Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die dreidimensionale Struktur des Exosomenkomplexes mit Hilfe der Methode der zufälligen konischen Neigung zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine dünne Schicht Kohlenstofffilm auf das heilige Kohlenstoffgitter aufgebracht wird, um in einem zweiten Schritt das Stützsubstrat für den Proteinkomplex und die Färbung herzustellen. Die Probe und der Fleck werden auf das Gitter aufgetragen, wodurch die Probe in Schwermetallsalzen vergraben wird.

Anschließend wird eine Elektronenmikroskopie durchgeführt, um Kipppaare von Mikroskopaufnahmen der Probe zu erhalten. Schließlich werden Ergebnisse erzielt, die die dreidimensionale Struktur des Exosomenkomplexes auf der Grundlage einer Bildanalyse mit der Methode der zufälligen konischen Neigung zeigen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da manchmal eine gute Vorbereitung der Probe für die Methode der zufälligen konischen Kippung schwierig ist, ebenso wie das Verfahren für die Bildverarbeitung, die auf View folgt.

Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Sorten- und Probenvorbereitung ohne eine Veranschaulichung der Probenbeurteilung schwer zu erlernen sind. Das Prinzip der zufälligen konischen Kippmethode erfordert, dass ein Paar Mikroskopaufnahmen desselben Bereichs einer Probe im Elektronenmikroskop aufgenommen werden. Ein Bild wird von der Probe in einer nicht gekippten Position aufgenommen, und das andere Bild wird von der Probe aufgenommen, die in einem Winkel zwischen 50 und 70 Grad geneigt ist. Mit Hilfe des Computers wird das digitalisierte Schliffbildpaar nebeneinander gestellt, und in dieser Abbildung werden Bilder von denselben Partikeln ausgewählt.

Diese Bilder sind durch Zahlen in dreidimensionalen Koordinaten gekennzeichnet. Die Bilder von ungekippten Partikeln und ihren gekippten Partnern werden durch die Richtung der Kippachse und den Neigungswinkel miteinander korreliert. Die Ausrichtung der nicht gekippten Partikelbilder bringt die Bilder der gekippten Partikel an ihre entsprechenden Positionen als aMule, indem mehrere Bilder von gekippten Partikeln verwendet werden, die den azimutalen Raum füllen, die dreidimensionale Struktur des Moleküls kann mit einem Rückprojektionsalgorithmus rekonstruiert werden, um die Gitter herzustellen Zuerst eine 0,5%ige VAR-Lösung durch Zugabe von 0,45 Gramm Polyvinyl-Formharz herzustellen, und 90 Milliliter Chloroform in ein 100-Milliliter-Glasbecherglas.

Decken Sie in einem Abzug das Becherglas mit Alufolie ab und lösen Sie das Form-var-Harz auf. Mit der Acht eines kleinen Rührstabes und einem magnetischen Rührwerk dauert es etwa 15 Minuten, bis sich das Harz aufgelöst hat. Reinigen Sie in der Zwischenzeit vorgereinigte Mikroskopieglas-Objektträger in Methanol und mit Kim-Tüchern.

Nach der Form ist var das Harz vollständig aufgelöst. Geben Sie in Chloroform einen Milliliter 50%iges Glycerin auf die Oberfläche der Lösung. Die Anpassung des Volumens des zugesetzten Glycerins beeinflusst die Dichte der Löcher im heiligen Kohlenstoff.

Kippen Sie die Spitze eines Ultraschalls in die Lösung. Verwenden Sie in einer Tiefe von etwa einem Zoll die maximale Leistung, um eine Minute lang zu beschallen, wodurch eine Emulsion aus Glycerintröpfchen in Form unserer Lösung entsteht. Eine längere Beschallung führt zu einer geringeren Größe der Löcher im heiligen Kohlenstoff.

Nach diesem Schritt wird die Lösung milchig. Unmittelbar nach dem Ultraschallbad gleitet das saubere Glas senkrecht in die Emulsion. Nehmen Sie sie eine Sekunde lang heraus und tupfen Sie die Unterseite der Objektträger mit Filterpapier ab, um eine dünne Plastikfolie auf der Oberfläche der Objektträger zu bilden.

Nachdem das Chloroform verdampft ist, überprüfen Sie die Dichte und Größe der Löcher in der Folie unter einem Lichtmikroskop. Die hier beschriebene Präparationsbedingung sollte 10 bis 20 Löcher in jedem Quadrat eines 400-Maschen-Gitters mit Durchmessern zwischen drei und vier Mikrometern erzeugen. Sobald die Objektträger getrocknet sind, schneiden Sie den Rand der Kunststofffolie auf der Objektträgeroberfläche ab.

Schwimmen Sie den Film auf der Oberfläche des destillierten Wassers ab, indem Sie den Objektträger senkrecht in Wasser tauchen. Der dünne Film auf der Wasseroberfläche kann in einem Blickwinkel gegen die Lichtreflexion beobachtet werden. Legen Sie 400 Mesh-Kupfergitter nacheinander mit der glatten Oberfläche des Gitters nach unten auf die Folie.

