Name: Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Erfahren Sie die 3D-Rekonstruktion des Exosom-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mittels Random-konischer Tilt-Methode und Negativkontrast-Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht Strukturbiologen die Visualisierung biologischer Makromoleküle.

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Die Autoren bedanken sich bei den Mitgliedern des Nogales Labor an der UC-Berkeley danken an der Erstellung der ersten Protokolle und die Mitglieder des Wang-Labor an der Yale University in ihre Hilfe, um die volle Protokolle zu etablieren. Wir erkennen auch die Mitarbeiter in Kryo-EM-Anlage und High-Performance Computation-Center an der Yale School of Medicine für ihre Unterstützung. HW ist ein Smith Family Preisträger.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
<li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+at+improved+resolution%3A+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

In diesem Artikel präsentieren wir ein detailliertes Protokoll der Probenvorbereitung und dreidimensionale Rekonstruktion des Exosom Komplex mit negativen Färbung Elektronenmikroskopie. Mit dieser Methode erhalten wir die 3D-Rekonstruktion mit zufälligen konische Neigung Methode ohne vorherige Kenntnis der Struktur. Zufällige konische Neigung Methode erfordert nicht unbedingt eine homogene Probe, aber die folgenden Projektion passenden Verfeinerung Schritt wäre eine homogene Probe braucht, um eine hohe Auflösung zu erre...

<table><tbody><tr><td>Polyvinyl-Formal-Harz</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Uranylformiat</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost-Mikroskopobjektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>400er-Maschenraster, normal</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Kohlebedampfer Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai-12-Elektronenmikroskop</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger (Glow Discharger)</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Sputter-Coater SCD 005</td></tr></tbody></table>

single particle electron microscopy rekonstruktion der exosom complex mit der random-konische tilt-methode

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Einzelne Partikel-Elektronenmikroskopie (EM) Rekonstruktion hat vor kurzem ein beliebtes Mittel, um die dreidimensionale (3D) Struktur von großen makromolekularen Komplexen erhalten werden. Im Vergleich zu Röntgenkristallographie, hat es einige einzigartige Vorteile. Erstens, einzelne Partikel EM Rekonstruktion nicht erforderlich, die Proteinprobe, die den Engpass in der Röntgenkristallographie ist kristallisieren, insbesondere bei großen makromolekularen Komplexen. Zweitens braucht es nicht große Mengen von Protein-Proben. Verglichen mit Milligramm Proteine, die für Kristallisation, einzelne Partikel EM Wiederaufbau braucht nur einige Mikroliter Proteinlösung bei nano-molaren Konzentrationen, wobei die negative Färbung EM-Methode. Doch trotz ein paar makromolekularen Anordnungen mit hoher Symmetrie, einzelne Partikel EM ist bei relativ niedrigen Auflösung begrenzt (weniger als 1 nm Auflösung) für viele Exemplare vor allem ohne Symmetrie. Diese Technik wird auch von der Größe der Moleküle unter-Studie beschränkt, dh 100 kDa für negativ gefärbten Proben und 300 kDa für frozen-hydratisierten Proben im Allgemeinen. Für eine neue Probe mit unbekannter Struktur, verwenden wir grundsätzlich eine Heavy Metal-Lösung, um die Moleküle durch negative Färbung einbinden. Die Probe wird dann in einem Transmissionselektronenmikroskop untersucht, um zweidimensionale (2D) Aufnahmen der Moleküle statt. Idealerweise haben die Proteinmoleküle einer homogenen 3D-Struktur, sondern weisen unterschiedliche Orientierungen in den Aufnahmen. Diese Aufnahmen werden digitalisiert und verarbeitet in Computern als &quot;single-Teilchen&quot;. Mit Hilfe von zweidimensionalen Ausrichtung und Klassifizierung Techniken, homogen sind Moleküle in die gleichen Ansichten in Klassen gruppiert. Ihre Mittel erhöhen das Signal des Moleküls 2D-Formen. Nachdem wir die Teilchen mit der richtigen relativen Orientierung (Euler-Winkel) zuordnen, können wir die 2D-Partikel-Bilder in einer virtuellen 3D-Volumen zu rekonstruieren. In einzelnen Partikels 3D-Rekonstruktion, ist ein wesentlicher Schritt, um richtig zuordnen die richtige Ausrichtung der einzelnen Teilchen. Es gibt mehrere Methoden, um die Ansicht für jedes Teilchen zuordnen, einschließlich der eckigen Rekonstitution 1 und zufälligen konische Neigung (RCT) Methode 2. In diesem Protokoll, beschreiben wir unsere Praxis in immer der 3D-Rekonstruktion von Hefe Exosom Komplex mit negativen Färbung EM und RCT. Anzumerken ist, dass unser Protokoll der Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitung das Grundprinzip der RCT folgt, ist aber nicht der einzige Weg, die Methode auszuführen. Wir beschreiben zunächst, wie die Protein-Probe in einer Schicht von Uranyl-Formate mit einer Dicke vergleichbar mit der Größe des Proteins eingebettet, mit einem löchrigen Kohlenstoff-Gitter mit einer Schicht durchgehende dünne Kohlenstoff-Folie abgedeckt. Dann wird die Probe in einem Transmissions-Elektronenmikroskop zu sammeln eingefügt ungekippten (0-Grad) und neigbar (55-Grad-) Paare von Aufnahmen, die später für die Verarbeitung und den Erhalt einer ersten 3D-Modell der Hefe Exosom verwendet werden. Zu diesem Zweck führen wir RCT und dann zu verfeinern den ersten 3D-Modell mit Hilfe der Projektion passenden Verfeinerung der Methode 3.

