Name: Klonogene Test: adhärenter Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Lernen Sie den klonogenen Test für adhärente Zellen zur Bewertung der reproduktiven Zellviabilität nach Bestrahlung oder chemischer Behandlung. Diese etablierte Methode der Strahlenbiologie ermöglicht die Untersuchung der Strahlensensitivität verschiedener Zelllinien.

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Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. HR wird von einer australischen Post-Graduate-und BakerIDI hellen Funken Auszeichnungen unterstützt. Diese Arbeit wird durch die CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), gegründet und unterstützt unter der australischen Regierung Cooperative Research Centres-Programm finanziert. CO ist der Empfänger einer australischen Post-Graduate-Award und eine CRC-BID zusätzlichen Stipendium.

1. Cell Culture and Experimental Set-up <ol><li> Menschliche Keratinozyten werden als Monolayer in 75 cm 2 Zellkulturflaschen mit 15 ml Keratinozyten-SFM (K-SFM) gepflegt Medium (Gibco, serum-freiem Medium) mit L-Glutamin (2 mM), epidermal growth factor (5 ng ergänzt / mL), Rinder-Hypophysen-Extrakt (40 ug / ml) und 20 mg / mL Gentamicin. Die Zellen werden in einer befeuchteten 5% CO 2-Umgebung bei 37 ° C. </li><li> Die Zellen werden in 12 x 25 cm 2 Zellkulturflaschen mit 5 ml K-SFM Medium ausgesät. </li></ol> Einzel-Zell-Suspensionen werden durch Trypsinierung vorbereitet. Die Zellen werden gewaschen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung resuspendiert und mit einer 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung für 5-10 Minuten. Wenn die Zellen zu starten gerundet und ~ 30% sind freistehend, 3 Bände Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum hinzugefügt, um das Trypsin zu neutralisieren. Die Zellen werden durch Auf-und Abpipettieren (20 mal) abgelöst. Die Zellen werden gezählt unter Verwendung einer Zählkammer. Entsprechende Zellzahlen werden nach der Verdopplungszeit der Zell-Linie (ca. 20 Stunden für den menschlichen FEP-1811 Keratinozyten) ausgesät. Ziel ist es, ~ 90% Konfluenz (~ 10 6 Zellen pro Flasche) am Tag des Experiments zu erreichen. Ein Experiment, bestehend aus 12 Flaschen ist optimal für ein einzelnes klonogene Test (sechs unbestrahlten Kontrolle und sechs bestrahlten Kolben), die in etwa vier Stunden abgeschlossen werden kann. 2. Behandlung und Bestrahlung <ol><li> Treat-Zellen für eine angemessene Zeit mit einer entsprechenden Strahlung modifizierenden Verbindung und setzen Zellen gegenüber ionisierender Strahlung entweder γ-Strahlung oder Röntgenstrahlung. </li></ol> In der Regel sechs Flaschen dienen als Platierungseffizienz (unbehandelt) und Medikament nur Kontrollen. Die anderen sechs Flaschen werden bestrahlt. , Eine wasserlösliche natürliche Antioxidans Formulierung, für 1 Stunde in diesem Beispiel humaner Keratinozyten mit verschiedenen Konzentrationen von Cinnulin PF (; Integrität Nutraceuticals International, Spring Hill, TN, USA repräsentative Daten für 20 ug / mL ist unten dargestellt CPF) behandelt bei 37 ° C. Die Zellen werden mit 4 Gy mit einer 137 Cs-Quelle (; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min Gammacell 1000 Elite Strahler) bestrahlt. 3. Plating <ol><li> Nach der Behandlung werden einzelne Zellsuspensionen erhalten, wie oben beschrieben. </li><li> Die Anzahl der Zellen in jeder Probe gezählt werden vorsichtig mit einer Zählkammer und so verdünnt, dass geeignete Zellzahlen in Petrischalen ausgesät werden (fünf Wiederholungen der einzelnen in 15 mm Schalen). Die Platierungseffizienz und / oder überlebenden Anteil sollte erwarten, wenn die Entscheidung die Anzahl der Zellen, um Samen pro Platte werden. Das Ziel ist es, einen Bereich zwischen 20 erreichen - 150 Kolonien. </li> Petrischalen werden in einem befeuchteten Kunststoff Klonen Feld angeordnet und inkubiert in einer 5% CO 2-Umgebung bei 37 ° C für Kolonie-Bildung. </ol> Die Inkubationszeit für Koloniebildung variiert von 1-3 Wochen für die verschiedenen Zelllinien, es wird angenommen, dass die Zeit entsprechen müssen mindestens sechs Zellteilungen. In diesem Beispiel erfordern die Kontrolle Gerichte für die menschliche Keratinozyten acht Tage, um ausreichend große Klone, bestehend aus 50 oder mehr Zellen zu bilden. 4. Fixierung und Färbung Colonies Führen Sie die folgenden Schritte in einer Abzugshaube. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jeder der Platten durch Aspiration. </li><li> Wash jede Platte mit 5 ml 0,9% iger Kochsalzlösung. </li><li> Fix die Kolonien mit 5 ml 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung für 15-30 Minuten. </li><li> Stain mit 5 ml 0,01% (w / v) Kristallviolett in dH 2 O für 30-60 Minuten. </li><li> Wash überschüssige Kristallviolett mit dH 2 O und ermöglichen Geschirr nicht richtig getrocknet. </li></ol> 5. Colony Counting Stereomikroskop <ol><li> Kolonien mit mehr als 50 einzelnen Zellen werden gezählt mit einem Stereomikroskop. </li></ol> Digital Imaging und Zählen mit Imaging-Software <ol><li> Digitale Bilder von den Kolonien werden unter Verwendung einer Kamera oder einem Scanner </li><li> Kolonien gezählt mit bildgebenden Analyse-Software-Pakete wie unten beschrieben. </li></ol> Zellzählung mit ImageJ (Fidschi Version 1.44a) <ol><li> Öffnen Sie die Bilddatei in Fiji, gehen Sie zu File -&gt; Open. </li><li> &gt; Anpassen ...-&gt; Threshold - Bei Bedarf konvertieren Sie das Bild in 8-Bit-Format, um Bild zu gehen. </li><li> Passen Schwelle auf ein Niveau von unspezifischen Hintergrund zu reduzieren, so dass nur die Kolonien erkannt werden. </li><li> Graf Kolonien mit den folgenden: go to Process -&gt; Binary -&gt; Find Maxima. </li></ol> Für dieses Bildformat, kann Rausch Toleranz auf 0 gesetzt werden. Stellen Sie sicher, dass hellem Hintergrund Option aktiviert ist und eine Vorschau der erkannt Maxima zu prüfen, ob alle Zellkolonien wurden korrekt registriert.

