deutschland) Petrischale merken und kontinuierlich superfundiert (7 bis 12 mL / min) mit gekühlten Kochsalzlösung (10-13 ° C). Physiologische Kochsalzlösung bestand aus (mmol * l-1): NaCl, 440; MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11; Trisma Basis, 10; Maleinsäure, 5. 13 ° C und bei pH 7,4 - - 7,6 Saline wurde bei einer konstanten Temperatur von 11 gehalten. Die detaillierten Schritte der Tln Dissektion und Vorbereitung, einschließlich der desheathing der stomatoastric Ganglion (STG), sind in der JoVE Artikel von Guttierez und Grashow 1 dargestellt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 24. November 1986 (86/609/EWG) vorgenommen. Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung des Tln und Abbildung 1B zeigt eine typische desheathed STG mit seiner Neuronen als flache Halbkreis in den hinteren Teil des Ganglion angeordnet. Mit Knetmasse, die Petrischale mit dem Tln ist es, die operative Plattform der Imaging-Mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan BW51 WI) fixiert. Sowohl die Mikroskoptisch und das Mikroskop auf einem schwingungsisolierte Tisch montiert (Scientifica, Uckfield, UK), um Bewegungsartefakte bei der optischen Aufzeichnung zu verhindern. Die Bewegungsmuster im stomatogastrischen Ganglion (STG) generiert werden anhand extrazellulären Aufnahmen 2-4. Dies wird durch die folgenden Schritte: <ol><li> Ein Vaseline-Basis zylindrischen Kammer ist um einen Abschnitt der wichtigsten motorischen Nerven (LVN) elektrisch zu isolieren den Nerv aus dem Bad (dies ist auf die Präparation der Bühne geschehen, bevor die Petrischale auf dem Betriebssystem-Plattform der Imaging-Mikroskop gelegt wird gebaut ). </li><li> Einer von zwei Edelstahl-Elektroden-Drähte in dieses Fach gelegt, die andere in das Bad als Referenz-Elektrode. </li><li> Das Differenzsignal wird aufgezeichnet, gefiltert und verstärkt mit einem AC-Differenzverstärker (Univ. Kaiserslautern, Deutschland). </li><li> Die motorische Aktivität der Ganglienzellen wird überwacht mit einem Oszilloskop (DL708E; Yokogawa, Tokyo, Japan) und wird zusätzlich aufgenommen mit einem Datenerfassungs-Board (CED Power, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) und der Spike 2 v6.10 Software (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Die Dateien werden analysiert mit Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). </li></ol> 2. Vorbereitung der Farbstofflösung Wir nutzten die fluoreszierenden Spannung Farbstoff Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) 5, die eine doppelte positive Ladung, die die Beladung des Farbstoffes durch Mikroelektroden erleichtert durch positive Stromimpulse hat. Der Farbstoff-Lösung sollte vor Licht so weit wie möglich geschützt werden. Die Farbstofflösung wird wie folgt hergestellt: <ol><li> 5 mg des Farbstoffs ist mit 1 ml F-127 Pluronic Säure in DMSO (Invitrogen) gemischt. </li><li> Die Kunststoff-Fläschchen mit dem gelösten Farbstoff wird für 20 Minuten bei 12.000 zentrifugiert Drehung / Minute in einer Sigma Microcentrifuge 1-14 (Sigma, Osterode, Deutschland), um größere Farbpartikel, dass die Mikroelektrode verstopfen können zu trennen. </li><li> Der Überstand (top 200 ul) der Farbstofflösung wird anschließend über ein Pipette und in einem separaten Kunststoff-Fläschchen. Beide Flaschen sind in Aluminiumfolie ein, um Lichteinfall zu verhindern gewickelt. </li><li> Die Farbstofflösung wird bei -20 ° C eingefroren </li><li> Vor dem Einsatz der Lösung des Farbstoffes ist, indem die geschlossene und wickelte Fläschchen in warmen (25 ° C) Wasser für 10-15 Minuten geschmolzen. </li></ol> 3. Dye Loading durch intrazelluläre Injektion mit der Sharp Mikroelektroden Wir verwendeten scharfen Mikroelektroden an die Neuronen mit dem Farbstoff zu laden. Zur Überprüfung der Farbstoff Laden verwenden wir die MiCAM02 Imaging-System (SciMedia, Tokyo, Japan) 6. Das bildgebende System besteht aus zwei CCD-Kameras: Die HR-Kamera verfügt über einen größeren Sensor-Chip (6,4 mm x 4,8 mm) eine bessere räumliche Auflösung mit der besten zeitlichen Auflösung betrug 1,4 ms, hat das HS-Kamera eine kleinere (2,9 mm x 2,1 mm), aber schneller Sensor-Chip ermöglicht schnellere Bildgebung mit 0,7 ms as its best zeitlicher Auflösung. Die Schritte des Farbstoffes loading sind wie folgt: <ol><li> Mikroelektroden sind mit zog eine P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) Elektrode Abzieher mit 10 cm lang, 1 mm Außendurchmesser Glasröhrchen mit Filament (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Deutschland). Die Elektroden werden gezogen, um einen Widerstand in der habenSpektrum von 25 bis 40 MOhm in 3M KCl (geeignete ziehen Parametereinstellungen der Pipette Kochbuch von dem Hersteller der Elektrode puller vorgesehen folgen). </li><li> Die gefrorenen Farbstofflösung wird geschmolzen und eine sehr kleine Menge davon wird in eine Microfil Nadel (Microfil - 34G, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) - sog die angesaugte Farbstoff füllt rund 2 / 3 rd der Microfil Nadel . </li><li> Die Farbstofflösung in der Microfil Nadel wird in die Spitze einer Mikroelektrode injiziert. Die Mikroelektrode wird in einer dunklen Box für 15 Minuten gelegt. </li><li> Die Mikroelektroden ist mit 3M KCl-Lösung aufgefüllt. Die Elektrode wird dann wieder in eine dunkle Elektrode Aufbewahrungsbox für weitere 10-20 Minuten platziert, um die Farbstoff-Lösung ermöglicht die feine Spitze der Elektrode durch den Sog der Kapillare wirkende Kraft in