Name: Klonogene Test: adhärenter Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Lernen Sie den klonogenen Test für adhärente Zellen zur Bewertung der reproduktiven Zellviabilität nach Bestrahlung oder chemischer Behandlung. Diese etablierte Methode der Strahlenbiologie ermöglicht die Untersuchung der Strahlensensitivität verschiedener Zelllinien.

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Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. HR wird von einer australischen Post-Graduate-und BakerIDI hellen Funken Auszeichnungen unterstützt. Diese Arbeit wird durch die CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), gegründet und unterstützt unter der australischen Regierung Cooperative Research Centres-Programm finanziert. CO ist der Empfänger einer australischen Post-Graduate-Award und eine CRC-BID zusätzlichen Stipendium.

1. Cell Culture and Experimental Set-up <ol><li> Menschliche Keratinozyten werden als Monolayer in 75 cm 2 Zellkulturflaschen mit 15 ml Keratinozyten-SFM (K-SFM) gepflegt Medium (Gibco, serum-freiem Medium) mit L-Glutamin (2 mM), epidermal growth factor (5 ng ergänzt / mL), Rinder-Hypophysen-Extrakt (40 ug / ml) und 20 mg / mL Gentamicin. Die Zellen werden in einer befeuchteten 5% CO 2-Umgebung bei 37 ° C. </li><li> Die Zellen werden in 12 x 25 cm 2 Zellkulturflaschen mit 5 ml K-SFM Medium ausgesät. </li></ol> Einzel-Zell-Suspensionen werden durch Trypsinierung vorbereitet. Die Zellen werden gewaschen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung resuspendiert und mit einer 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung für 5-10 Minuten. Wenn die Zellen zu starten gerundet und ~ 30% sind freistehend, 3 Bände Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum hinzugefügt, um das Trypsin zu neutralisieren. Die Zellen werden durch Auf-und Abpipettieren (20 mal) abgelöst. Die Zellen werden gezählt unter Verwendung einer Zählkammer. Entsprechende Zellzahlen werden nach der Verdopplungszeit der Zell-Linie (ca. 20 Stunden für den menschlichen FEP-1811 Keratinozyten) ausgesät. Ziel ist es, ~ 90% Konfluenz (~ 10 6 Zellen pro Flasche) am Tag des Experiments zu erreichen. Ein Experiment, bestehend aus 12 Flaschen ist optimal für ein einzelnes klonogene Test (sechs unbestrahlten Kontrolle und sechs bestrahlten Kolben), die in etwa vier Stunden abgeschlossen werden kann. 2. Behandlung und Bestrahlung <ol><li> Treat-Zellen für eine angemessene Zeit mit einer entsprechenden Strahlung modifizierenden Verbindung und setzen Zellen gegenüber ionisierender Strahlung entweder γ-Strahlung oder Röntgenstrahlung. </li></ol> In der Regel sechs Flaschen dienen als Platierungseffizienz (unbehandelt) und Medikament nur Kontrollen. Die anderen sechs Flaschen werden bestrahlt. , Eine wasserlösliche natürliche Antioxidans Formulierung, für 1 Stunde in diesem Beispiel humaner Keratinozyten mit verschiedenen Konzentrationen von Cinnulin PF (; Integrität Nutraceuticals International, Spring Hill, TN, USA repräsentative Daten für 20 ug / mL ist unten dargestellt CPF) behandelt bei 37 ° C. Die Zellen werden mit 4 Gy mit einer 137 Cs-Quelle (; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min Gammacell 1000 Elite Strahler) bestrahlt. 