Name: FISH für Präimplantations-Diagnostik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Erfahren Sie die FISH-Technik zur genetischen Analyse von Einzelzellbiopsien menschlicher Embryonen für die Präimplantationsdiagnostik. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Bestimmung von Chromosomenanomalien vor der Implantation.

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1. Lysing und Verbreitung eines Ablegers aus einer Biopsie Blastomere <ol><li> Zell-Lyse-Puffer für die Verbreitung von Zellen (0,2% Tween20 in 0,01 M HCl, pH 2,0) sollten 24 Stunden im Voraus vorbereitet werden und bei -20 ° C. Bereiten Sie 100 mL und Filter 20 mL in ein 30 mL sterile Universal-Container mit einer sterilen 20 ml Spritze und die Spritze zu filtern. Dispense 1 mL Aliquots in 10 bis 15 1,7 ml sterile Reaktionsgefäße, in der Nähe und beschriften Sie die Rohre vor dem Einfrieren. Es wird empfohlen, zwei unterschiedliche Chargen verwenden, die neue Charge und die vorherige Partie, die getestet wurde und kann verwendet werden, wenn die neue Charge ist unbefriedigend sind. </li><li> Defrost die Lyse-Puffer bei Raumtemperatur 30 Minuten vor der Biopsie. Aus praktischen Gründen die Betriebstemperatur wird zwischen Raumtemperatur und Temperatur der Hand sein. </li><li> Ergebnis einen kleinen Kreis (ca. 5 mm Durchmesser) an der Unterseite eines Amin-beschichtete Folie (zB Genetix) mit einem Diamant-Stift und pre-Label die Folie mit dem Fall-Nummer, einzigartige Bild-Nummer, und Biopsie date. Verwenden Sie eine separate Folie für jeden Blastomere in numerischer Reihenfolge und Etikett mit der Embryo-Nummer. Folien sollten mit einem harten Bleistift wie 4H gekennzeichnet werden, und "ausgelöscht" mit einem Latex-Handschuh auf jeden Graphit Staub zu entfernen. </li><li> Legen Sie ein kleines Volumen Lysepuffer innerhalb des Kreises. </li><li> Übertragen Sie die biopsiert Blastomere in den Lysepuffer. Falls notwendig, Lysepuffer im Kreis, bis die Zelle beginnt zu lysieren; die Zelle vollständig zu lysieren und das Zytoplasma, bevor der Puffer trocknet zerstreuen. </li><li> Beobachten Sie den Kern, um sicherzustellen, dass es innerhalb des Kreises bleibt und nicht verloren, wenn die Zelle nicht über einen Kern oder mehrere Kerne, Biopsie eine andere Zelle. </li><li> Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen bei Raumtemperatur. </li></ol> 2. In-situ-Hybridisierung eines einheitlichen Blastomere Nucleus <ol><li> Bereiten Sie eine Ethanol-Reihe (70, 90 und 100%) in sterilem destilliertem Wasser hergestellt. </li><li> Schalten Sie ein und stellen Sie den heißen Block (zB Hybaid Omnislide oder Vysis Hybrite) bis 75 ° C. </li><li> Defrost-Sonden, Wirbel, und Zentrifuge. Die Reagenzien sollten Zeugen und verifiziert werden, um vor denen sich die Sonde Gemisch zu korrigieren. Pipettenvolumina wie vom Hersteller zu machen bis die Sonde Gemisch in einer 0,65 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und vortexen, zentrifugieren vor Gebrauch angegeben. Das Gesamtvolumen der Sonde Mischung sollte ausreichend sein, damit 2 ul pro Kern getestet und bis auf die nächsten 10 ul einer Sicherheitsmarge ermöglichen abgerundet. </li><li> Vorwäsche die Folien in Färbetrog mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie die Folien zweimal in sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Entwässern die Folien mit den Ethanol-Reihe (70, 90 und 100%) für 2 min bei Raumtemperatur und an der Luft trocknen. Stellen Sie sicher, Folien sind vollständig eingetaucht und wenn Grafitstaub schwimmt an der Oberfläche, genießen Sie mit einem sauberen Tuch. </li><li> Notieren Sie die Position des Kerns innerhalb des Kreises durch die Visualisierung mit einem Phasenkontrastmikroskop. </li><li> Entwässern mit 100% Ethanol für 2 min bei Raumtemperatur und an der Luft trocknen. </li><li> Apply 2 ul der Sonde Mischung, und mit einem 9 x 9 mm Deckglas (ein Viertel eines 18 x 18 mm no.1 Deckglas). </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit Rubber Cement (zB Kuh-Gum, Cow Proofing). </li><li> Codenature die Folien auf einem heißen Block bei 75 ° C für 5 min und dann hybridisieren die Objektträger über Nacht (16-20 h) in einer feuchten Kammer bei 37 ° C. Probe vermischt, die vollständig aus Zentromer-Sonden (dh für sex-linked Fälle) geben ein zufrieden stellendes Ergebnis nach 60 min der Hybridisierung. </li><li> Bereiten Sie ein Wasserbad mit ausreichender Färbetrog und Hitze bis 71 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine 0,4-fach Standard-Salz-Citrat (SSC) strengen Waschlösung (pH 7,0 bei 71 ° C, 0,06 M NaCl, 6 mM C 6 H 5 Na 3 O 7 .2 H 2 O) und Wärme in das Wasserbad. </li><li> Geben Sie 50 ml strengen waschen pro Coplin jar erforderlich und überprüfen Sie, dass die Temperatur 71 ist ° C unmittelbar vor dem Gebrauch mit einem sauberen Thermometer. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gummi-Zement aus jeder Folie und spülen Sie das Deckglas mit 4x SSC/0.05% Tween20 (pH 7,0) bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Folien in der 0.4x SSC strengen Waschen bei 71 ° C für 5 min. Wash nicht mehr als 6 Folien pro Coplin Glas. </li><li> Waschen Sie die Slides in 4x SSC/0.05% Tween20 bei Raumtemperatur für 2 min. </li><li> Wenn die Sonde Mix enthält indirekt markierten Sonde (n), lassen Sie das Rutschen von überschüssiger Flüssigkeit und anwenden 20 uL fluoreszent konjugierten Antikörper unter einer 20 x 20 mm Quadrat Parafilm. </li><li> Inkubieren in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Entfernen Sie den Parafilm und waschen einmal in 4x SSC/0.05% Tween20 bei Raumtemperatur für 2 min. </li><li> Zweimal waschen für 2 min in PBS eint Raumtemperatur und entleeren Sie die Dias. </li><li> Bewerben 6 &amp;mgr; l DAPI / Vectashield (160 ng von 4 ',6-Diamino-2-phenylindole dihydrochlorid in 1 ml Vectashield Eindeckmedium, Vector Laboratories) zu einem 22 x 22 mm nicht. 0 Deckglas und invertieren die Folie über dem Deckglas. </li><li> Blot und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack. </li></ol> 3. Analyse mit einem Fluoreszenzmikroskop in geeigneter Weise mit entsprechenden Filtern für die verwendeten Sonden ausgestattet. <ol><li> Ergebnis Signale durch direkte Visualisierung mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops und Single-Band-Pass-Filter für jeden Fluorochrom in den Test. Jeder Kern soll durch zwei Analysten gewertet. Eine allgemeine Richtlinie sollte Scoring von einem einzigen Signal, wo zwei eng beieinander liegenden Signale sind weniger als ein Domain-(Signal-width) auseinander führen, allerdings benötigt Urteil auf Erfahrung ausgeübt, um Signale von unterschiedlicher Größe, Intensität und Trennung zu interpretieren. </li><li> Verwenden Sie Imaging-Software (z. B. Isis, MetaSystems, Altlußheim, Deutschland; CytoVision, Genetix) ein Bild des Kerns zur Bestätigung der visuellen Diagnostik zu erfassen, und für die Bildarchivierung als Teil eines Labors zur Qualitätssicherung zu planen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Metaphase und Interphase-Kernen aus kultivierten Lymphozyten des peripheren Blutes zu prüfen, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Sonden, die spezifisch für die Translokation Chromosomen, informativ für die Haltepunkte (die subtelomere Sonden sollten nur hybridisieren, die umgesiedelt Segmente und die Zentromer-Sonde (n) an die zentrische werden Segment (s)) und die Signale in Interphasekernen sollte hell und diskret. Scoring der Anzahl der Signale pro Sonde in 100 Interphasekernen von jedem Partner wird empfohlen, um die Effizienz des Tests zu beurteilen. In diesem Fall 2-Signale wurden in 95% -99% der Kerne für jede Sonde erzielt. Abbildung 1 zeigt eine Metaphase und Interphasekern aus einer Vorbereitung für eine reziproke Translokation zwischen dem kurzen Arm von Chromosom 5 und 9. Signale in Interphasekernen vom Embryo Blastomeren sollte hell und diskrete und erzielte mit separaten Bandpassfilter für die verwendeten Farben. Abbildung 2 zeigt eine Blastomere Kern mit einem normalen Signal-Muster (2 Kopien für alle Loci getestet) im Einklang mit einer normalen oder ausgewogene Chromosomensatz für das Chromosom 5 und 9, und einen Kern mit einer abnormen Signalmuster im Einklang mit einer unsymmetrischen Produkt der Translokation das hat Monosomie (eine Kopie) für die transloziert Segment des Chromosoms 5 und Trisomie (3 Exemplare) für die transloziert Segment des Chromosoms 9. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 A Metaphase verbreiten und eine Interphasekern aus kultivierten Lymphozyten des peripheren Blutes von einem Träger einer reziproken Translokation zwischen dem kurzen Arm von Chromosom 5 und 9 mit Haltepunkten in 5p14.3 und 9p24.1 vorbereitet:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9) (5ptel48-, 9ptel30 +; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +). FISH-Sonden wurden für beide transloziert Segmente ausgewählt (5p14.3 → 5pter, rot Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, grün Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) und der zentrischen Segment des Chromosoms 9 (9p24.1 → 9qter, blau Abbott CEP 9 alpha Satelliten SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Signale in der Interphase Blastomere Kerne von Tag-3 Embryonen erfasst mit einem anderen Filter für jeden Fluorochrom und zusammengeführt, um ein zusammengesetztes Bild zu erzeugen. (A) Zwei Signale für jede Sonde zeigt zwei Kopien von jedem Ort, die im Einklang mit einem normalen oder ausgewogene Ergänzung für die Translokation Chromosomen. (B) Ein rotes Signal, drei grüne Signale und zwei blaue Signale, die eine Kopie der transloziert Segment des Chromosoms 5, drei Exemplare des transloziert Segment des Chromosoms 9 und zwei Kopien der zentrischen Segment des Chromosoms 9, die im Einklang mit benachbart ist -1 Trennung der Translokation, was zu einer unsymmetrischen Produkt mit Monosomie für 5p14.3 → 5pter und Trisomie für 9p24.1 → 9pter.