der Mikroelektrode zu erreichen. </li><li> Die fertig Mikroelektroden in einem Elektrodenhalter gelegt und fixiert auf die headstage der intrazellulären Verstärker (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA). </li><li> Die intrazellulären Verstärker ist auf die Messkarte, dass ein Impulssignal an Stromimpulse in die Mikroelektroden-Laufwerk bereitstellt. </li><li> Die Mikroelektrode wird sanft in die Membran einer Nervenzelle STG mit einer Mikroelektrode Manipulator (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, UK) platziert. Da der Arbeitsabstand der 10fach Objektiv (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 mm; Olympus Corporation, Tokio, Japan) von der Imaging-Mikroskop ist sehr klein, sollte die Mikroelektrode in eine Schräglage positioniert werden (ca. 30 °) und die Bewegung der Mikroelektrode in die richtige Position erfordert mehrere Schritte der Neuausrichtung des Mikroskop-Objektivs und Bewegung der Mikroelektrode. Zum Start der Mikroelektroden ist in der Lage, so dass seine Spitze über dem STG bewegt wird. Die Mikroskop-Objektiv ist abgesenkt, bis die Spitze der Elektrode erscheint im Fokus. Dann ist es weiter, sondern senkte nicht so viel um die Mikroelektroden-Touch. Die Mikroelektrode wird abgesenkt, bis sie-re erscheint im Fokus des Objektivs. Diese Schritte werden wiederholt, bis die Neuronen klar erscheinen in der Fokusebene des Objektivs. Dann wird der Mikroelektroden ist abgesenkt, bis sie und berührt vorsichtig durchsticht die Membran des ausgewählten STG Neurons. Dies wird überwacht mit dem Oszilloskop. </li><li> Die intrazelluläre Elektrode wird verwendet, um die Aktivität der ausgewählten STG Neuron aufnehmen, um das Neuron aufgrund seiner Tätigkeit Profil und die Beziehung zwischen ihrer Tätigkeit und der STG-Aktivität von der extrazellulären Elektrode 2,3,7 aufgenommen zu identifizieren. </li><li> Die intrazellulären Verstärker ist in Stromeinspeisung umgeschaltet und wird für 30 Minuten zur 10 nA positive aktuellen Schritte in die Mikroelektroden, die zuletzt für ca. 1 Sekunde und 1 Sekunde Lücken sind derzeit keine Injektion in den Mikroelektroden getrennt zu injizieren. Der eingespeiste Strom treibt die positiv geladenen Farbstoffmoleküle in die aufgezeichneten Neuronen. Werden Geräte verfügbar mehrere Neuronen gleichzeitig injiziert werden. </li><li> Zehn Minuten nach der Injektion Zeitraum und nach dem Ende der Injektion der Farbstoff Ausbreitung des Neurons wird überprüft. Dazu verwenden wir die MiCAM02 Imaging-System (SciMedia Ltd, Tokio, Japan) mit dem 10-fach Objektiv und Beleuchtung durch den Ultra-Low-Ripple-Halogen-Lichtquelle (HL-151; Moritex, Tokyo, Japan) durch den Filter cube MSWG2 (mit 480-550 nm Anregungsfilter, Olympus Corporation, Tokio, Japan). Das bildgebende System ist auf die HR-Kamera mit 192 x 128 Pixel Auflösung, 40 ms Belichtungszeit, die "hbin"-Modus, und 10 Frames pro Imaging-Sitzung zu verwenden. Wenn der Farbstoff Befüllung erfolgreich die Bildgebung sollte einen gefärbten Fleck in das Neuron rund um den Standort der Mikroelektroden, und das gefärbte Pflaster sollte zwischen den Bildern nach 10 Minuten und nach 30 Minuten genommen werden. Wenn die Ausbreitung des Farbstoffes ist nach 30 min nicht ausreicht, ist mehr Einspritzzeit gewährt. Alternativ kann ein neuer Farbstoff Elektrode verwendet werden. </li><li> Die Elektrode wird aus dem Neuron gezogen und das Neuron bleibt für mindestens 20-30 Minuten entspannen. Innerhalb dieser Zeit kann das nächste Neuron mit Farbstoff injiziert werden. </li></ol> 4. Imaging von Dyed Neurons Die Aktivität der einzelnen Neuronen kann nach dem Farbstoff Füllvorgang abgebildet werden. Alternativ können zwei oder mehr Neuronen zu Bild gefüllt werden die gleichzeitige Aktivität von mehreren STG Neuronen. Im Prinzip viele und möglicherweise alle STG Neuronen kann mit Farbstoff gefüllt werden. Die Abbildung der Neuronen mit dem Micam 02 Imaging-System mit dem HR-Kamera gemacht. Das Verfahren der Bildgebung ist wie folgt: <ol><li> Die Mikroskop-Objektivs verändert wird und eine hohe Lichtdurchlässigkeit Effizienz 20x-Objektiv (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD 2,0 mm; Olympus Corporation, Tokio, Japan) ist für die Bildgebung der Datenerhebung eingesetzt. Dieses Ziel sammelt viel Licht, dass die 10-fach Objektiv und auch höherer Vergrößerung gibt die detailliertere Bild der Neuronen. Bein g mehr Licht effizient bedeutet, dass kleine Menge an Farbstoff Laden bereits sichtbar ist mit diesem Ziel und auch, dass wir geringere Lichtintensität für die Bildgebung eine Minderung der potenziellen Foto Schäden, die auf die Neuronen, die durch den Farbstoff verursacht werden können. </li><li> Das Mikroskop der operativen Phase wird so positioniert, dass die Neuronen, die gemeint, die abgebildet werden sollen, in das Sichtfeld des Objektivs sind und das Ziel ist auf sie konzentriert. </li><li> Die extrazelluläre Aufzeichnung von Daten ist auch in den Micam 02 Imaging-System durch seine analogen Eingangskanal eingespeist. Dies ermöglicht die relativ leicht über der optischen Signale und entsprechende Bewegungsmuster oder extrazellulär erfasst Spikes in der Analyse-Phase. </li><li> Die Micam 02-System ist auf 96 x 64 Pixel Auflösung mit 2,2 ms Belichtungszeit oder 48 x 32 Pixel Auflösung mit 1,5 ms Belichtungszeit verwenden. In beiden Fällen ist die "hbin 'Einstellung kann verwendet werden, wenn die Färbung der Neuronen ist nicht sehr stark sein. </li><li> Die