3. Plating <ol><li> Nach der Behandlung werden einzelne Zellsuspensionen erhalten, wie oben beschrieben. </li><li> Die Anzahl der Zellen in jeder Probe gezählt werden vorsichtig mit einer Zählkammer und so verdünnt, dass geeignete Zellzahlen in Petrischalen ausgesät werden (fünf Wiederholungen der einzelnen in 15 mm Schalen). Die Platierungseffizienz und / oder überlebenden Anteil sollte erwarten, wenn die Entscheidung die Anzahl der Zellen, um Samen pro Platte werden. Das Ziel ist es, einen Bereich zwischen 20 erreichen - 150 Kolonien. </li> Petrischalen werden in einem befeuchteten Kunststoff Klonen Feld angeordnet und inkubiert in einer 5% CO 2-Umgebung bei 37 ° C für Kolonie-Bildung. </ol> Die Inkubationszeit für Koloniebildung variiert von 1-3 Wochen für die verschiedenen Zelllinien, es wird angenommen, dass die Zeit entsprechen müssen mindestens sechs Zellteilungen. In diesem Beispiel erfordern die Kontrolle Gerichte für die menschliche Keratinozyten acht Tage, um ausreichend große Klone, bestehend aus 50 oder mehr Zellen zu bilden. 4. Fixierung und Färbung Colonies Führen Sie die folgenden Schritte in einer Abzugshaube. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jeder der Platten durch Aspiration. </li><li> Wash jede Platte mit 5 ml 0,9% iger Kochsalzlösung. </li><li> Fix die Kolonien mit 5 ml 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung für 15-30 Minuten. </li><li> Stain mit 5 ml 0,01% (w / v) Kristallviolett in dH 2 O für 30-60 Minuten. </li><li> Wash überschüssige Kristallviolett mit dH 2 O und ermöglichen Geschirr nicht richtig getrocknet. </li></ol> 5. Colony Counting Stereomikroskop <ol><li> Kolonien mit mehr als 50 einzelnen Zellen werden gezählt mit einem Stereomikroskop. </li></ol> Digital Imaging und Zählen mit Imaging-Software <ol><li> Digitale Bilder von den Kolonien werden unter Verwendung einer Kamera oder einem Scanner </li><li> Kolonien gezählt mit bildgebenden Analyse-Software-Pakete wie unten beschrieben. </li></ol> Zellzählung mit ImageJ (Fidschi Version 1.44a) <ol><li> Öffnen Sie die Bilddatei in Fiji, gehen Sie zu File -&gt; Open. </li><li> &gt; Anpassen ...-&gt; Threshold - Bei Bedarf konvertieren Sie das Bild in 8-Bit-Format, um Bild zu gehen. </li><li> Passen Schwelle auf ein Niveau von unspezifischen Hintergrund zu reduzieren, so dass nur die Kolonien erkannt werden. </li><li> Graf Kolonien mit den folgenden: go to Process -&gt; Binary -&gt; Find Maxima. </li></ol> Für dieses Bildformat, kann Rausch Toleranz auf 0 gesetzt werden. Stellen Sie sicher, dass hellem Hintergrund Option aktiviert ist und eine Vorschau der erkannt Maxima zu prüfen, ob alle Zellkolonien wurden korrekt registriert.