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</ol>

Die Anwendung von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) zu einem einzigen Embryo Zellen (Blastomeren) stellt besondere Herausforderungen sowohl in praktischen und in der Interpretation des Signals Muster. Die Biopsie Zelle benötigt, um innerhalb einer vorher definierten Bereich auf dem Objektträger ausgestrichen werden, um seine Lokalisation folgenden FISH erleichtern; extreme Pflege braucht, um sicherzustellen, dass die Zelle lysiert ist, dass das Zytoplasma wurde verteilt eingenommen werden, und dass der Kern sichtbar ist und intakt, und wie sich die Diagnose auf die Ergebnisse dieser einzelnen Zelle, strengsten Scoring und Leitlinien für die Auslegung angewandt werden sollte, hängt. Doch in erfahrenen Händen, ist FISH eine robuste Technik für Präimplantations-Diagnostik (PGD) in der klinischen Praxis. Das Prinzip der PGD von FISH ist, dass target-spezifischen DNA-Sonden mit verschiedenen Fluorochromen oder Haptenen markierte verwendet werden, um die Kopienzahl der spezifischen Loci zu erfassen, und damit auf Chromosom Ungleichgewicht mit meiotischen Segregation der Chromosomen-Rearrangements (1) verbunden sind, einschließlich Robertson&#39;sche erkennen Translokationen, reziproke Translokationen, Inversionen und komplexen Rearrangements (2). Fische können auch verwendet werden, um weibliche Embryonen in Familien mit X-linked Krankheit wählen, für die es keine Mutation-spezifischen Test (3, 4). Umstrittener ist FISH auch Bildschirm für sporadische Chromosom Aneuploidie benutzt worden, um zu versuchen und verbessern die Effizienz der assistierten Reproduktion (5, 6), jedoch ist der prädiktive Wert der diesen Test mit FSIH wahrscheinlich unannehmbar niedrig bei den meisten Menschen ist Hände und es ist nicht für den klinischen Routineeinsatz (7) empfohlen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die technischen Aspekte und die Grenzen der FISH, die für klinische Single-Cell-Diagnose. Methoden der Verbreitung und Befestigung einzelnen Blastomeren sind Methanol / Essigsäure (5, 8), Tween / HCl (9), und eine Kombination von Tween / HCl und Methanol / Essigsäure (10). Variationen sind hypotone Behandlung der Zellen vor der Verbreitung und / oder Pepsin und Paraformaldehyd-Behandlung nach der Fixierung. Die Methode sollte entsprechend für das Labor (14) validiert werden. Die Tween / HCl-Methode wird ausführlich in diesem Artikel beschrieben. Die Tween / HCl-Methode ist technisch einfach und hoch reproduzierbare in verschiedenen Labors. Diese Methode kann verwendet werden, um einzelne Kerne für die FISH-Diagnostik der Geschlechtsbestimmung und Chromosomenveränderungen mit akzeptablen diagnostische Genauigkeit (7) vorzubereiten. Probe mischt kombinieren können direkt markiert und indirekt markierten Sonden und Sonden verschiedener Hersteller. Sonden für bekannte polymorphe Chromosom Regionen (11, 12), oder solche, die bekanntlich auch signifikant cross-Hybridisierung mit anderen Chromosomen (13) sollte vermieden werden, obwohl kann verwendet werden, wenn nachgewiesen werden spezifische und für PGD nach vorheriger Prüfung auf beiden reproduktiven Partner werden . Erhältlich Fluorochrome / Haptene und Strategien für anspruchsvolle Sonden gehören die folgenden: Texas Red (TR), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, biotinylierten Sonden mit TR-Avidin nachgewiesen, FITC-Avidin oder Cy-5 Streptavidin (visualisiert mit Hilfe eines FarRed Filter), eine Mischung aus Rot und Grün Sonden an ein gelbes Signal, eine zweite Runde der Hybridisierung und eine dritte Farbe, die durch sequentielle Erfassung von SpectrumOrange mit einem TexasRed und SpectrumGold Filter) erstellt produzieren. Eine Sonde Set mit drei Sonden, die spezifisch für das Zentromer Regionen der X-und Y-Chromosomen und ein Autosom, ist für die Geschlechtsbestimmung (14) empfohlen, die autosomal-Sonde wird verwendet, um Ploidie und damit zu etablieren, um zwischen Trisomie X unterscheiden (2n, 47 , XXX) und Triploidie (3n, 69, XXX), und zwischen Tetrasomie X (48, XXXX) und Tetraploidie (4n, 92, XXXX). Ein typisches Sonde gesetzt angewendet in dieser Einstellung ist der Abbott AneuVysion Mix mit alpha-Satelliten-X, Y, und 18; dieser Sonde gesetzt wurde gezeigt, dass eine sehr niedrige Rate Polymorphismus haben und daher vor der Behandlung Aufarbeitung des reproduktiven Partner ist nicht erforderlich (14). Die Sonde Mix für jede spezifische Umlagerung sollte: Idealerweise enthalten Sonden mindestens ausreichen, um all die erwarteten Produkte der Umlagerung mit Chromosom Ungleichgewicht zu erkennen. Wenn dies nicht möglich ist, mischt Sonde, wo die unentdeckt unsymmetrische Produkte bewertet wurden als nicht lebensfähig in einer erkennbaren Schwangerschaft und werden wahrscheinlich haben eine sehr niedrige Prävalenz akzeptabel sein kann (14). An kultivierten Lymphozyten Metaphasen sowohl reproduktive Partnern getestet werden. Mindestens zehn Metaphase Spreads sollten Sonde Spezifität, Polymorphismen und Kreuz-Hybridisierung untersucht werden, und für das Chromosom Umlagerung Träger, um sicherzustellen, dass die Sonden über die verschiedenen Segmente der Umlagerung erwartet hybridisieren. Darüber hinaus sollten mindestens 100 Interphasekernen von diesen Präparaten erzielt, um zu signalisieren Spezifität, Helligkeit und Diskretion (14) zu beurteilen. Commercial PGS Sonde Sets sind verfügbar (zB Abbott MultiVysion PB oder PGT), Targeting die Chromosomen am häufigsten gefunden, in Produkte der Empfängnis aneuploid werden, und aus einem einzigen Sonde pro Chromosom ausgerichtet. In der Regel den Kern kann eine zweite Hybridisierung mit Sonden für zusätzliche Chromosomen Bereitstellung eines Assays für die Chromosomen 13, 15, 16, 18, 21, 22 und XY (14). Der prädiktive Wert des Tests mit der Streu-und FISH-Technik hier beschriebene ist wahrscheinlich unannehmbar niedrig bei den meisten Menschen die Hände und es ist nicht für den klinischen Routineeinsatz (7, 15) empfohlen. Techniken wie komparative genomische Hybridisierung (CGH), die auf einzelne Zellen sind in der Lage, für die Kopienzahl von jedem Chromosom-Test (Wilton et al. 2001), und die Verwendung von Single Nucleotide Polymorphismen (SNP)-Arrays und quantitative Analyse (Wells et al . 2008) oder &quot;karyomapping&quot; Genotypisierung (Handyside et al. 2009) sind vielversprechende alternative Techniken auf Chromosom Aneuploidie zu erkennen. Allerdings bleiben die Auflösungsgrenze und Genauigkeit für das Segment Ungleichgewicht unsicher und es ist wahrscheinlich, dass FISH wird weiterhin die Methode der Wahl für Chromosomenveränderungen mit kleinen Segmenten werden.