Lichtstärke ist so niedrig wie möglich (dh der Farbstoff in den Neuronen zu erzeugen noch ausreichende Fluoreszenz für die Bildgebung) eingestellt auf ein Foto, Modulations-und Foto Beschädigung der aufgezeichneten Neuronen zu vermeiden. </li><li> Die Raumbeleuchtung und alle übrigen Lichtquellen ausgeschaltet sind. Darüber hinaus kann ein schwarzer Vorhang um die Aufnahme rig geschlossen werden, um Belichtung aus externen Quellen zu verhindern. </li><li> Die Imaging-Sitzungen werden auf einen Wert zwischen 4 - 16 Sekunden lang. </li><li> Die spontane Aktivität der Neuronen gefärbt ist über mehrere Imaging-Sitzungen aufgezeichnet. </li></ol> 5. Die Analyse der Optical Imaging-Daten Zur Analyse der Bilddaten benutzten wir die BVAna Software (Version 10,08; SciMedia Ltd, Tokio, Japan) mit dem Micam 02 Imaging-System verbunden. Die Software unterstützt die Visualisierung der Bilddaten und bietet eine Reihe von Analyse-Tools sowie. Die Schritte der Datenanalyse und-interpretation sind wie folgt: <ol><li> Eine entsprechende kreisförmigen Bereich von Interesse ist auf jeden aufgezeichneten Neuronen ausgewählt. In der Regel verwenden wir 2 bis 3 Pixel Radius Regionen von Interesse für die Untersuchung Neuronen an der 48 x 32 Pixel Auflösung, und 6 bis 8 Pixel-Radius Regionen von Interesse für die Untersuchung Neuronen bei 96 x 64 Auflösung. </li><li> Die zeitliche Glättung der Daten erforderlich sein, insbesondere dann, wenn der Farbstoff relativ geringe Menge der Fluoreszenz (low Hintergrund Wert in die die Daten bedeutet dies, kann es aufgrund der geringen Lichtintensität, die verwendet wird oder niedrigen Niveau Farbstoff Laden, zum Beispiel in einem Neuriten der aufgezeichneten Neuron). In der Regel in solchen Fällen benutzten wir die zeitliche Glättung mit 3 bis 5 Zeiteinheiten. </li><li> Zusätzlich zu den optischen Aufnahmen haben wir auch Anzeige der extrazellulären Aufnahme, indem Sie auf den analogen Eingang des bildgebenden Systems anzuzeigen. </li><li> Die Parameter für die Visualisierung der optischen Daten und den analogen Eingang sollte entsprechend eingestellt werden, um alle Aufnahmen auf dem Bildschirm zu sehen. </li><li> In Anbetracht der optischen Aufnahmen der Neuronen, die extrazelluläre Aufnahme aus dem LVN, und die Klassifizierung des Neurons auf den früheren intrazelluläre Aufnahme basiert, ist es möglich, die Identität des Neurons zu ermitteln und deren Tätigkeit auf die neuronalen Aktivitäten aus den aufgezeichneten beziehen Nerv. </li><li> Es wird erwartet, dass die optischen Aufnahmen zeigen deutlich, und ohne die Notwendigkeit der Mittelung über mehrere ähnliche Ereignisse, die neuronalen Aktivitäten entsprechend extrazellulär erfasst Spikes und auch unterschwellige Ereignisse wie hemmenden postsynaptischen Potentiale durch die Aktivität anderer Nervenzellen verursacht. </li><li> Der Datenexport Merkmale des BVAna Software kann verwendet werden, um die optischen Aufnahmen für den ausgewählten Regionen von Interesse und auch den analogen Eingang, dass die Aufnahme aus dem lvn enthält berechnet exportieren. Die exportierten Daten können verarbeitet und analysiert werden weiter mit anderen Daten-Analyse-Software als auch (zB im einfachsten Fall Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) kann für zusätzliche Visualisierung und Datenverarbeitung verwendet werden). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt die gleichzeitige Aufnahme von zwei Neuronen (LP, seitliche Pylorus Neuron; PD, Pylorus Dilatator Neuron) in den Pylorus central pattern generator einer Krabbe STG zusammen mit der Aufnahme aus dem LVN. Die optischen Aufnahmen der LP und PD Neuronen auf der Grundlage ihrer intrazellulären Aufnahmen identifiziert zeigen, dass in der Tat diese Übereinstimmung auch mit der extrazellulären Aufnahmen entsprechend LP und PD Neuronen. Es ist eine konsequente 12 ms Verzögerung zwischen dem optischen und lvn Aufnahmen von Spike Peaks (siehe Einschub in Abbildung 2) durch die axonale Übertragung Verzögerung zwischen dem Ganglion und der extrazellulären Aufnahme vor Ort. Die vorgestellten Daten zeigen auch, dass die neuronale Aktivität in der Soma, die Spitzen der aufgezeichneten Neuronen entspricht eindeutig nachweisbar ist. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/&gt; Abbildung 1. A) Schematische Darstellung der stomatogastrischen Nervensystems (Tln). COG, kommissuralen Ganglion; OG, Schlundganglion; STG, stomatogastrischen Ganglion; stn, stomatogastrischen Nerven; lvn, lateral ventrikuläre Nerven. B) Die Krabbe stomatogastrischen Ganglion (STG) - das Bild zeigt die halbrunde Anordnung der hinteren STG Neuronen. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Gleichzeitige Single Sweep-Aufzeichnung eines PD und eine LP Neuron zusammen mit der Aufzeichnung des LVN. Die Daten zeigen, dass die optischen und Nerven-Aufnahmen sehr gut passen und dass wir die neuronalen Aktivitäten entsprechend Spikes aufgezeichnet bilden die Nervenzellen zu identifizieren. Der Einschub zeigt eine Überlagerung von mehreren Sweeps von LP Aktionspotentiale - sowohl optisch als auch elektrisch aufgezeichnet - und deren durchschnittliche Nachweis der Übereinstimmung zwischen optisch und elektrisch aufgezeichneten Aktivitäten. Aufgrund der Tatsache, dass unsere optischen Aufzeichnungsverfahren nicht filtern die niederfrequenten Komponenten der Daten können wir auch zu langsam Membranpotential Veränderungen charakteristisch für PD und LP Neuronen 14 Eintragung.

