Name: Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Erfahren Sie die 3D-Rekonstruktion des Exosom-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mittels Random-konischer Tilt-Methode und Negativkontrast-Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht Strukturbiologen die Visualisierung biologischer Makromoleküle.

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Die Autoren bedanken sich bei den Mitgliedern des Nogales Labor an der UC-Berkeley danken an der Erstellung der ersten Protokolle und die Mitglieder des Wang-Labor an der Yale University in ihre Hilfe, um die volle Protokolle zu etablieren. Wir erkennen auch die Mitarbeiter in Kryo-EM-Anlage und High-Performance Computation-Center an der Yale School of Medicine für ihre Unterstützung. HW ist ein Smith Family Preisträger.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
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<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

In diesem Artikel präsentieren wir ein detailliertes Protokoll der Probenvorbereitung und dreidimensionale Rekonstruktion des Exosom Komplex mit negativen Färbung Elektronenmikroskopie. Mit dieser Methode erhalten wir die 3D-Rekonstruktion mit zufälligen konische Neigung Methode ohne vorherige Kenntnis der Struktur. Zufällige konische Neigung Methode erfordert nicht unbedingt eine homogene Probe, aber die folgenden Projektion passenden Verfeinerung Schritt wäre eine homogene Probe braucht, um eine hohe Auflösung zu erre...

<table><tbody><tr><td>Polyvinyl-Formal-Harz</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Uranylformiat</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost-Mikroskopobjektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>400er-Maschenraster, normal</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Kohlebedampfer Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai-12-Elektronenmikroskop</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger (Glow Discharger)</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Sputter-Coater SCD 005</td></tr></tbody></table>

single particle electron microscopy rekonstruktion der exosom complex mit der random-konische tilt-methode

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Einzelne Partikel-Elektronenmikroskopie (EM) Rekonstruktion hat vor kurzem ein beliebtes Mittel, um die dreidimensionale (3D) Struktur von großen makromolekularen Komplexen erhalten werden. Im Vergleich zu Röntgenkristallographie, hat es einige einzigartige Vorteile. Erstens, einzelne Partikel EM Rekonstruktion nicht erforderlich, die Proteinprobe, die den Engpass in der Röntgenkristallographie ist kristallisieren, insbesondere bei großen makromolekularen Komplexen. Zweitens braucht es nicht große Mengen von Protein-Proben. Verglichen mit Milligramm Proteine, die für Kristallisation, einzelne Partikel EM Wiederaufbau braucht nur einige Mikroliter Proteinlösung bei nano-molaren Konzentrationen, wobei die negative Färbung EM-Methode. Doch trotz ein paar makromolekularen Anordnungen mit hoher Symmetrie, einzelne Partikel EM ist bei relativ niedrigen Auflösung begrenzt (weniger als 1 nm Auflösung) für viele Exemplare vor allem ohne Symmetrie. Diese Technik wird auch von der Größe der Moleküle unter-Studie beschränkt, dh 100 kDa für negativ gefärbten Proben und 300 kDa für frozen-hydratisierten Proben im Allgemeinen. Für eine neue Probe mit unbekannter Struktur, verwenden wir grundsätzlich eine Heavy Metal-Lösung, um die Moleküle durch negative Färbung einbinden. Die Probe wird dann in einem Transmissionselektronenmikroskop untersucht, um zweidimensionale (2D) Aufnahmen der Moleküle statt. Idealerweise haben die Proteinmoleküle einer homogenen 3D-Struktur, sondern weisen unterschiedliche Orientierungen in den Aufnahmen. Diese Aufnahmen werden digitalisiert und verarbeitet in Computern als &quot;single-Teilchen&quot;. Mit Hilfe von zweidimensionalen Ausrichtung und Klassifizierung Techniken, homogen sind Moleküle in die gleichen Ansichten in Klassen gruppiert. Ihre Mittel erhöhen das Signal des Moleküls 2D-Formen. Nachdem wir die Teilchen mit der richtigen relativen Orientierung (Euler-Winkel) zuordnen, können wir die 2D-Partikel-Bilder in einer virtuellen 3D-Volumen zu rekonstruieren. In einzelnen Partikels 3D-Rekonstruktion, ist ein wesentlicher Schritt, um richtig zuordnen die richtige Ausrichtung der einzelnen Teilchen. Es gibt mehrere Methoden, um die Ansicht für jedes Teilchen zuordnen, einschließlich der eckigen Rekonstitution 1 und zufälligen konische Neigung (RCT) Methode 2. In diesem Protokoll, beschreiben wir unsere Praxis in immer der 3D-Rekonstruktion von Hefe Exosom Komplex mit negativen Färbung EM und RCT. Anzumerken ist, dass unser Protokoll der Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitung das Grundprinzip der RCT folgt, ist aber nicht der einzige Weg, die Methode auszuführen. Wir beschreiben zunächst, wie die Protein-Probe in einer Schicht von Uranyl-Formate mit einer Dicke vergleichbar mit der Größe des Proteins eingebettet, mit einem löchrigen Kohlenstoff-Gitter mit einer Schicht durchgehende dünne Kohlenstoff-Folie abgedeckt. Dann wird die Probe in einem Transmissions-Elektronenmikroskop zu sammeln eingefügt ungekippten (0-Grad) und neigbar (55-Grad-) Paare von Aufnahmen, die später für die Verarbeitung und den Erhalt einer ersten 3D-Modell der Hefe Exosom verwendet werden. Zu diesem Zweck führen wir RCT und dann zu verfeinern den ersten 3D-Modell mit Hilfe der Projektion passenden Verfeinerung der Methode 3.