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+x-rays+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Action of x-rays on mammalian cells.</a> J Exp Med. 103, 653-666 (1956).</li>
<li>Hurlin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).</li>
</ol>

In diesem Beispiel menschliche FEP-1811 Keratinozyten wurden mit verschiedenen Konzentrationen von bis zu 100 pg / mL CPF behandelt; Daten werden für 20 ug / mL CPF für 1 Stunde bei 37 ° C gezeigt Nach der Behandlung wurden die Zellen mit 4 Gy mit einer 137 Cs-Quelle (; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min Gammacell 1000 Elite Strahler) bestrahlt. Für die Kontrolle unbehandelt und Drogen nur Behandlungen 100 Zellen wurden in jeder Petrischale und 1000 Zellen pro Schale wurden die bestrahlten Proben...

<table><tbody><tr><td>Keratinozyten-Serum-freies Medium</td><td>Wachstumsmedium</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Zusätzlich mit 2 mM L-Glutamin, 20&amp;#x03BC;g/ml Gentamicin, epidermalem Wachstumsfaktor und Extrakt aus Rinderhypophyse versetzt.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>0,05 % Trypsin / EDTA zur Ablösung adhärenter Zellen; 10-facher Konzentratansatz wird in PBS ohne Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; verdünnt.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes essentielles Medium</td><td>Wachstumsmedium</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td>Mit 10 % FBS und 20&amp;#x03BC;g/ml Gentamicin ergänzt; dient zur Neutralisierung von Trypsin/EDTA.</td></tr><tr><td>0,09 % Salzlösung</td><td>Lösung</td><td></td><td></td><td>Wird zum Waschen der Kolonien verwendet.</td></tr><tr><td>10 % neutrale gepufferte Formalinlösung</td><td>Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>~4 % Formaldehyd; dient zur Fixierung der Kolonien.</td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Pulver</td><td>SPI Supplies</td><td>02577-MB</td><td>0,01 % Kristallviolett-Lösung, hergestellt in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, zur Färbung der Kolonien verwendet.</td></tr><tr><td>Gammacell 1000 elite Bestrahler</td><td></td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri-Schalen</td><td>60 × 15 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Blutkörperchenzählkammer</td><td></td><td>Hawksley; Medical and Laboratory Equipment</td><td>AC1000</td><td></td></tr><tr><td>Klonierbox</td><td></td><td></td><td></td><td>Plastikbox mit Löchern an gegenüberliegenden Seiten des Deckels; dient zum Lagern von Petrischalen während der langen Inkubation zur Koloniebildung.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Typ 102</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Wird zum Zählen von Kolonien verwendet, die aus &amp;gt;50 Zellen bestehen.</td></tr></tbody></table>

klonogene test: adhärenter zellen

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Die klonogenen (oder koloniebildende)-Assay wurde für mehr als 50 Jahren besteht; die ursprüngliche Papier beschreibt die Technik wurde in 1956 1 veröffentlicht. Abgesehen von der Dokumentation der Methode erzielte das erste Meilenstein-Studie die erste Strahlung Dosis-Wirkungs-Kurve für X-ray bestrahlt Säugetieren (HeLa) Zellen in Kultur 1. Grundsätzlich ermöglicht die klonogene Test eine Bewertung der Unterschiede in der reproduktiven Lebensfähigkeit (Kapazität der Zellen auf die Nachkommen zu produzieren, dh eine einzelne Zelle, um eine Kolonie von 50 oder mehr Zellen zu bilden) zwischen Kontrolle unbehandelte Zellen und Zellen, die verschiedene Behandlungen wie Belichtung unterzogen haben auf ionisierende Strahlung, verschiedene chemische Verbindungen (zB Zytostatika) oder in anderen Fällen genetische Manipulation. Der Test hat sich die am weitesten akzeptierte Methode in der Strahlenbiologie und wurde vielfach zur Beurteilung der Strahlenempfindlichkeit verschiedener Zelllinien verwendet. Weiterhin ist die klonogenen allgemein zur Überwachung der Wirksamkeit von Strahlung modifizierende Verbindungen und zur Bestimmung der Wirkung von Zytostatika und anderen Anti-Krebs-Therapeutika auf Basis der Kolonie-bildende Fähigkeit, in verschiedene Zelllinien verwendet. Ein typisches klonogenen Überleben Experiment mit adhärenten Zellen Zeilen umfasst drei Komponenten, 1) Behandlung der Zellrasen in Zellkulturflaschen, 2) Vorbereitung der einzelnen Zellsuspensionen und Beschichtung eine entsprechende Anzahl von Zellen in Petrischalen und 3) Fixierung und Färbung Kolonien nach einer entsprechenden Inkubationszeit könnte, die von 1-3 Wochen liegen, je nach Zelllinie. Hier zeigen wir das allgemeine Verfahren für die Durchführung der klonogene Test mit adhärenten Zelllinien mit dem Einsatz von einer immortalisierten humanen Keratinozyten-Zelllinie (FEP-1811) 2. Auch sind unsere Ziele zu gemeinsamen Merkmale der klonogenen Assays einschließlich Berechnung der Platierungseffizienz und Überleben Fraktionen nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung zu beschreiben, und Änderungen der Strahlung-Response mit dem Einsatz von ein natürliches Antioxidans Formulierung zu veranschaulichen.