<ol><li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Bartos, M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercircuit+control+of+motor+pattern+modulation+by+presynaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition.</a> J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).</li>
<li>Blitz, D. M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+pattern+selection+via+inhibition+of+parallel+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor pattern selection via inhibition of parallel pathways.</a> J Neurosci. 17, 4965-4975 (1997).</li>
<li>Stein, W., Smarandache, C. R., Nickmann, M., Hedrich, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+activity-dependent+synaptic+enhancement+at+a+crustacean+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction.</a> J Exp Biol. 209, 1285-12300 (2006).</li>
<li>Loew, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiometric+dyes%3A+Imaging+electrical+activity+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+%26+Appl+Chem%22%5BJournal%5D)">Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes.</a> Pure & Appl Chem. 68, 1405-1409 (1996).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> J Neurosci Meth. 102, 11-23 (2000).</li>
<li>Heinzel, H. G., Weimann, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behavioral+repertoire+of+the+gastric+mill+in+the+crab%2C+Cancer+pagurus%3A+an+in+situ+endoscopic+and+electrophysiological+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination.</a> J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).</li>
<li>Zecevic, D., Wu, J. -Y., Cohen, L. B., London, J. A., Höpp, H. P., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundreds+of+neurons+in+the+Aplysia+abdominal+ganglion+are+active+during+the+gill-withdrawal+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex.</a> J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).</li>
<li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> J Neurosci. 26, 10925-10933 (2006).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Ann Rev Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Grillner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+pattern+generation%3A+the+cellular+and+computational+logic+of+networks+in+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Biological pattern generation: the cellular and computational logic of networks in motion.</a> Neuron. 52, 751-766 (2006).</li>
<li>Yuste, R., MacLean, J. N., Smith, J., Lansner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortex+as+a+central+pattern+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cortex as a central pattern generator.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 477-483 (2005).</li>
<li>Stein, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+stomatogastric+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of stomatogastric rhythms.</a> J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).</li>
</ol>