Dieser Artikel beschreibt ein standardisiertes Verfahren, um eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion biologischer Makromoleküle mit Hilfe Negativfärbung Elektronenmikroskopie (EM) zu bekommen. In diesem Protokoll erklären wir, wie die 3D-Struktur des Saccharomyces cerevisiae Exosom Komplex in mittlerer Auflösung unter Verwendung des Random konische Neigung Rekonstruktionsverfahren (RCT) zu bekommen.

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

Die Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie-Rekonstruktion (EM) hat sich in letzter Zeit zu einem populären Werkzeug entwickelt, um die dreidimensionale (3D) Struktur großer ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die dreidimensionale Struktur des Exosom-Komplexes mithilfe der Methode der zufälligen konischen Kippung zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine dünne Kohlenstoffschicht auf das Lochraster mit Kohlenstoffbeschichtung aufgebracht wird, um das Trägersubstrat für den Protein-Komplex herzustellen, und anschließend in einem zweiten Schritt der Kontrastierungsmittel. Die Probe und das Kontrastierungsmittel werden auf das Raster aufgetragen, wodurch die Probe in Schwermetallsalze eingebettet wird.Anschließend wird die Elektronenmikroskopie durchgeführt, um Kipp-Paare von Mikroaufnahmen der Probe zu erhalten. Schließlich erhält man Ergebnisse, die die dreidimensionale Struktur des Exosom-Komplexes basierend auf der Bildanalyse mittels der Methode der zufälligen konischen Neigung zeigen. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da manchmal die gute Vorbereitung der Probe für die Methode der zufälligen konischen Neigung ebenso schwierig ist wie das anschließende Verfahren zur Bildverarbeitung.Die Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Bewertung der Probe und die Vorbereitungsschritte ohne eine Veranschaulichung der Probenauswertung schwer zu erlernen sind. Das Prinzip der Methode der zufälligen konischen Kippung erfordert die Aufnahme eines Paares von Mikroaufnahmen derselben Region einer Probe im Elektronenmikroskop. Ein Bild wird von der Probe in einer nicht gekippten Position aufgenommen und das andere Bild von der Probe, die um einen Winkel zwischen 50 und 70 Grad gekippt ist. Mithilfe des Computers werden das digitalisierte Mikroaufnahmenpaar nebeneinander angeordnet, und in dieser Abbildung werden Bilder derselben Partikel ausgewählt.Diese Bilder sind mit Nummern in dreidimensionalen Koordinaten markiert. Die Bilder der nicht gekippten Partikel und ihrer gekippten Partner werden über die Richtung der Kippachse und den Kippwinkel miteinander korreliert. Die Ausrichtung der Bilder der nicht gekippten Partikel bringt die Bilder der gekippten Partikel an ihre entsprechenden aMule-Positionen. Unter Verwendung mehrerer Bilder gekippter Partikel, die den azimutalen Raum füllen, kann die dreidimensionale Struktur des Moleküls mittels eines Rückprojektionsalgorithmus rekonstruiert werden. Um die Gitter zunächst herzustellen, bereiten Sie eine 0,5 %-ige Formvar-Lösung zu, indem Sie 0,45 Gramm Polyvinylformalharz und 90 Milliliter Chloroform in einen 100-Milliliter-Glaskolben geben.Decken Sie im Abzug das Becherglas mit Aluminiumfolie ab und lösen Sie das Formvar-Harz auf. Mit einem kleinen Rührstab und einem magnetischen Rührer dauert es etwa 15 Minuten, bis das Harz vollständig gelöst ist. Reinigen Sie in der Zwischenzeit vorgereinigte Mikroskop-Glasobjektträger mit Methanol und Kim-Tüchern. Nachdem das Formvar-Harz vollständig in Chloroform gelöst ist, einen Milliliter 50 % Glycerin