<table><tbody><tr><td>Salzsäure, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid, 250 g</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumhydrogenphosphat wasserfrei, 500 g</td><td>VWR international</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenorthophosphat, 500 g</td><td>VWR international</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid-Perlen, 500 g</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500 mL</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>Zollfrei</td></tr><tr><td>Tri-Natriumcitrat, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>Kuhleim, 250 mL</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>Nicht mehr verfügbar</td><td>Alte Bestände sind weiterhin in Kunstgeschäften erhältlich</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0,125&amp;mu;g/mL, 500 µl</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;l Vial Rec&amp;rsquo;d mit jeder Cytocell TEL-Sonde</td></tr><tr><td>Nagellack, 12 mL</td><td>Stiefel</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>Aminbeschichtete Objektträger, 25</td><td>Genetix</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 0,1 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 10 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas-Red-Avidin, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Avidin, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 Streptavidin, 0,001 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 1,75 mL, Packung mit 500</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 0,6 mL, Packung mit 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Universal-Behälter, Packung mit 400</td><td>Sterilin</td><td>128B</td><td>Erhältlich über NHS Supply Chain, Artikelnummer KCP053</td></tr><tr><td>Heizblock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spiritbrenner Spiritbrennerfassung Docht für Spiritbrenner</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>Verstopfte Glaspipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebe, 100 Boxen</td><td>NHS-BESCHAFFUNGSKETTE</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>Metallkulturschalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikmelamin-Schalen</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>Ofen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mundpipettierhilfe</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchleitung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter, 0,2&amp;mu;m Porengröße, 25 mm Durchmesser</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>Diamantschneider</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock für Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungskammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebeprobe auf Rolle</td><td>NHS-BESCHAFFUNGSKETTE</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>Schieferdecker-Gefäß</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-Becher</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, fein</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, stumpf</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>1000-mL-Becherglas</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrastmikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Fasernfreie Abtupfkarten, Box mit 100 Stück</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>Blaue, rückseitig beschichtete Objektträger, Packung mit 100 Stück</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser, 18x18 mm, Nr. 1, Packung mit 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser, 22x22 mm, Nr. 0, Packung mit 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser, 22x50 mm, Nr. 0, Packung mit 100</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>1-mL-Spritze, Packung mit 100 Stück</td><td>NHS Supply Chain</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipettenspitze, 10 Gestelle zu je 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>LEEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Geräte bereitstellen</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholthermometer</td><td></td><td></td><td>Verschiedene verfügbare Quellen</td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>pH-Elektrode</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>BNC-Stecker für Jenway-pH-Meter 3305</td></tr><tr><td>Heizmischer</td><td>Bibby</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pasteur-Pipetten, Packung mit 500</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm, 50 mm × 75 m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