Die Spannung Farbstoff Bildgebung 8,9 von STG Neuronen in Kombination mit traditionellen Methoden der Elektrophysiologie (intra-und extrazellulären Elektrode Aufnahmen) ermöglicht ein besseres Verständnis davon, wie dieses kleine, bekannte und noch komplexe neuronale System funktioniert. Die STG ist ein Prototyp des central pattern generator (CPG) neuronalen Netzen (sie umfasst die Pylorus und Magenmühle Rhythmus Netze) 10,, 11, damit ein besseres Verständnis der entstehenden funktionellen Eigenschaften der STG auch helfen zu verstehen, wie im allgemeinen CPG-Netzwerke erzeugen ihre Netzwerk-Ebene Funktionalität. CPG-Netzwerke spielen eine entscheidende Rolle bei der Motorsteuerung 12 und auch in höheren kognitiven Funktionen 13, damit ein besseres Verständnis ihrer emergenten Eigenschaften haben einen großen Einfluss in vielen Bereichen der Neurowissenschaften.

<table><tbody><tr><td>MiCAM02</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Abbildungs-System</td></tr><tr><td>BVAna v.10.08</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Datenanalyse-Software für das MiCAM-02-Abbildungs-System</td></tr><tr><td>HL-151</td><td>Moritex, Tokyo, Japan</td><td></td><td>Halogenlichtquelle mit ultraniedriger Welligkeit</td></tr><tr><td>BX51 WI</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Aufrechtes Mikroskop für Epifluoreszenz-Aufnahmen</td></tr><tr><td>20x-Aufnahmeobjektiv </td><td>Olympus Corporation</td><td>XLUMPLFL20XW/0.95</td><td>NA 0.95, WD 2,0 mm</td></tr><tr><td>10x-Aufnahmeobjektiv </td><td>Olympus Corporation</td><td>UMPLFL10XW</td><td>NA 0,30, WD 3,3 mm</td></tr><tr><td>Filterwürfel mit 480–550 nm Anregungsfilter und 590 nm Emissionsfilter </td><td>Olympus Corporation</td><td>MSWG2</td><td></td></tr><tr><td>Antivibrations-Tisch</td><td>Scientifica Ltd</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>PatchStar-Elektrodenmanipulator</td><td>Scientifica Ltd</td><td>PS-7000C</td><td>Mikroelektroden-Manipulator</td></tr><tr><td>CED Power 1401</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Datenerfassungskarte</td></tr><tr><td>DL708E Oszilloskop</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>Intrazellulärer Verstärker</td></tr><tr><td>AC-Differenzverstärker</td><td>Universität Kaiserslautern, Deutschland</td><td></td><td>Extrazellulärer Verstärker</td></tr><tr><td>P-97 Flaming &amp;#8211; Brown-Typ-Elektrodenzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Elektrodenzieher</td></tr><tr><td>Sigma-Mikrozentrifuge 1-14</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>Genex-Pipettierer Mline</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP7774</td><td>PIP7774</td></tr><tr><td>Glas-Mikropipette mit Filament</td><td>Science Products</td><td>GB100TF 8P</td><td>Glas für Mikro&amp;#8211;elektroden</td></tr><tr><td>MicroFil &amp;#8211; 34G</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>Microfil-Nadel</td></tr><tr><td>Spike 2 v6.10</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Elektrophysiologie-Software</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPQ</td><td>Cambridge BioScience</td><td>BT61014</td><td>Fluoreszierender spannungsabhängiger Farbstoff</td></tr><tr><td>F-127 Pluronic-Säure, DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Komponente der Krebs-Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>Komponente der Krebs-Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Komponente der Krebs-Ringer-Lösung, Elektrolytlösung</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>Komponente der Krebs-Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Trizma-Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Komponente der Krebs-Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Maleinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td>Komponente der Krebs-Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Elastosil RT-601</td><td>Wacker, München, Deutschland</td><td></td><td>Beschichtung von Petrischalen</td></tr></tbody></table>