auf die Oberfläche der Lösung geben. Die Anpassung des Volumens des zugegebenen Glycerins beeinflusst die Dichte der Löcher im heiligen Kohlenstoff.Halten Sie die Spitze eines Ultraschallsonotroden in die Lösung. In einer Tiefe von etwa einem Zoll sonicieren Sie für eine Minute mit maximaler Leistung, wodurch eine Emulsion aus Glycerintröpfchen in Form unserer Lösung entsteht. Eine längere Beschallung führt zu kleineren Poren in der heiligen Kohle.Die Lösung wird nach diesem Schritt trüb. Unmittelbar nach dem Beschallungstauchgang wird der saubere Objektträger senkrecht in die Emulsion eingetaucht. Nach einer Sekunde wird er herausgenommen, und das untere Ende der Objektträger wird mit Filterpapier abgetupft, um einen dünnen Kunststofffilm auf der Oberfläche der Objektträger zu bilden.Nachdem das Chloroform verdunstet ist, überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop die Dichte und Größe der Löcher im Film. Die hier beschriebene Präparationsbedingung sollte 10 bis 20 Löcher in jedem Quadrat eines 400-Maschen-Netzes mit Durchmessern zwischen drei und vier Mikrometern erzeugen. Sobald die Objektträger trocken sind, schneiden Sie die Kante des Kunststofffilms an der Oberfläche des Objektträgers ab.Legen Sie den Objektträger senkrecht ins destillierte Wasser, um den Film auf der Wasseroberfläche schwimmen zu lassen. Der dünne Film auf der Wasseroberfläche ist im streifenden Winkel gegen das reflektierte Licht sichtbar. Plazieren Sie 400-Maschen-Kupfergitter nacheinander auf dem Film, wobei die glatte Seite des Gitters nach unten zeigt.Heben Sie die durchsichtige Folie mit dem darin eingezeichneten Raster mithilfe eines Papiers an. Drehen Sie das Papier um und lassen Sie es trocknen. Tauchen Sie das Papier in eine Petrischale mit Methanol ein, um das restliche Glycerin aus den Löchern zu entfernen, und lassen Sie das Papier anschließend an der Luft trocknen.Verwenden Sie einen Kohlenstoff-Verdampfer, um die Gitter mit einer etwa 20 Nanometer dicken Kohlenstoffschicht zu beschichten. Steuern Sie die gewünschte Dicke über die Verdampfungszeit. Die Dicke kann anhand der Graufärbung des Kohlenstoffs im Vergleich zur Graufärbung einer Kohlenstoffschicht bekannter Dicke bestimmt werden.Die mit Kohle beschichteten Gitter eine halbe Stunde lang in einem Glas-Petri-Gefäß mit Chloroform tränken, um den Formvar zu entfernen; anschließend führt das Trocknen der Gitter zur Herstellung hausgemachter, gelochter Kohlegitter. Danach eine dünne Kohleschicht mit einer Dicke von etwa fünf Nanometern auf eine frisch gespaltene Glimmeroberfläche aufdampfen. Anschließend die gelochten Kohlegitter vorsichtig unter destilliertem Wasser auf ein Stück Filterpapier legen.In einer selbstgebauten Apparatur wird die dünne Kohlenstoffschicht von der Glimmeroberfläche auf die Wasseroberfläche geschwemmt und langsam auf die mit Löchern versehenen Kohlenstoffgitter übertragen. Heben Sie das Filterpapier mit den Gittern vorsichtig auf und lassen Sie es trocknen. Beginnen Sie im Abzug die negative Färbung des Exosomenkomplexes, indem Sie eine frische 2%ige Uranylformatlösung herstellen.Wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, bedecken Sie das Lösungsgefäß mit einem Stück Aluminiumfolie, um eine Lichteinwirkung zu verhindern. Die Lösung muss am selben Tag verwendet werden. Erzeugen Sie mittels einer Glimmentladungsvorrichtung eine dünne Kohlenstoffbeschichtung auf einem vollständig kohlenstoffbeschichteten Raster. Legen Sie danach ein sauberes Parafilm-Stück auf die Arbeitsfläche und pipettieren Sie drei 50-Mikroliter-Tropfen der