fish für präimplantations-diagnostik

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Pre-Präimplantationsdiagnostik (PID) ist eine etablierte Alternative zu den pränatalen Diagnostik, und beinhaltet die Auswahl vor der Implantation Embryonen aus einer Kohorte von assistierten Reproduktion (ART) generiert. Diese Auswahl kann aufgrund der familiären monogenen Erkrankungen (zB Mukoviszidose) erforderlich sein, oder weil ein Partner trägt ein Chromosom Umlagerung (zB ein Zwei-Wege-reziproken Translokation). Die PID ist für Paare, die bisherigen betroffenen Kinder gehabt haben, und / oder im Falle von Chromosomenveränderungen, wiederholte Fehlgeburten oder Unfruchtbarkeit zur Verfügung. Eizellen abgesaugt folgenden Stimulation der Eierstöcke durch in vitro Eintauchen in Samen (IVF) oder durch intrazytoplasmatische Injektion eines einzelnen Spermiums (ICSI) befruchtet werden. Pre-Implantation Spaltung-Embryonen sind biopsiert, in der Regel durch die Entnahme einer einzelnen Zelle an Tag 3 nach der Befruchtung, und die Biopsie Zelle wird getestet, um den genetischen Status des Embryos zu etablieren. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) auf der festen Kerne biopsiert Zellen mit target-spezifischen DNA-Sonden ist die Technik der Wahl auf Chromosom Ungleichgewicht mit Chromosomenumlagerungen assoziiert zu erkennen und weiblichen Embryonen in Familien wählen mit X-linked Krankheit, für die es keine Mutation-spezifischen Test. FISH wurde auch auf dem Bildschirm Embryonen für spontane Chromosom Aneuploidie (auch als PGS oder PGD-AS genannt) verwendet worden, um zu versuchen und verbessern die Effizienz der assistierten Reproduktion, aber die beschriebenen prädiktiven Wert dieses Tests unter Verwendung der Streu-und FISH-Technik hier ist wahrscheinlich unannehmbar niedrig bei den meisten Menschen die Hände und es ist nicht für die routinemäßige klinische Anwendung empfohlen. Wir beschreiben die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf die PID in einem klinischen Umfeld.

Dieser Artikel beschreibt die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf Präimplantations-Diagnostik (PGD) in einer klinischen Umgebung.

