Klonogene Test: adhärenter Zellen

Hallo, mein Name ist Lum und ich promoviere derzeit am BE IDI Heart and Diabetes Institute unter der Aufsicht von Dr. Tom Carianne, dem Leiter des Epigenomic Medicine Lab. In diesem Video werde ich das Verfahren demonstrieren, das als Clon Genic Survival Assay bekannt ist. Dabei handelt es sich um eine 50 Jahre alte Technik, die es ermöglicht, die Auswirkungen verschiedener Behandlungen, wie z. B. die Exposition gegenüber Strahlung oder chemischen Stoffen, auf die zelluläre Fortpflanzungsfähigkeit zu bewerten.

Der kongene Überlebensassay ist eine zentrale Technik in der Strahlenbiologie zur Bewertung der Strahlenempfindlichkeit verschiedener Zelllinien und zur Prüfung der Wirksamkeit verschiedener strahlenschützender oder radiosensibilisierender Verbindungen. Bei Verwendung einer A-adhärenten Zelllinie besteht der kryogene Survival-Assay aus drei Phasen. Zunächst die Behandlung einer Monoschicht einer adhärenten Zelle.

Zweitens die Herstellung einer Einzelzellsuspension und das Plattieren einer bekannten Anzahl von Zellen und bemalten Schalen, und drittens das Färben, Zählen und die nach einer Inkubationsperiode gebildeten Kolonien. In diesem Video werde ich immortalisierte, menschliche Zellen an der Zinostelle verwenden, um zu demonstrieren, wie polygene Bibel-Assays verwendet werden können, um die strahlenschützenden Eigenschaften des natürlichen Antioxidans zu bestimmen. 1225 M Flas werden vorher von Zellen in fünf mil Medium ausgesät, so dass am Tag des Experiments 1 Million Zellen pro Kolben vorhanden sind.

50 Mikroliter des Arzneimittels werden in unterschiedlichen Konzentrationen zu den fünf mil des Mediums in jedem entsprechend gekennzeichneten Kolben gegeben, um die erforderliche Konzentration zu erreichen, es werden fünf Konzentrationen sowie in diesem Fall eine Vehikelkontrolle, PBS, verwendet. Nach der Zugabe des Arzneimittels werden die Zellen eine Stunde lang unter den Bedingungen inkubiert, die für die nach der Inkubation verwendete Zelllinie geeignet sind. Der Flussmittel, ohne die Kontrollgruppe, wird mit der gewählten Dosierung bestrahlt, die in diesem Fall vier Grau beträgt, die von einer Gammastrahlen emittierenden Cäsiumquelle erzeugt werden.

Nach der Bestrahlung werden die Medien abgegossen und jeder Kolben wird fünf Minuten lang mit zwei mil PBS gewaschen. Nach dem Abgießen des PBS werden zwei mil 0,05%Trypsin in jeden Kolben gegeben, um die A-adhärenten Zellen aus dem Kolben zu lösen. Die unteren fünf Milliliter DMEM, die 10 % fötales Rinderserum enthalten, werden dann in jeden Kolben gegeben, um das Trypsin zu deaktivieren.

Der gesamte Inhalt des Fasc wird dann in markierte 10-Milliliter-Falkenröhrchen überführt. Sobald diese Röhrchen fertig sind, werden sie fünf Minuten lang zentrifugiert, danach wird der Supinator vorsichtig verworfen, ohne den Gaumen zu stören, und jedem Röhrchen werden fünf mil Crecy-Medium zugesetzt. Die Konzentration der Zellen für jede Probe wird ENC berechnet, ebenso wie das Volumen, das für jede Probe benötigt wird, um die endgültige Konzentration der Zellen zu erreichen, die in fünf Petrischalen pro Probe mit jeweils fünf Millilitern Medium ausplattiert werden.

Zum Beispiel werden für die Kontrollgruppe 100 Zellen pro Schale plattiert, so dass das Volumen, das benötigt wird, um 500 Zellen pro 25 Milliliter zu erreichen, für konzentriertere Proben berechnet wird, führen Sie entweder eine 10-fache Verdünnung oder eine 100-fache serielle Verdünnung durch, um den Fehler zu minimieren, der bei der Verwendung von Volumina von weniger als 100 Mikrolitern auftritt. Nun wird das zuvor berechnete Volumen in ein Falcon-Röhrchen mit 25 Millilitern Medium für jede Probe aufbereitet. Die Proben können nun in zuvor etikettierte Pre-to-Schalen überführt werden, wobei jeder Schale fünf Milliliter hinzugefügt werden, um die Handhabung und den Transport zu erleichtern.

Bewahren Sie das Geschirr in einem großen, sterilen oder desinfizierten Behälter auf. Die Schalen werden dann unter den entsprechenden Bedingungen in einen befeuchteten Inkubator gestellt und acht Tage lang inkubiert. Wenn Sie Keratinozyten nach acht Tagen verwenden, nehmen Sie die Schalen vorsichtig aus dem Inkubator und legen Sie sie alle nacheinander in einen Abzug.

Achten Sie darauf, den Ort vorsichtig zu behandeln, damit die gebildeten Kolonien nicht gestört werden. Entfernen Sie die Deckel und geben Sie fünf ml 0,9%ige Kochsalzlösung in jedes Geschirr, um sie zu waschen. Richten Sie die Zubereitungsspitze in die Ecke der Schüssel und vermeiden Sie es, den Boden der Schüssel zu berühren, damit nicht versehentlich Kolonien abgekratzt werden.

Nach fünf Minuten die Kochsalzlösung vorsichtig absaugen. Jetzt werden die Kolonien mit drei Millilitern 4%-Formel fixiert, und die Elektroden müssen ausgetauscht werden, um eine Verdunstung zu vermeiden. Nach 15 Minuten bis zu einer halben Stunde wird die Säuglingsnahrung abgesaugt und fachgerecht entsorgt.

Die Kolonien sind nun bereit, mit 0,1%Kristallviolett gefärbt zu werden, fünf Milliliter werden in jede Schale gegeben und die Deckel werden nach einer halben bis einer Stunde wieder aufgesetzt. Anschließend wird die Farbe mit destilliertem Wasser abgewaschen und das Geschirr wird umgedreht und über Nacht trocknen gelassen. Die Völker sind jetzt bereit, gezählt zu werden.

Die Kolonien können manuell mit einem Präpariermikroskop gezählt werden. Jeder Zellhaufen, der 50 oder mehr Zellen enthält, gilt als Kolonie. Und damit ist unsere Demonstration des Congenic Survival Assays abgeschlossen.

Der Hauptvorteil dieses Assays gegenüber anderen Techniken besteht darin, dass er unglaublich empfindlich ist und das Überleben über einen großen Bereich nachweisen kann, selbst nach sechs Protokollen Zelltötung. Dies, diese Empfindlichkeit, wird durch das Plattieren größerer Zellzahlen erreicht. Dieser Aufsatz kann leicht für andere Zwecke verwendet werden, z. B. für Tests, wie z. B. Tests der Zytotoxizität.

Danke fürs Zuschauen.