Uranylformat-Anfärbungslösung auf das Parafilm. Verdünnen Sie den Exosomenkomplex mit Verdünnungspuffer auf eine Konzentration von etwa 50 Nanomolar. Pipettieren Sie anschließend vier Mikroliter der verdünnten Proteinlösung auf das durch Glimmentladung behandelte Raster.Lassen Sie die Probe eine Minute lang auf dem Objektträger stehen, dann tupfen Sie die restliche Lösung mit einem Stück Filterpapier mithilfe einer Pinzette ab. Drehen Sie den Objektträger sofort auf die erste Tropfenprobe der Färbung und spülen Sie ihn, indem Sie ihn mehrmals etwa 10 Sekunden lang hin und her bewegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede der drei Färbetropfen. Nach dem letzten Spülvorgang lassen Sie die Färbung noch eine zusätzliche Minute auf dem Objektträger stehen.Entfernen Sie dann den Farbstoff mit einem Stück Filterpapier. Halten Sie eine dünne Schicht der Färbelösung auf der Oberfläche des Rasters und lassen Sie das Raster in einer Abzugshaube trocknen. Platzieren Sie das Probenraster in der Probenträgerhalterung und setzen Sie anschließend die Halterung in ein FEI TE nine 12 Elektronenmikroskop ein.Überprüfen Sie das Probenraster bei niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung, um die am besten angef&auml;rbten Felder zu finden. Ein gutes Feld scheint etwa ein Dutzend L&ouml;cher mit Abmessungen von ungef&auml;hr ein bis zwei Mikrometern und dunkel angef&auml;rbte Bereiche darin aufzuweisen. Schalten Sie den Niedrigdosis-Modus der FEI-Benutzeroberfl&auml;che ein und justieren Sie den Suchfokus sowie die Belichtungsposition im Niedrigdosis-Modus.Stellen Sie die Suche in den Fraktionsmodus mit einer Kamerakamera-Länge von 1,5 Metern ein. Stellen Sie den Fokus auf 150 K Vergrößerung ein und stellen Sie die Belichtung auf 50 K Vergrößerung mit einer Belichtungszeit von einer Sekunde ein. Normalerweise wird eine erkennbare Struktur auf dem Gitter sowohl im Such- als auch im Belichtungsmodus verwendet, um die Ausrichtung durchzuführen.Suchen Sie die Löcher mit guter Färbung im Suchmodus und speichern Sie die Positionen. Machen Sie ein CCD-Bild des Quadrats. Kippen Sie die Probe auf 55 Grad und machen Sie ein weiteres Bild.Vergleichen Sie die beiden Bilder und identifizieren Sie die gepaarten Löcher in den beiden Mikrografien. Kippen Sie den Probentisch zurück auf null Grad. Verwenden Sie das Niedrigdosis-Set, um Aufnahmen jedes identifizierten Lochs im Suchmodus bei hoher Vergrößerung und einer Defokussierung von etwa minus 0,7 Mikrometern anzufertigen.Nachdem Bilder aller Löcher aufgenommen wurden, kippen Sie den Präparattisch auf 55 Grad unter Verwendung derselben Vergrößerung. Nehmen Sie Mikroaufnahmen des gekippten Präparats mit einer Defokussierung von etwa minus 1,2 Mikrometern auf. Identifizieren Sie das entsprechende Kipp-Paar von Mikroaufnahmen anhand der Muster in den Mikroaufnahmen mit niedriger Vergrößerung, wobei Sie das unregelmäßige Muster der selbstgefertigten gelochten Kohlefolien nutzen.Um die Korrelation zu unterstützen, wählen Sie Mikrografien-Tilt-Paare mit gleichmäßig verteilten Partikeln und ohne Halo-Artefakte um die Partikel herum aus. Mikrografien mit offensichtlichen Färbungs-Halos sollten verworfen werden, um die Daten weiterzuverarbeiten. Beginnen Sie mit der Programmkonfiguration im Verfahren.Die Bildverarbeitung wird mithilfe des Prozesses 2D im EMAN-Paket demonstriert. Um das Bildformat zu ändern, verwenden Sie das iMagic-Fünf-Paket, um die 2D-Ausrichtung durchzuführen, und das SPIDER-Paket. Um die 3D-Rekonstruktion und -Verfeinerung durchzuführen, konvertieren Sie das