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+x-rays+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Action of x-rays on mammalian cells.</a> J Exp Med. 103, 653-666 (1956).</li>
<li>Hurlin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).</li>
</ol>

In diesem Beispiel menschliche FEP-1811 Keratinozyten wurden mit verschiedenen Konzentrationen von bis zu 100 pg / mL CPF behandelt; Daten werden für 20 ug / mL CPF für 1 Stunde bei 37 ° C gezeigt Nach der Behandlung wurden die Zellen mit 4 Gy mit einer 137 Cs-Quelle (; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min Gammacell 1000 Elite Strahler) bestrahlt. Für die Kontrolle unbehandelt und Drogen nur Behandlungen 100 Zellen wurden in jeder Petrischale und 1000 Zellen pro Schale wurden die bestrahlten Proben...

<table><tbody><tr><td>Keratinozyten-Serum-freies Medium</td><td>Wachstumsmedium</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Zusätzlich mit 2 mM L-Glutamin, 20&amp;#x03BC;g/ml Gentamicin, epidermalem Wachstumsfaktor und Extrakt aus Rinderhypophyse versetzt.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>0,05 % Trypsin / EDTA zur Ablösung adhärenter Zellen; 10-facher Konzentratansatz wird in PBS ohne Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; verdünnt.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes essentielles Medium</td><td>Wachstumsmedium</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td>Mit 10 % FBS und 20&amp;#x03BC;g/ml Gentamicin ergänzt; dient zur Neutralisierung von Trypsin/EDTA.</td></tr><tr><td>0,09 % Salzlösung</td><td>Lösung</td><td></td><td></td><td>Wird zum Waschen der Kolonien verwendet.</td></tr><tr><td>10 % neutrale gepufferte Formalinlösung</td><td>Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>~4 % Formaldehyd; dient zur Fixierung der Kolonien.</td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Pulver</td><td>SPI Supplies</td><td>02577-MB</td><td>0,01 % Kristallviolett-Lösung, hergestellt in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, zur Färbung der Kolonien verwendet.</td></tr><tr><td>Gammacell 1000 elite Bestrahler</td><td></td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri-Schalen</td><td>60 × 15 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Blutkörperchenzählkammer</td><td></td><td>Hawksley; Medical and Laboratory Equipment</td><td>AC1000</td><td></td></tr><tr><td>Klonierbox</td><td></td><td></td><td></td><td>Plastikbox mit Löchern an gegenüberliegenden Seiten des Deckels; dient zum Lagern von Petrischalen während der langen Inkubation zur Koloniebildung.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Typ 102</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Wird zum Zählen von Kolonien verwendet, die aus &amp;gt;50 Zellen bestehen.</td></tr></tbody></table>