optical imaging von neuronen im crab stomatogastrischen ganglion mit spannungsabhängigen farbstoffen

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitiven Farbstoff Bildgebung von Neuronen ist ein Schlüssel-Methode für das Verständnis, wie neuronale Netzwerke organisiert sind und wie die gleichzeitige Aktivität der beteiligten Nervenzellen führt zur Entstehung des integrierten Funktionalität des Netzwerkes. Hier präsentieren wir die Methodik der Anwendung dieser Technik zu identifizieren Muster erzeugenden Neuronen in der Krabbe stomatogastrischen Ganglion. Wir zeigen das Laden dieser Neurone mit dem fluoreszierenden Spannung Farbstoff Di-8-ANEPPQ und wir zeigen, wie man Bilder die Aktivität der Farbstoff beladenen Neuronen mit dem MiCAM02 hoher Geschwindigkeit und hoher Auflösung CCD-Kamera Imaging-System. Wir zeigen die Auswertung der aufgezeichneten Bilddaten mit dem BVAna Imaging-Software mit dem MiCAM02 Imaging-System verbunden. Die gleichzeitige Spannungs-sensitiven Farbstoff Darstellung der detaillierten Aktivität mehrerer Neurone in der Krabbe stomatogastrischen Ganglion angewendet zusammen mit traditionellen Techniken der Elektrophysiologie (intra-und extrazellulären Aufnahmen) eröffnet völlig neue Möglichkeiten für das Verständnis, wie central pattern generator neuronalen Netzen arbeiten.