DM3-Gatan-Digitalbild in das SPIDER-Bildformat.Wählen Sie mithilfe des Prozess-2D-Befehls die Partikelpaare aus. Mit dem im Spider-Programmpaket verteilten Webprogramm speichert das Programm automatisch die Koordinaten der Partikelbox und alle ausgewählten Partikel mithilfe des Spider-Skripts. Das Skript speichert die gekippten und ungekippten Partikelstapel.Konvertieren Sie die gekippten UN-Partikel in das IMAG-fünf-Format. Filtern und maskieren Sie die gekippten UN-Partikel mithilfe des EM-zu-EM-Programms Bandpass und des InCorp-prep-Befehls in IMAG fünf und zentrieren Sie die bandpassmaskierten Partikel mit dem center-Befehl. Gleichrichten und klassifizieren Sie in IMAG fünf die Partikel iterativ in homogene Klassen, indem Sie ein Batch-Skript verwenden, das automatisch die IMAG-fünf-Programme ausführt.Verwenden Sie anschließend die MSA-Namen im Klassenbefehl in IMAG five, um die Nachschlagetabelle der Partikel der Klasse zu erstellen, und generieren Sie mithilfe des Header-Befehls eine Plot-Datei für die Translations- und Rotationswerte der Ausrichtung für jedes Partikel. Konvertieren Sie in iMagic five die ausgerichteten Partikel mit dem EM-zu-EM-Programm in das Spider-Format. Wandeln Sie danach die Nachschlagetabelle der Klassen in Spider-Dokumentdateien um.Die Translations- und Rotationswerte der Ausrichtung für jedes Partikel werden ebenfalls in eine SPIDER-Dokumentdatei umgewandelt; Bandpassfilter, Maske und Zentrierung der gekippten Partikel erfolgen genauso wie bei den ungekippten Partikeln in IMAG fünf, um einen neuen Datensatz für die zentrierten, gekippten Partikel zu erzeugen. Erstellen Sie Winkeldokumentdateien aus den Multireferenzausrichtungsdokumenten, die aus IMAG fünf stammen, sowie aus den DCB-Dateien, die vom Webprogramm generiert wurden. Verwenden Sie das Rückprojektions-Skript in SPIDER, um ein initiales Modell für jeden Klassenmittelwert zu erhalten.Schließlich die Projektionsverfeinerung des Anfangsvolumens unter Verwendung des Spider-Skripts anhand aller nicht gekippten Partikel durchführen, um das endgültige Volumen mittels RCT zu erhalten. Etwa 50 Rekonstruktionen des Exosoms wurden gewonnen. Die Volumina werden aus gekippten Partikeln erzeugt, die jedem Partikel in den 50 Klassen der nicht gekippten Partikel entsprechen.Mithilfe der im Spider-Paket implementierten Rückprojektion wurde anschließend die Projektionsvergleichs-Verfeinerung unter Verwendung dieser Volumina als Anfangsmodelle durchgeführt, und das dargestellte dreidimensionale Volumen des Exosoms wurde mit einer Auflösung von etwa 18 Å generiert. Anschließend können die atomaren Modelle verschiedener Bestandteile des Komplexes in die 3D-Karte eingepasst werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die RCT-Methode verwendet, um dreidimensionale Rekonstruktionen zu erhalten – von der Erzeugung eines geeigneten, gut präparierten Probengitters über die Aufnahme von Einzelbild-Mikroaufnahmen bis hin zur Gewinnung der Rekonstruktion mithilfe von Bildanalyseverfahren. Neben dem hier beschriebenen Protokoll gibt es mehrere Methoden, um die endgültigen Rekonstruktionen in der Bildanalyse zu erhalten.Der entscheidende Schritt für eine zuverlässige und korrekte Rekonstruktion besteht darin, mit einer gut präparierten Probe zu arbeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt die Technik zur Herstellung eines Dünnschnitts von eingebetteten Exosomen. Diese Schnitte können ferner mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gefärbt und abgebildet werden, um die strukturellen Merkmale von Exosomen zu untersuchen.