klonogene test: adhärenter zellen

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Die klonogenen (oder koloniebildende)-Assay wurde für mehr als 50 Jahren besteht; die ursprüngliche Papier beschreibt die Technik wurde in 1956 1 veröffentlicht. Abgesehen von der Dokumentation der Methode erzielte das erste Meilenstein-Studie die erste Strahlung Dosis-Wirkungs-Kurve für X-ray bestrahlt Säugetieren (HeLa) Zellen in Kultur 1. Grundsätzlich ermöglicht die klonogene Test eine Bewertung der Unterschiede in der reproduktiven Lebensfähigkeit (Kapazität der Zellen auf die Nachkommen zu produzieren, dh eine einzelne Zelle, um eine Kolonie von 50 oder mehr Zellen zu bilden) zwischen Kontrolle unbehandelte Zellen und Zellen, die verschiedene Behandlungen wie Belichtung unterzogen haben auf ionisierende Strahlung, verschiedene chemische Verbindungen (zB Zytostatika) oder in anderen Fällen genetische Manipulation. Der Test hat sich die am weitesten akzeptierte Methode in der Strahlenbiologie und wurde vielfach zur Beurteilung der Strahlenempfindlichkeit verschiedener Zelllinien verwendet. Weiterhin ist die klonogenen allgemein zur Überwachung der Wirksamkeit von Strahlung modifizierende Verbindungen und zur Bestimmung der Wirkung von Zytostatika und anderen Anti-Krebs-Therapeutika auf Basis der Kolonie-bildende Fähigkeit, in verschiedene Zelllinien verwendet. Ein typisches klonogenen Überleben Experiment mit adhärenten Zellen Zeilen umfasst drei Komponenten, 1) Behandlung der Zellrasen in Zellkulturflaschen, 2) Vorbereitung der einzelnen Zellsuspensionen und Beschichtung eine entsprechende Anzahl von Zellen in Petrischalen und 3) Fixierung und Färbung Kolonien nach einer entsprechenden Inkubationszeit könnte, die von 1-3 Wochen liegen, je nach Zelllinie. Hier zeigen wir das allgemeine Verfahren für die Durchführung der klonogene Test mit adhärenten Zelllinien mit dem Einsatz von einer immortalisierten humanen Keratinozyten-Zelllinie (FEP-1811) 2. Auch sind unsere Ziele zu gemeinsamen Merkmale der klonogenen Assays einschließlich Berechnung der Platierungseffizienz und Überleben Fraktionen nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung zu beschreiben, und Änderungen der Strahlung-Response mit dem Einsatz von ein natürliches Antioxidans Formulierung zu veranschaulichen.

Die Anwendbarkeit des klonogene Test zur Bewertung der reproduktiven Überlebensfähigkeit seit mehr als 50 Jahren etabliert. Hier zeigen wir das allgemeine Verfahren für die Durchführung der klonogene Test mit adhärenten Zellen.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

Der klonogene Assay (oder Koloniebildungsassay) ist seit mehr als 50 Jahren etabliert; die ursprüngliche Arbeit, in der die Technik beschrieben wurde, wurde 1956 veröffentlicht1. ...

Hallo, ich heiße Lum und absolviere derzeit meine Promotion am BE IDI Heart and Diabetes Institute unter der Betreuung von Dr. Tom Carianne, Leiter des Labors für Epigenomische Medizin. In diesem Video werde ich das Verfahren namens Clon Genic Survival Assay demonstrieren. Dabei handelt es sich um eine 50 Jahre alte Technik, die es ermöglicht, die Auswirkungen verschiedener Behandlungen – wie beispielsweise die Exposition gegenüber Strahlung oder chemischen Substanzen – auf die reproduktive Zellviabilität zu bewerten.Der konogene Überlebensassay ist eine zentrale Technik in der Strahlenbiologie, um die Strahlenempfindlichkeit verschiedener Zelllinien zu bewerten und die Wirksamkeit unterschiedlicher strahlenschützender oder strahlensensibilisierender Verbindungen zu testen. Bei Verwendung einer adhärenten Zelllinie besteht der kryogene Überlebensassay aus drei Phasen. Zunächst die Behandlung einer Monoschicht adhärer Zellen.Zweitens die Herstellung einer Einzelzell-Suspension und das Ausplattieren einer bekannten Anzahl von Zellen auf beschichteten Platten sowie drittens die Färbung, Zählung und die nach einer Inkubationszeit gebildeten Kolonien. In diesem Video verwende ich immort