FISH für Präimplantations-Diagnostik

Die Präimplantationsdiagnostik (PID) ist eine etablierte Alternative zur Pränataldiagnostik und umfasst die Auswahl von Präimplantationsembryonen aus einer ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der fluoreszenzmarkierten in-situ-Zwei-Färbungshybridisierung die Geschlechtschromosomen- oder Translokationslage von in vitro gezüchteten menschlichen Embryonen mit erhöhtem Risiko für genetische Abnormalitäten zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem eine einzelne Zelle, die von einem Embryo am dritten Tag entnommen wurde, auf einem Objektträger lysiert und der Zellkern luftgetrocknet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die DNA des Zielkerns zu denaturieren und mit DNA-Sonden zu hybridisieren, die mit Fluorochromen unterschiedlicher Farbe markiert sind.Anschließend wird überschüssiger Sondenstoff durch eine stringente Wäsche entfernt und der Zellkern mit einem DNA-spezifischen fluoreszierenden Farbstoff angefärbt. Im letzten Schritt wird der Zellkern mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und digitale Bilder werden aufgenommen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Kopienzahl der gezielten chromosomalen Regionen mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigen.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da sie an der Grenze der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik liegt. Bereiten Sie 24 Stunden im Voraus den Zelllysepuffer zum Auftragen der Zellen vor. Filtern Sie die Lösung und portionieren Sie sie in Ein-Milliliter-Aliquote in 10 bis 15 sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 1,7 Milliliter. Verschließen und beschriften Sie die Röhrchen, bevor Sie sie kurz vor dem Biopsieverfahren bei minus 20 Grad Celsius einfrieren.Tauen Sie den Lysepuffer bei Raumtemperatur auf. Kennzeichnen Sie mit einem Diamantschreiber einen kleinen Kreis mit einem Durchmesser von etwa fünf Millimetern auf der Unterseite eines aminierten Objektträgers und beschriften Sie den Objektträger anschließend mit einem festen Vier-H-Bleistift als BLO, wobei Sie einen Latexhandschuh verwenden. Um Graphitstaub zu entfernen, verwenden Sie für jeden Blaster-Spiegel einen separaten Objektträger in numerischer Reihenfolge.Geben Sie nun eine kleine Menge Puffer für die Zelllyse innerhalb des Kreises hinzu. Überführen Sie den Biopsie-Blaster in den Lysispuffer. Fügen Sie nach Bedarf weiteren Lysispuffer hinzu, um die Zelle zu lysieren.Beobachten Sie den Zellkern, um sicherzustellen, dass er innerhalb des Kreises bleibt und nicht verloren geht. Falls die Zelle keinen Kern oder mehrere Kerne aufweist, entnehmen Sie eine Biopsie aus einer anderen Zelle. Lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.Zunächst die Proben in Coplan-Gefäßen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur vorwaschen. Anschließend zweimal mit steriler, destillierter Wasser spülen, mit einer Ethanolreihe jeweils zwei Minuten bei Raumtemperatur dehydrieren und an der Luft trocknen lassen. Sicherstellen, dass die Objektträger vollständig eingetaucht sind, und falls Graphitstaub an die Oberfläche aufsteigt, diesen mit einem sauberen Tuch aufsaugen.Notieren Sie die Position des Zellkerns innerhalb des Kreises durch Visualisierung mit einem Phasenkontrastmikroskop. Anschließend dehydrieren Sie die Proben zweimal mit 100 % Ethanol bei Raumtemperatur und lassen sie an der Luft trocknen. Geben Sie nun zwei Mikroliter der Sondemischung auf und bedecken Sie diese mit einem 9 × 9 mm großen Deckglas.Versiegeln Sie die Ränder der Deckglas mit Kautschukkleber. Führen Sie die codierte Denaturierung durch. Platzieren Sie es fünf Minuten lang auf einem Heizblock bei 75 Grad Celsius und hybridisieren Sie anschließend über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für jedes Kopplungsgefäß.