Hier präsentieren wir die Methodik für schnelle und hochauflösende Fluoreszenz-Spannungs-sensitiven Farbstoff Bildgebung von detaillierten Aktivität von Neuronen in der Krabbe stomatogastrischen Ganglion.

Optical Imaging von Neuronen im Crab stomatogastrischen Ganglion mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Die spannungssensitive Farbstoff-Bildgebung von Neuronen ist eine Schlüsselmethode zum Verständnis der Organisation neuronaler Netzwerke und dessen, wie die gleichzeitige ...

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, spannungsabhängige Farbstoffe zu verwenden, um optisch Änderungen des Membranpotentials sowie synaptische Wechselwirkungen zwischen Neuronen in den zentralen Mustergebern des somatischen Stern-Ganglions von Krebstieren aufzuzeichnen. Dazu werden identifizierte Neuronen im zweiten Schritt mit dem Farbstoff DD acht und at PQ durch iontophoretische Injektion mittels scharfer Mikroelektroden beladen und gleichzeitig die Aktivität der motorischen Nerven extrazellulär registriert. Anschließend wird die Fluoreszenz des spannungsabhängigen Farbstoffs mit grünem Licht angeregt, wodurch die Abbildung von Fluoreszenzänderungen ermöglicht wird, die den Änderungen des Zellmembranpotentials entsprechen. Danach werden die Bilddaten analysiert, indem ein interessierender Bereich in der Neuronenmembran ausgewählt und das optische Signal mit der aufgezeichneten extrazellulären Nervenaktivität verglichen wird, um Aktionspotentiale und synaptische Potentiale zu identifizieren.In der Abbildung erhältliche Ergebnisse zeigen, dass die optische Aufzeichnung synaptisch miteinander verbundener, musterbildender Neuronen traditionelle Aufzeichnungstechniken ergänzen und neue Möglichkeiten eröffnen kann, um zu verstehen, wie zentrale Musterbildungs-Neuronennetzwerke funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie extrazellulären und intrazellulären Ableitungen, besteht darin, dass nach der Füllung mittels „dive filling“ optische Aufzeichnungen von Membranpotentialänderungen und synaptischen Wechselwirkungen ohne die sterischen Einschränkungen erreicht werden können, die durch die Platzierung von Elektroden verursacht werden, und ohne zusätzlichen Schaden an den Neuronen während Langzeitaufzeichnungen. Obwohl diese Methode zusätzliche Einblicke in die Musterbildung im Magen-Ganglion der Krustentiere ermöglichen kann.Sie kann auch auf andere Systeme wie die Fortbewegung und Atmung bei Wirbeltieren angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da die D-Selektion, Injektion und Vorbereitung anspruchsvoll sind und die Parameter zur Analyse der Bilddaten angemessen eingestellt werden müssen, um Änderungen des Membranpotentials zu erfassen. Beginnen Sie mit den Vorbereitungen, indem Sie die fluoreszierende Farbstofflösung in einem Plastikfläschchen herstellen: Mischen Sie fünf Milligramm des fluoreszierenden, spannungsabhängigen Farbstoffs D eight und FPQ mit einem Milliliter F1 27 onischer Säure in DMSO-Lösung.Als Nächstes zentrifugieren Sie den gelösten Farbstoff 20 Minuten lang bei 12.000 Umdrehungen pro Minute. Um größere D-Partikel zu entfernen, die nach der Zentrifugation die Mikroelektrode verstopfen könnten, entnehmen Sie vorsichtig die oberen 200 Mikroliter des Überstandes und geben Sie diesen in ein separates Plastikfläschchen ab. Umschließen Sie das Fläschchen mit Aluminiumfolie, um eine Belichtung durch Licht zu verhindern.Bewahren Sie die D-Lösung am Tag des Experiments bei minus 20 Grad Celsius im Gefrierschrank auf. Tauen Sie die Farbstofflösung auf, indem Sie das umwickelte Vial 10 bis 15 Minuten lang in 25 Grad Celsius warmes Wasser stellen. Beginnen Sie zur Vorbereitung der Aufnahmen mit der Isolierung des somatischen gastrointestinellen Nervensystems eines Krabben und entfernen Sie die Hülle des somatischen gastrointestinellen Ganglions.Tragen Sie Vaseline um einen Abschnitt des lateralen ventrikulären Nervs oder LVN auf, um eine elektrisch isolierte Kammer zu erzeugen. Befestigen Sie die Petrischale mit Modellierknete an der Operationsplattform des Abbildungsmikroskops. Platzieren Sie einen Edelstahlelektrodenfaden in der Vaseline-Kammer, um vom LVN abzuleiten, und eine weitere Edelstahlelektrode im Bad als Bezugselektrode.Wenn die D-Lösung aufgetaut ist, ziehen Sie so viel von der D-Lösung auf, dass etwa zwei Drittel einer Mikrofüllnadel gefüllt werden. Injizieren Sie die D-Lösung aus der Mikrofüllnadel in die Spitze einer Glasmikroelektrode. Bedecken Sie die mit Farbstoff gefüllte Elektrode mit einer Box und warten Sie 15 Minuten.Füllen Sie dann die Mikroelektrode mit einer dreimolaren Kaliumchloridlösung auf. Stellen Sie die Mikroelektrode für 10 bis 20 Minuten in eine dunkle Elektrodenaufbewahrungsbox, damit die Kapillarwirkung die Lösung in die feine Spitze der Elektrode ziehen kann. Nach 10 bis 20 Minuten setzen Sie die Mikroelektrode in einen Elektrodenhalter ein und befestigen sie am Kopfverstärker des intrazellulären Verstärkers.Der intrazelluläre Verstärker ist mit der Datenerfassungskarte verbunden, die ein Pulssignal bereitstellt, um Strompulse in die Mikroelektrode einzuspeisen. Danach stellen Sie die Mikroelektrode in einen schrägen Winkel ein und positionieren ihre Spitze über dem somatischen Magenganglion. Senken Sie das Mikroskopobjektiv ab, bis die Elektrodenspitze scharf gestellt ist.Danach senken Sie das Objektiv vorsichtig ab und achten darauf, vor dem Berühren der Mikroelektrode anzuhalten. Dann senken Sie die Mikroelektrode ab, bis sie wieder erscheint. Unter Beobachtung des Fortschritts im Fokus des Objektivs auf dem Oszilloskop durchstoßen Sie vorsichtig die Membran des ausgewählten somatischen Neurons des Magenganglions.An diesem Punkt sollten intrazelluläre und extrazelluläre registrierte Aktionspotentiale verglichen werden. Um das penetrierte Neuron zu identifizieren, beginnen Sie mit der Farbstoffinjektion, indem Sie den intrazellulären Verstärker in den Strominjektionsmodus schalten und 10 Nano positive Stromschritte in die Mikroelektrode injizieren. Die Stromschritte sollten eine Sekunde lang andauern und durch eine Sekunde lange Phasen ohne Strom getrennt sein.Führen Sie diese Strominjektion weitere 30 Minuten fort. Nach 10 Minuten Dye-Injektion verwenden Sie das MYCA zero two-Bildgebungssystem, um die Verteilung des Farbstoffs innerhalb des Neurons zu überprüfen. Wiederholen Sie dies und überprüfen Sie erneut nach 30 Minuten.Wenn die Farbstofffüllung erfolgreich ist, sollte sich der gefärbte Bereich um die Mikroelektrode zwischen den Aufnahmen nach 10 und 30 Minuten vergrößern. Ziehen Sie die Elektrode aus dem Neuron heraus und lassen Sie das Neuron mindestens 20 bis 30 Minuten lang entspannen, damit sich der Farbstoff weiter in der Zelle ausbreiten kann. Währenddessen kann ein weiteres Neuron mit Farbstoff injiziert werden.Wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv für die Aufzeichnung der Transmissions-Effizienz am MYAM zero two-Bildgebungssystem. Positionieren Sie den Mikroskop-Bühnentisch nach Bedarf neu und fokussieren Sie auf das D-Feld-Neuron. Leiten Sie die extrazellulären Ableitungsdaten über den analogen Eingangskanal in das Bildgebungssystem ein.Schalten Sie die Raumbeleuchtung und alle verbleibenden Lichtquellen aus. Schließen Sie außerdem einen schwarzen Vorhang um die Aufzeichnungsvorrichtung, um eine Lichteinwirkung von außen zu verhindern. Stellen Sie das Abbildungssystem auf die im Diagramm angegebene geeignete Pixelauflösung und Belichtungszeit ein.Wenn die Färbung in den Neuronen nicht sehr intensiv ist, verwenden Sie die H-Bin-Einstellung. Stellen Sie die Lichtintensität des Mikroskops so niedrig wie möglich ein, um eine photomodulatorische Wirkung und photoinduzierte Schäden an den aufgezeichneten Neuronen zu vermeiden. Legen Sie die Dauer der Aufnahmesitzungen auf vier bis 16 Sekunden fest.Zeichnen Sie dann die spontane Aktivität der DY-Neurone über mehrere Bildgebungssitzungen auf. Um die Analyse der optischen Antworten mit der BV A NA-Bildgebungssoftware zu beginnen, wählen Sie einen geeigneten kreisförmigen Bereich auf jedem aufgezeichneten Neuron aus, falls eine zeitliche Glättung der Daten erforderlich ist. Wenn beispielsweise das D relativ geringe Mengen an Fluoreszenz erzeugt, verwenden Sie die Software, um eine zeitliche Glättung mit drei bis fünf Zeiteinheiten anzuwenden.Die beiden mit Farbstoff injizierten Neuronen in der oberen linken Ecke dieser Abbildung werden anhand ihrer intrazellulären Ableitungen als PD-Neuron und LP-Neuron identifiziert. Die Spannungssignale rechts daneben zeigen die spontanen optischen Antworten jedes Neurons. Die extrazelluläre Ableitung des LVN ist am unteren Rand der Abbildung dargestellt.Die LP- und PD-Neurone sind Teil des pylorischen zentralen Mustergenerators eines somatischen Magenganglions eines Krabben und weisen eine gegenseitige Hemmung auf. Ihre optischen Ableitungen können gut mit den extrazellulären Ableitungen des LVN verglichen werden. Der Ausschnitt unten zeigt eine Überlagerung mehrerer Durchläufe von LP-Aktionsspannungen und deren Mittelwert, wodurch die Übereinstimmung zwischen optisch und elektrisch aufgezeichneten Aktivitäten veranschaulicht wird.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in anderthalb Stunden durchgeführt werden. Anschließend können weitere Methoden wie beispielsweise Immunfärbungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welcher Typ von Synapsen an der Auslösung der beobachteten Änderungen des Membranpotentials beteiligt war. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man optisch mehrere identifizierte und miteinander interagierende Neurone im Magen-Gastralganglion aufzeichnen kann.