Die Anwendbarkeit des klonogene Test zur Bewertung der reproduktiven Überlebensfähigkeit seit mehr als 50 Jahren etabliert. Hier zeigen wir das allgemeine Verfahren für die Durchführung der klonogene Test mit adhärenten Zellen.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

Der klonogene Assay (oder Koloniebildungsassay) ist seit mehr als 50 Jahren etabliert; die ursprüngliche Arbeit, in der die Technik beschrieben wurde, wurde 1956 veröffentlicht1. ...

Hallo, ich heiße Lum und absolviere derzeit meine Promotion am BE IDI Heart and Diabetes Institute unter der Betreuung von Dr. Tom Carianne, Leiter des Labors für Epigenomische Medizin. In diesem Video werde ich das Verfahren namens Clon Genic Survival Assay demonstrieren. Dabei handelt es sich um eine 50 Jahre alte Technik, die es ermöglicht, die Auswirkungen verschiedener Behandlungen – wie beispielsweise die Exposition gegenüber Strahlung oder chemischen Substanzen – auf die reproduktive Zellviabilität zu bewerten.Der konogene Überlebensassay ist eine zentrale Technik in der Strahlenbiologie, um die Strahlenempfindlichkeit verschiedener Zelllinien zu bewerten und die Wirksamkeit unterschiedlicher strahlenschützender oder strahlensensibilisierender Verbindungen zu testen. Bei Verwendung einer adhärenten Zelllinie besteht der kryogene Überlebensassay aus drei Phasen. Zunächst die Behandlung einer Monoschicht adhärer Zellen.Zweitens die Herstellung einer Einzelzell-Suspension und das Ausplattieren einer bekannten Anzahl von Zellen auf beschichteten Platten sowie drittens die Färbung, Zählung und die nach einer Inkubationszeit gebildeten Kolonien. In diesem Video verwende ich immortalisierte humane Cino-Zellen, um zu demonstrieren, wie der polygenische Bibel-Assay genutzt werden kann, um die strahlenschützenden Eigenschaften des natürlichen Antioxidans zu bestimmen. 1225-Flaschen werden mit Zellen in fünf Milliliter Medium vorher beimpft, sodass am Tag des Experiments eine Million Zellen pro Flasche vorliegen.50 µL der Droge werden in verschiedenen Konzentrationen zu den fünf Millilitern Medium in jedem entsprechend beschrifteten Kolben hinzugefügt, um die erforderliche Konzentration zu erreichen; fünf Konzentrationen werden verwendet, sowie in diesem Fall eine Fahrzeugkontrolle (PBS). Nach Zugabe der Droge werden die Zellen eine Stunde lang unter für die verwendete Zelllinie geeigneten Bedingungen inkubiert. Die Proben, ausgenommen die Kontrollgruppe, werden nach der Inkubation mit der gewählten Dosis bestrahlt, die in diesem Fall vier Gray beträgt und von einer Cäsiumquelle mit Gammastrahlung erzeugt wird.Nach der Bestrahlung wird das Medium abgegossen und jeder Kolben wird mit zwei Milliliter PBS fünf Minuten lang gewaschen. Nach dem Abgießen des PBS werden zwei Milliliter 0,05 %iger Trypsin zu jedem Kolben hinzugefügt, um die anhaftenden A-Zellen vom Kolben zu lösen. Anschließend werden fünf Milliliter DMEM, die 10 % fetalen Kälberserum enthalten, zu jedem Kolben gegeben, um die Trypsinwirkung zu stoppen.Der gesamte Inhalt der Fasc wird anschließend in beschriftete 10-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführt. Nach Abschluss werden diese Röhrchen fünf Minuten lang zentrifugiert, wonach das Überstandsmaterial vorsichtig entfernt wird, ohne das Pellet zu stören, und jeweils fünf