Äquilibrieren Sie 50 Milliliter einer 0,4-fachen SSC-stringenten Waschlösung in einem Wasserbad bei 71 Grad Celsius. Stellen Sie die Flasche mit der stringenten Waschlösung und das leere Kopplungsgefäß bei Raumtemperatur in das Wasserbad, erhitzen Sie auf 71 Grad Celsius, stellen Sie den pH-Wert der stringenten Waschlösung ein und dekantieren Sie sie in Cochinsche Gefäße. Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Gummizement von jedem Objektträger und spülen Sie die Deckgläser mit vierfacher SSC, 0,05 % Tween 20, pH 7, bei Raumtemperatur ab.Waschen Sie die Proben im stringente Waschpuffer mit 0,4 × SSC bei 71 Grad Celsius für fünf Minuten, gefolgt von viermal SSC mit 0,05 % Tween 20 bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Bei indirekt markierten Sonden entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern und geben 20 Mikroliter fluoreszenzmarkierten Antikörper unter ein 20 × 20 Millimeter großes Parafilmquadrat. Inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.Entfernen Sie die Parafolie und führen Sie die folgenden Waschungen bei Raumtemperatur jeweils zweimal für zwei Minuten durch: einmal in viermal SSC mit 0,05 % Tween 20 und zweimal für zwei Minuten in PBS. Nach dem Abtropfen der Objektträger geben Sie sechs Mikroliter des Vector-Shield-Mounting-Mediums mit DAPI auf ein 22 mal 22 Millimeter großes Deckglas.Nummerieren Sie den Deckglaser und drehen Sie den Objektträger um, sodass er über dem Deckglas liegt. Tupfen Sie vorsichtig ab und versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack. Analysieren Sie die Proben abschließend mittels Fluoreszenzmikroskopie.Bewerten Sie jeden Kern durch zwei unabhängige Analysten. Verwenden Sie außerdem Bildgebungssoftware, um ein Bild des Kerns aufzunehmen, um die visuelle Diagnose zu bestätigen und zur Archivierung als Teil der Qualitätssicherung im Labor. Hier zeigen ein Metaphasepräparat und ein Interphasenkern, die aus peripheren Blutlymphozyten gewonnen wurden, einen Träger einer reziproken Translokation zwischen den kurzen Armen der Chromosomen fünf und neun mit Bruchpunkten bei fünf P 14.3 und neun P zwei, 4.1.Fish-Probe leuchten sowohl trans lokalisierte Segmente als auch das zentrische Segment der Chromosom-neun-Signale auf. In interfasischen Blastomerenkernen von Embryos des dritten Tages können Signale erfasst und anschließend zu einem zusammengesetzten Bild vereint werden. Zwei Signale für jede Sonde weisen auf zwei Kopien jedes Locus hin, was mit einem normalen oder ausgewogenen Chromosomensatz übereinstimmt.Bei den Translokationschromosomen zeigen farbige Signale eine Kopie des translozierten Segmentes von Chromosom fünf, drei Kopien des translozierten Segmentes von Chromosom neun und zwei Kopien des zentrischen Segmentes des CH-Chromosoms neun. Diese Daten stimmen mit einem unausgeglichenen Produkt einer Monosomie für 5p14.3 bis 5pt und einer Trisomie für 9p24.1 bis 9pt überein. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Einzelzelle, die aus einem menschlichen Embryo biopsiert wurde, analysiert und einen einzelnen Zellkern mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik vorbereitet.Dies ist wichtig, um reproduzierbare und optimale Testergebnisse zur Bestimmung des Geschlechtschromosomensatzes oder des Translokationsstatus eines Embryos zu erzielen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Gene-Funktion kann in loss-of-function Experimente verdeckt werden, wenn es eine Kompensation durch ein anderes Gen. Der Zebrafisch-Modell bietet eine relativ hohem Durchsatz, um eine solche funktionelle Redundanz in lebenden Embryonen zu offenbaren.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Dieses Protokoll beschreibt die Methode des Gene-Trap-Insertionsmutagenese mit Gal4-VP16 als primäre Reporter und GFP / RFP als Sekundär Reportern im Zebrafisch. Etwa einer von zehn hoch-exprimierenden F0 Fischertrag Genfallen Nachkommen Co-GFP und RFP. Das Screening-Verfahren kann leicht skaliert werden, um auf die Größe des Labors Durchführung der Insertionsmutagenese Bildschirm anzupassen.