Schnittbildung, Färbung und TEM-Bildgebung von eingebetteten Exosomen: Ein Protokoll zur Visualisierung der strukturellen Merkmale von Exosomen mit TEM

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Verarbeitung von Kryo-EM-Bildern mit der Software-Suite SPHIRE vor. Das vorliegende Protokoll kann für fast alle Einzelteilchen-EM-Projekte angewendet werden, die auf eine nahezu atomare Auflösung abzielen.

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Techniken für Transmissions-Elektronenmikroskopie, einschließlich negative Färbung, ultradünnen schneiden für detaillierte Struktur und Immuno-Gold um die Positionen der spezifischen Proteine in Exosomen bestimmen Kennzeichnung notwendig.

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Die Einzelpartikelanalyse in der Kryo-Elektronenmikroskopie ist eine der wichtigsten Techniken, um die Struktur biologischer Ensembles mit hoher Auflösung zu bestimmen. Scipion bietet die Werkzeuge, um die gesamte Pipeline zu erstellen, um die vom Mikroskop erfassten Informationen zu verarbeiten und eine 3D-Rekonstruktion der biologischen Probe zu erreichen.

Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels KryoEM ist für bestimmte Klassen von Proteinen und Komplexen zur Routine geworden. Hier wird diese Pipeline zusammengefasst (Probenvorbereitung, Screening, Datenerfassung und -verarbeitung) und die Leser werden auf weitere detaillierte Ressourcen und Variablen geleitet, die bei anspruchsvolleren Proben geändert werden können.

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) wird verwendet, um die typische Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und Exosomen auf der Nanometerskala zu betrachten. Es kann sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen eingesetzt werden, um Exosomen zu charakterisieren.

Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen

Dieser Artikel beschreibt, wie drei Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen, d. h. cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, effektiv genutzt werden können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Einzelpartikeldatensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Septine sind Zytoskelettproteine. Sie interagieren mit Lipidmembranen und können Membrankrümmungen im Mikrometerbereich wahrnehmen, aber auch erzeugen. Wir beschreiben in diesem Protokoll Bottom-up-In-vitro-Methoden zur Analyse von Membranverformungen, krümmungsempfindlicher Septinbindung und Septinfilament-Ultrastruktur.

Bottom-up In vitro Methoden zur Untersuchung der ultrastrukturellen Organisation, der Membranumformung und des Krümmungsempfindlichkeitsverhaltens von Septinen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein verallgemeinertes und einfach zu implementierendes Schema für die Datenerfassung von gekippten Einzelpartikeln in Kryo-EM-Experimenten. Ein solches Verfahren ist besonders nützlich, um eine qualitativ hochwertige EM-Karte für Proben zu erhalten, die aufgrund der Einhaltung der Luft-Wasser-Grenzfläche unter einer bevorzugten Orientierungsverzerrung leiden.

Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Erfahren Sie die 3D-Rekonstruktion des Exosom-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mittels Random-konischer Tilt-Methode und Negativkontrast-Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht Strukturbiologen die Visualisierung biologischer Makromoleküle.

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

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