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video-Protokoll zeigt, wie zu diskriminieren und aufzählen bona fide neurale Stammzellen in einer gemischten Population von neuralen Vorläuferzellen über die neuronalen Kolonie-bildenden-Zell-Assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

Dieses Protokoll ist eine einfache bakterielle Adhäsion Assay aus der Zählung die Zahl der bakteriellen Kolonie bildende Einheiten, die auf kultivierten Zellen eingehalten werden. Der Test ist robust, studierte unabhängig von der Adhäsin und zahlreiche Variationen sind in den meisten Labors arbeiten bakterielle Pathogenese.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

Dieses Video beschreibt den Koloniebildungs-Assay, der hilft, die Fähigkeit von Lungenkrebszellen zu bestimmen, sich unbegrenzt zu vermehren und einzelne Kolonien zu bilden. Wir können die Wirkung eines Antikrebsmittels auf die koloniebildenden Zellen analysieren, indem wir die Veränderungen in der Anzahl und/oder Größe der resultierenden Kolonien analysieren.

Colony Formation Assay: Bewertung der Wirksamkeit von Antikrebsmitteln auf koloniebildende Lungenkrebszellen

In diesem Video führen wir einen klonogenen Assay von Keratinozyten durch, die von erwachsenen Mäusen entnommen wurden, um die Fähigkeit einzelner Zellen zu bestimmen, sich zu vermehren und Kolonien zu bilden. Diese Keratinozyten-Entnahmetechnik ist nützlich für die Untersuchung anderer nachgelagerter Aspekte der kutanen chemischen Karzinogenese und der Tumorförderung.

Keratinozyten-Koloniebildungs-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Fähigkeit von Keratinozyten, zu Kolonien zu wachsen

Wir haben ein in vitro Modell der Dornanz im Knochenmark für östrogenempfindliche Brustkrebszellen entwickelt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung des Modells für die Untersuchung der Molekular- und Zellbiologie der Ruhephase und für die Generierung von Hypothesen für nachfolgende Tests in vivo zu demonstrieren.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Winterruhe Model of Östrogen-sensitiven Brustkrebs im Knochenmark: Ein Werkzeug für Molecular Mechanism Studien und Hypothesengenerierung

Neurale Stammzellen (NSCs) beziehen sich auf Zellen, die selbst zu erneuern und differenzieren sich in die drei neuronale Abstammungslinien. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation zu bestimmen, Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Wir beschreiben ein Verfahren zur stabilen Markierung von Patienten stamm Xenotransplantaten (PDXs) mit lentivirale Partikel exprimieren grün fluoreszierenden Protein und Luziferase-Reporter. Diese Methode ermöglicht es, das Wachstum von PDXs am primären Standort zum Verfolgen sowie Detektieren spontaner und experimentelle Metastasen in vivo Bildgebungssysteme verwendet werden .

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

Ziel dieses Protokolls ist es, epidermale Keratinozyten aus der dorsalen Haut erwachsener Mäuse für eine Vielzahl nachgelagerter Anwendungen wie Molekularbiologie, Biochemie, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und primäre In-vitro-Anwendungen (z. B. clonogene Keratinozyten).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

Das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Tumore. Es werden detaillierte Protokolle zur Charakterisierung der Ionenkanalfunktion in Krebszellen und zur Untersuchung der Auswirkungen von Ionenkanalmodulatoren auf die Lebensfähigkeit von Krebs bereitgestellt.

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Herstellung und Validierung eines Add-on-Plattform, die eine verbesserte Kontrolle über die räumliche und zeitliche Sauerstoffzufuhr in ein 6-Well-Platte bietet. Das Gerät lässt sich an einer Reihe von Kultur-Systeme und kann verwendet werden, um die Wirkung von Sauerstoff auf die Wundheilung zu untersuchen.

Herstellung und Betrieb eines Oxygen Insert für adhärente Zellkulturen

Lernen Sie den klonogenen Test für adhärente Zellen zur Bewertung der reproduktiven Zellviabilität nach Bestrahlung oder chemischer Behandlung. Diese etablierte Methode der Strahlenbiologie ermöglicht die Untersuchung der Strahlensensitivität verschiedener Zelllinien.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

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