Gene Trapping Mit Gal4 in Zebrafisch

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner genetischen Ähnlichkeit mit höheren Wirbeltieren ein leistungsfähiges Modellsystem für die Entwicklungsbiologie und die Erforschung menschlicher Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung haploider Zebrafischembryonen, die für Forward-Screening-Strategien verwendet werden können, um rezessive Mutationen in Genen zu identifizieren, die für die frühe Embryogenese essentiell sind.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

Eine einfache und effiziente Mikroinjektion Protokoll zur gen Bearbeitung im Channel Catfish Embryonen mit dem CRISPR/Cas9-System wird vorgestellt. In diesem Protokoll führen RNAs und Cas9 Protein wurden in das Eigelb von einzelligen Embryonen mikroinjiziert. Dieses Protokoll wurde bestätigt durch zwei Channel Catfish immunvermittelte Gene ausschlagen.

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Hier führen wir ein Halbleitersequenzierungsverfahren für Präimplantationsgentests für Aneuploidie (PGT-A) ein, mit den Vorteilen von kurzer Durchlaufzeit, niedrigen Kosten und hohem Durchsatz.

Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

Die frühe Entwicklung hängt von mütterlich vererbten Produkten ab, und die Rolle vieler dieser Produkte ist derzeit unbekannt. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das CRISPR-Cas9 verwendet, um mütterliche Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.

Bestimmung der Rolle von maternal exprimierten Genen in der frühen Entwicklung mit mütterlichen Crispants

Das Protokoll stellt die gesamten Laborverfahren dar, die für Präimplantations-Gentests auf Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Hier präsentieren wir die detaillierten Schritte der Amplifikation des gesamten Genoms, der DNA-Fragmentauswahl, des Bibliotheksaufbaus, der Template-Vorbereitung und des Sequenzierungs-Arbeitsablaufs mit repräsentativen Ergebnissen.

Präimplantations-Gentests für Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform

Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

Erfahren Sie die FISH-Technik zur genetischen Analyse von Einzelzellbiopsien menschlicher Embryonen für die Präimplantationsdiagnostik. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Bestimmung von Chromosomenanomalien vor der Implantation.

FISH für Präimplantations-Diagnostik

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