Nimm die Plastikfolie mit den Gittern darauf mit einem Blatt Papier auf. Drehen Sie das Papier um und lassen Sie es trocknen. Weichen Sie das Papier in einer Petrischale in Methanol ein, um das restliche Glycerin in den Löchern zu entfernen, und lassen Sie das Papier an der Luft trocknen.

Verwenden Sie einen Kohlenstoffverdampfer, um die Gitter mit einer etwa 20 Nanometer dicken Kohlenstoffschicht zu beschichten. Nutzung der Verdampfungszeit, um die gewünschte Dicke zu kontrollieren. Die Dicke kann durch die graue Farbe des Kohlenstoffs im Vergleich zur grauen Farbe einer bekannten Kohlenstoffschicht bestimmt werden.

Weichen Sie die mit Kohlenstoffschichten geschichteten Gitter eine halbe Stunde lang in einer Petrischale aus Glas mit Chloroform ein, um die Form der Var-Form zu entfernen, gefolgt von der Trocknung der Gitter, die zu hausgemachten heiligen Kohlenstoffgittern führt. Als nächstes verdampfen Sie eine dünne Kohlenstoffschicht mit einer Dicke von etwa fünf Nanometern auf eine frisch gespaltene Glimmeroberfläche. Lege dann die heiligen Kohlegitter vorsichtig auf ein Stück Filterpapier unter destilliertes Wasser.

Lassen Sie den dünnen Kohlenstoff von der Glimmeroberfläche in einem selbstgebauten Gerät auf die Wasseroberfläche schwimmen und lagern Sie ihn langsam auf den heiligen Kohlenstoffgittern ab. Nehmen Sie das Filterpapier mit Gittern darauf auf und lassen Sie es trocknen. Beginnen Sie in einem Abzug mit der negativen Färbung des Exosomenkomplexes, indem Sie eine frische 2%ige Urinalformiatlösung herstellen.

Decken Sie, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, das Lösungsröhrchen mit einem Stück Aluminiumfolie ab Um Lichteinwirkung zu vermeiden, muss die Lösung gleich verwendet werden. Tagglühentladung eines dünnen Kohlenstoffs über einem reinen Kohlenstoffgitter unter Verwendung einer Glimmentladungsvorrichtung. Als nächstes legen Sie ein Stück sauberes Parfum auf die Bankpipette, pipettieren Sie drei 50-Mikroliter-Tröpfchen Urinalformiat-Färbelösung auf das Perfil, verdünnen Sie den Exosomenkomplex auf eine Konzentration von etwa 50 Nanomolaren. Pipettieren Sie unter Verwendung des Verdünnungspuffers vier Mikroliter des verdünnten Proteins, bis das Glühgitter entladen ist.

Lassen Sie die Probe eine Minute lang auf dem Gitter bleiben, dann tupfen Sie die restliche Lösung mit einem Stück Filterpapier mit einer Pinzette ab. Drehen Sie das Gitter sofort auf das erste Flecktröpfchen und spülen Sie das Gitter aus, indem Sie es etwa 10 Sekunden lang mehrmals hin und her bewegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes der drei Fleckentröpfchen nach dem letzten Spülen und lassen Sie den Fleck weitere eine Minute auf dem Gitter bleiben.

Tupfen Sie dann den Fleck mit einem Stück Filterpapier ab. Lassen Sie eine dünne Schicht Fleckenlösung auf der Gitteroberfläche und lassen Sie das Gitter in einem Abzug trocknen. Setzen Sie das Probengitter in den Probenhalter ein und setzen Sie den Halter dann in ein FEI TE nine 12 Elektronenmikroskop ein.

Überprüfen Sie das Beispielraster bei geringer Vergrößerung, um die besten fleckigen Quadrate zu finden. Ein gutes Quadrat scheint ein Dutzend Löcher mit Abmessungen von etwa ein bis zwei Mikrometern und dunkel fleckigen Bereichen darin zu haben. Schalten Sie den Niedrigdosismodus der FEI-Benutzeroberfläche ein und richten Sie den Suchfokus und die Belichtungsposition im Niedrigdosismodus aus.

Stellen Sie die Suche in den Bruchmodus mit 1,5 Meter Kameralänge. Stellen Sie den Fokus auf 150 K Vergrößerung und die Belichtung auf 50 K Vergrößerung mit einer Sekunde gemessener Belichtungszeit. Normalerweise wird ein erkennbares Merkmal im Raster sowohl im Such- als auch im Belichtungsmodus verwendet, um die Ausrichtung durchzuführen.

Finden Sie im Suchmodus die Löcher mit guter Färbung und speichern Sie die Positionen. Machen Sie ein CCD-Bild des Quadrats. Kippen Sie die Probe um 55 Grad und machen Sie ein weiteres Bild.

Vergleichen Sie die beiden Bilder und identifizieren Sie die gepaarten Löcher in den beiden Mikroaufnahmen. Neigen Sie die Bühne wieder auf null Grad. Verwenden Sie das Niedrigdosis-Kit, um Bilder von jedem im Suchmodus identifizierten Loch bei hoher Vergrößerung und einer Unschärfe von etwa minus 0,7 Mikrometern aufzunehmen.