Milliliter Crezy-Medium zu jedem Röhrchen hinzugefügt wird. Die Zellkonzentration jeder Probe wird ermittelt, ebenso das erforderliche Volumen jeder Probe, um eine Endkonzentration der Zellen zu erreichen, die daraufhin auf fünf Petrischalen pro Probe mit jeweils fünf Milliliter Medium ausplattiert werden.Beispielsweise werden für die Kontrollgruppe 100 Zellen pro Petrischale ausplattiert, daher wird das Volumen berechnet, das benötigt wird, um 500 Zellen pro 25 Milliliter zu erreichen. Bei konzentrierteren Proben wird entweder eine 10-fache Verdünnung oder eine 100-fache serielle Verdünnung durchgeführt, um den Fehler zu minimieren, der bei der Verwendung von Volumina unter 100 Mikrolitern entsteht. Das zuvor berechnete Volumen wird nun in ein Falcon-Röhrchen gegeben, das für jede Probe 25 Milliliter Medium enthält. Die Proben können nun in zuvor beschriftete Petrischalen überführt werden, wobei fünf Milliliter pro Schale zugegeben werden, um die Handhabung und den Transport zu erleichtern.Bewahren Sie die Schalen in einem großen, sterilen oder desinfizierten Behälter auf. Anschließend werden die Schalen unter geeigneten Bedingungen in einen befeuchteten Inkubator gestellt und acht Tage lang inkubiert. Wenn Keratinozyten nach acht Tagen verwendet werden sollen, nehmen Sie die Schalen vorsichtig aus dem Inkubator und legen Sie sie einzeln in einer Abzugshaube aus.Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit der Platte, damit eventuell gebildete Kolonien nicht gestört werden. Entfernen Sie die Deckel und geben Sie fünf ml 0,9 % Salzlösung in jede Schale, um sie zu spülen. Zielen Sie mit der Pipettenspitze in die Ecke der Schale und vermeiden Sie es, den Boden der Schale zu berühren, damit keine Kolonien versehentlich abgeschabt werden.Nach fünf Minuten vorsichtig die Kochsalzlösung abpipettieren. Nun werden die Kolonien mit drei Milliliter 4%iger Formulierung fixiert, und die Deckel müssen ersetzt werden, um Verdunstung zu vermeiden. Nach 15 Minuten bis einer halben Stunde wird die Formulierung abpipettierter und fachgerecht entsorgt.Die Kolonien können nun mit 0,1 % Kristallviolett angefärbt werden; fünf Milliliter werden jeder Schale zugesetzt, und die Deckel werden nach einer halben bis einer Stunde wieder aufgesetzt. Der Farbstoff wird anschließend mit destilliertem Wasser abgespült, und die Schalen werden umgedreht und über Nacht trocknen gelassen. Die Kolonien können nun gezählt werden.Die Kolonien können manuell mithilfe eines Stereomikroskops gezählt werden. Jeder Zellverbund mit 50 oder mehr Zellen gilt als Kolonie. Damit ist unsere Demonstration des kongenen Überlebensassays abgeschlossen.Der Hauptvorteil dieses Assays gegenüber anderen Techniken liegt in seiner außerordentlichen Empfindlichkeit, die es ermöglicht, das Überleben über einen weiten Bereich hinweg nachzuweisen, selbst nach einer Reduktion der Zellzahl um sechs Größenordnungen. Diese Empfindlichkeit wird durch das Ausplattieren größerer Zellzahlen erreicht. Dieser Assay kann leicht auch für andere Zwecke verwendet werden, beispielsweise zur Prüfung der Zytotoxizität.Vielen Dank fürs Zuschauen.

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Forschung

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Biology

Biologie

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