Dieser Artikel beschreibt ein standardisiertes Verfahren, um eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion biologischer Makromoleküle mit Hilfe Negativfärbung Elektronenmikroskopie (EM) zu bekommen. In diesem Protokoll erklären wir, wie die 3D-Struktur des Saccharomyces cerevisiae Exosom Komplex in mittlerer Auflösung unter Verwendung des Random konische Neigung Rekonstruktionsverfahren (RCT) zu bekommen.

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

Die Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie-Rekonstruktion (EM) hat sich in letzter Zeit zu einem populären Werkzeug entwickelt, um die dreidimensionale (3D) Struktur großer ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die dreidimensionale Struktur des Exosom-Komplexes mithilfe der Methode der zufälligen konischen Kippung zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine dünne Kohlenstoffschicht auf das Lochraster mit Kohlenstoffbeschichtung aufgebracht wird, um das Trägersubstrat für den Protein-Komplex herzustellen, und anschließend in einem zweiten Schritt der Kontrastierungsmittel. Die Probe und das Kontrastierungsmittel werden auf das Raster aufgetragen, wodurch die Probe in Schwermetallsalze eingebettet wird.Anschließend wird die Elektronenmikroskopie durchgeführt, um Kipp-Paare von Mikroaufnahmen der Probe zu erhalten. Schließlich erhält man Ergebnisse, die die dreidimensionale Struktur des Exosom-Komplexes basierend auf der Bildanalyse mittels der Methode der zufälligen konischen Neigung zeigen. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da manchmal die gute Vorbereitung der Probe für die Methode der zufälligen konischen Neigung ebenso schwierig ist wie das anschließende Verfahren zur Bildverarbeitung.Die Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Bewertung der Probe und die

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt die Technik zur Herstellung eines Dünnschnitts von eingebetteten Exosomen. Diese Schnitte können ferner mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gefärbt und abgebildet werden, um die strukturellen Merkmale von Exosomen zu untersuchen.

Schnittbildung, Färbung und TEM-Bildgebung von eingebetteten Exosomen: Ein Protokoll zur Visualisierung der strukturellen Merkmale von Exosomen mit TEM

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Verarbeitung von Kryo-EM-Bildern mit der Software-Suite SPHIRE vor. Das vorliegende Protokoll kann für fast alle Einzelteilchen-EM-Projekte angewendet werden, die auf eine nahezu atomare Auflösung abzielen.

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Techniken für Transmissions-Elektronenmikroskopie, einschließlich negative Färbung, ultradünnen schneiden für detaillierte Struktur und Immuno-Gold um die Positionen der spezifischen Proteine in Exosomen bestimmen Kennzeichnung notwendig.

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Die Einzelpartikelanalyse in der Kryo-Elektronenmikroskopie ist eine der wichtigsten Techniken, um die Struktur biologischer Ensembles mit hoher Auflösung zu bestimmen. Scipion bietet die Werkzeuge, um die gesamte Pipeline zu erstellen, um die vom Mikroskop erfassten Informationen zu verarbeiten und eine 3D-Rekonstruktion der biologischen Probe zu erreichen.

Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels KryoEM ist für bestimmte Klassen von Proteinen und Komplexen zur Routine geworden. Hier wird diese Pipeline zusammengefasst (Probenvorbereitung, Screening, Datenerfassung und -verarbeitung) und die Leser werden auf weitere detaillierte Ressourcen und Variablen geleitet, die bei anspruchsvolleren Proben geändert werden können.

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) wird verwendet, um die typische Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und Exosomen auf der Nanometerskala zu betrachten. Es kann sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen eingesetzt werden, um Exosomen zu charakterisieren.

Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen

Dieser Artikel beschreibt, wie drei Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen, d. h. cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, effektiv genutzt werden können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Einzelpartikeldatensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Septine sind Zytoskelettproteine. Sie interagieren mit Lipidmembranen und können Membrankrümmungen im Mikrometerbereich wahrnehmen, aber auch erzeugen. Wir beschreiben in diesem Protokoll Bottom-up-In-vitro-Methoden zur Analyse von Membranverformungen, krümmungsempfindlicher Septinbindung und Septinfilament-Ultrastruktur.

Bottom-up In vitro Methoden zur Untersuchung der ultrastrukturellen Organisation, der Membranumformung und des Krümmungsempfindlichkeitsverhaltens von Septinen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein verallgemeinertes und einfach zu implementierendes Schema für die Datenerfassung von gekippten Einzelpartikeln in Kryo-EM-Experimenten. Ein solches Verfahren ist besonders nützlich, um eine qualitativ hochwertige EM-Karte für Proben zu erhalten, die aufgrund der Einhaltung der Luft-Wasser-Grenzfläche unter einer bevorzugten Orientierungsverzerrung leiden.

Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Erfahren Sie die 3D-Rekonstruktion des Exosom-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mittels Random-konischer Tilt-Methode und Negativkontrast-Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht Strukturbiologen die Visualisierung biologischer Makromoleküle.

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

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