Nachdem Sie Bilder von allen Löchern aufgenommen haben, neigen Sie den Tisch mit der gleichen Vergrößerung um 55 Grad. Es werden Mikroskopaufnahmen der gekippten Probe mit einer Unschärfe von etwa minus 1,2 Mikrometern gemacht. Identifizieren Sie das entsprechende Neigungspaar von Schliffbildern anhand der Muster in den Mikroskopaufnahmen mit geringer Vergrößerung, indem Sie das unregelmäßige Muster der hausgemachten heiligen Kohlenstoffgitter verwenden.

Um die Korrelation zu verbessern, wählen Sie Neigungspaare für Mikroskopische Aufnahmen mit gleichmäßig verteilten Partikeln und ohne Halos um die Partikel. Mikroskopische Aufnahmen mit offensichtlichen Fleckenhöfen um sie herum sollten verworfen werden, um die Daten zu verarbeiten. Beginnen Sie mit der Programmeinrichtung In der Prozedur.

Die Bildverarbeitung wird mit dem Prozess 2D im Eman-Gehäuse demonstriert. Um das Bildformat zu ändern, führen Sie das iMagic Five-Paket, um die 2D-Ausrichtung und das Spinnenpaket durchzuführen. Um die 3D-Rekonstruktion und -Verfeinerung durchzuführen, konvertieren Sie das digitale Bild DM three Gatan in das Spinnenbildformat.

Wählen Sie mit dem Befehl 2D verarbeiten die Partikelpaare aus. Mit dem Webprogramm, das im Spider-Programmpaket enthalten ist, speichert das Programm automatisch die Koordinaten der Partikelbox, die mit dem Spider-Skript ausgewählt wurden. Das Skript speichert die gekippten und nicht gekippten Partikelstapel.

Konvertieren Sie die geneigten UN-Partikel in das IMAG-Fünf-Format. Mit dem EM-Programm EM zwei Bandpass, filtern und maskieren Sie die UN-geneigten Partikel mit dem InCorp-Vorbereitungsbefehl in IMAG five und zentrieren Sie die maskierten Bandpasspartikel mit dem Befehl center. Richten Sie in imag five die Partikel aus und klassifizieren Sie sie iterativ in homogene Klassen, indem Sie ein Batch-Skript verwenden, das die IMAG five-Programme automatisch ausführt.

Verwenden Sie als Nächstes den Befehl MSA-Namen in der Klasse in IMAG fünf, um die Nachschlagetabelle einer Klasse der Partikel zu generieren, und generieren Sie eine Plotdatei für die Verschiebungs- und Rotationswerte der Ausrichtung für jedes Partikel mit dem Befehl header. Konvertieren Sie in iMagic five die ausgerichteten Partikel mit dem Programm EM two EM in das Spinnenformat. Ändern Sie dann die Klassennachschlagetabelle in Spider-Dokumentdateien.

Die Translations- und Rotationswerte der Ausrichtung für jedes Partikel werden ebenfalls in einen Bandpassfilter für Spinnendokumentdateien umgewandelt, maskieren und zentrieren die gekippten Partikel genau wie für die nicht gekippten Partikel in IMAG five und generieren einen neuen Datensatz für zentriert gekippte Partikel. Erstellen Sie Winkeldokumentdateien aus den aus IMAG five generierten Multi-Referenz-Ausrichtungsdokumenten und den vom Webprogramm generierten DCB-Dateien. Verwenden Sie das Rückprojektionsskript in Spider, um ein Anfangsmodell für jeden Klassendurchschnitt zu erhalten.

Führen Sie abschließend eine Projektionsverfeinerung des Anfangsvolumens mit dem Spider-Skript für alle nicht gekippten Partikel durch, um das endgültige Volumen mit RCT zu erhalten. Etwa 50 Rekonstruktionen des Exosoms wurden erhalten. Die Volumina werden aus gekippten Partikeln erzeugt, die jedem Partikel in den 50 Klassen der nicht gekippten Partikel entsprechen.

Unter Verwendung der im Spider-Paket implementierten Rückprojektion wurde dann die Verfeinerung der Projektionsanpassung durchgeführt. Unter Verwendung dieser Volumina als Ausgangsmodelle und der Erzeugung des angezeigten 3D-Volumens des Exosoms mit einer zusätzlichen Auflösung von etwa 18 ang können wir dann die atomaren Modelle verschiedener Teile des Komplexes in der 3D-Karte einblenden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie RCT verwenden können, um dreidimensionale Rekonstruktionen zu erhalten, von der Erstellung eines guten narrativen stehenden Rasters von Proben über Peer-to-Peer-Mikroaufnahmen bis hin zur Erstellung der Rekonstruktion mithilfe von Bildanalysetechniken. Neben dem Protokoll, das wir hier beschrieben haben, gibt es mehrere Methoden, um die endgültigen Rekonstruktionen in der Bildanalyse zu erhalten.

Der wichtigste Schritt, um eine zuverlässige, korrekte Rekonstruktion zu erhalten, ist die Arbeit mit einer gut vorbereiteten Probe.