optical-imaging-neurons-crab-stomatogastric-ganglion-with-voltage

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll zeigt, wie Spannungs-sensitiven Farbstoffen optische Erfassung der elektrischen Aktivität ermöglichen aus intakten neuronalen Netzen wie dem Plexus des Meerschweinchens enterale Nervensystem, mit einer einstellbaren Auflösung reicht von Einzel-Zellen zu multi-ganglionären Schaltung.

Optische Erfassung der elektrischen Aktivität in Guinea-pig Enteric Networks mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Beobachtung von Veränderungen der neuronalen Aktivität in einer Gehirnscheibe, die mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff gefärbt wurde. Der Farbstoff spiegelt Veränderungen des Membranpotentials des Neurons wider, indem er seine Fluoreszenzintensität verändert. Durch die Anwendung elektrischer Stimuli und fortschrittlicher bildgebender Verfahren ermöglicht dieses Verfahren die visuelle Verfolgung von Echtzeitänderungen des neuronalen Membranpotentials...

Optische Aufzeichnung der neuronalen Aktivität in Hirnschnitten, die mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff gefärbt wurden

Quelle: Shannonhouse, J., et al. In vivo Kalzium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Spinalganglien. J. Vis. Exp. (2023). Das Video zeigt eine in vivo Calcium-Bildgebungstechnik zur Überwachung der neuronalen Aktivität in den Spinalganglien (DRG) einer transgenen Maus. DRG-Neuronen exprimieren einen Kalziumindikator, der die Fluoreszenzintensität bei Bindung an Kalzium erhöht. Mechanische oder thermische Reize, die auf eine Hinterpfote...

In vivo Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in den intakten Spinalwurzelganglien einer Maus

Hier beschreiben wir die Dissektion des Bauchnervenstrangs der Krebse. Wir demonstrieren auch eine elektrophysiologische Technik zur Aufzeichnung der fiktiven Fortbewegung von Swimmeret-Motoneuronen.

Die swimmeret System der Crayfish: Ein praktischer Leitfaden für die Dissektion der Nervenstrang und extrazellulären Recordings der Motor Pattern

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in der Darmwand, das die Darmreflexe steuert. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Aufzeichnung der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Lebendpräparaten von ENS unter Verwendung von Ca2+-Bildgebung.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Hier beschreiben wir eine Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs durch den Froschnervstumpf in die Nervenendigungen. Wir stellen auch ein Protokoll für die Aufzeichnung und Analyse von schnellen Calcium-Transienten in den peripheren Nervenenden vor.

Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Abbildung der neuronalen Populationsaktivität mit Einzelzellauflösung in nicht-transgenen wirbellosen Spezies unter Verwendung von absorptionsspannungsempfindlichen Farbstoffen und einem Photodiodenarray dar. Dieser Ansatz ermöglicht einen schnellen Workflow, bei dem Bildgebung und Analyse im Laufe eines einzigen Tages verfolgt werden können.

Photodiodenbasierte optische Bildgebung zur Aufzeichnung der Netzwerkdynamik mit Einzelneuronauflösung bei nicht-transgenen Wirbellosen

Hier präsentieren wir, wie man das genikulierte Ganglion einer lebenden, betäubten Labormaus freilegt und wie man Kalziumbildgebung verwendet, um die Reaktionen von Ensembles dieser Neuronen auf Geschmacksreize zu messen, was mehrere Versuche mit verschiedenen Stimulanzien ermöglicht. Dies ermöglicht detaillierte Vergleiche, welche Neuronen auf welche Tastants reagieren.

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Reaktionen auf Geschmacksreize

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) ermöglichen eine robuste Analyse der sensorischen Neuronensignalisierung auf Populationsebene. Hier haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der eine in vivo GECI-Visualisierung der Aktivität von Trigeminusganglien bei Ratten ermöglicht.

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Dieses Protokoll beschreibt in vivo die GCaMP-Kalziumbildgebung von intakten Trigeminusganglien (TG)-Neuronen. Diese Beschreibung umfasst TG-Expositionsoperationen, konfokale In-vivo-Mikroskopie-Bildgebung von TG-Neuronen, Anwendung somatischer Stimuli während der mikroskopischen Bildgebung von TG-Neuronen und Analyse von in vivo GCaMP-Calcium-Bildgebungsdaten.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Trigeminusganglien

Lernen Sie die optische Bildgebung von Neuronen im stomatogastrischen Ganglion von Krebsen mit spannungsabhängigen Farbstoffen. Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung von Membranpotentialänderungen und synaptischen Interaktionen.

Optical Imaging von Neuronen im Crab stomatogastrischen Ganglion mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Weitere Videos entdecken