Name: Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-20T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Lernen Sie die Herstellung extrazellulärer Saugelektroden aus PE 90 Kunststoffschläuchen mit Alkohollampe für elektrophysiologische Aufnahmen an neonatalen Nagetier-Rückenmarkspräparaten in vitro.

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Samuel L. Pfaff ist ein Professor in der Genexpression Laboratories am Salk Institute for Biological Studies und ein Investigator in der Howard Hughes Medical Institute. Diese Arbeit wurde von der Christopher and Dana Reeve Foundation unterstützt. Joe Belcovson, Kent Schnoeker und Mike Sullivan in Multimedia-Ressourcen am Salk Institute unterstützte mit der Fotografie und Bearbeitung.

Elektrophysiologischen Ableitungen von isolierten Rückenmark können genetische und entwicklungsbedingten Veränderungen zu neuronalen Schaltkreisen 1 zeigen. Wir haben bereits gezeigt, eine Methode zu sezieren neonatalen Maus Rückenmark 2. Hier präsentieren wir eine Methode, um Saugelektroden nützlich Aufnahme fiktiven Fortbewegung in isolierten Rückenmark 3 zu erstellen. Die Spitze eines Kunststoffschlauch Elektrode kann zu einer sehr feinen Spitze von Hand mit einem Tieftemperatur-Alkohol-Lampe 3-5 gezogen werden. Der Kunststoffschlauch (PE90, Clay Adams Intramedic TM) wird über die Flamme gehalten, um den Schlauch in eine formbare Form zu erweichen. Als der Schlauch zu schmelzen beginnt und immer mehr durchscheinend ist es von der Wärmequelle und die Enden sind leicht auseinander gezogen entfernt. Der Zeitpunkt der Entfernung der Röhre aus der Flamme ist wichtig, um sicherzustellen, der Kunststoff nicht einstürzt oder sich spalten, während sie gezeichnet. Der dünne Teil des Schlauches mit einer Rasierklinge ist nach den gewünschten Innendurchmesser geschnitten, wie diktiert durch das Alter der Probe oder der segmentale Ebene des Rückenmarks. Zur Erleichterung der Erteilung eines O-Ring auf das Rohr, ist ein 45 °-Schnitt am dicken Ende des Schlauches mit einer Rasierklinge gemacht. Eine Hülse und O-Ring auf das dicke Ende installiert werden, um die Spitze der Elektrode, um den Lauf der Elektrode befestigen. Um eigens für große Elektroden ermöglichen und vermeiden die Schwierigkeiten bei der Hand ziehen Elektrodenspitzen, Elektroden können unter Verwendung von kleinen Schlauch in einen dickeren Schlauch (PE90) eingefügt werden. Die Längen der Schläuche sind speziell auf die Anforderungen des Aufnahme-Setup und sind variabel. Wir präsentieren Ihnen die Messungen in unseren Experimenten 1-3,5 verwendet. Ein 1cm Länge von PTFE-Schlauch (Zeus, Small Parts) und einem 10cm Länge PE90 Rohre sind mit einer Rasierklinge geschnitten. Die Enden der kleinen Schlauch sollte untersucht werden, um sicherzustellen, dass sie nicht gequetscht oder geschlossen werden. Sie können geöffnet werden mit einem Insekt pin (Fine Science Tools) sein. Ein Tropfen Klebstoff (JB Weld) wird auf den Mittelpunkt der PTFE-Schläuche gelegt. Die PTFE-Schläuche und Klebstoff sind in der PE90-Schlauch mit Mund Sogwirkung auf die PE90 Rohr gezogen. Ein 45 ° Schnitt wird am dicken Ende des Schlauches gemacht und eine Zwinge und O-Ring verbunden sind, wie frühere. Die Ferrule und BNC-Stecker sind von einer kommerziellen Saugelektrode abgeschraubt. Der BNC-Anschluss ist in Xylol für 1 Stunde eingeweicht, um die Wachssiegel zu entfernen. Der Stecker wird dann in Wasser gespült und getrocknet. Eine niedrigere abgewinkelten Seite Port muss auf der Seite des Laufes gemacht werden. Ein Metallstab erhitzt wird mit einem Bunsenbrenner und drückte in das bestehende Loch an der Seite des Fasses in einem flachen Winkel. Ein 15cm Länge von 0,010 Zoll Silberdraht (AM Systems) wird geschnitten und getränkt in Bleichmittel für 15 Minuten. Dies geschieht zu einer Silberchlorid-Beschichtung, die in Signalleitung 6 Hilfsmittel zu schaffen. Der Draht wird mit Wasser gespült, getrocknet und dann gelötet auf die BNC-Buchse. Die BNC-Stecker und Silberdraht in die Saugelektrode Lauf mit genug Platz für die BNC-Buchse an der Seite des Fasses gesteckt bleiben. Saugschlauch wird in den seitlichen Anschluss 2-3cm eingefügt. Silikon-Dichtstoff ist in den Lauf ca. 2-3cm injiziert. Der BNC-Anschluss ist in den Lauf der Elektrode Drücken der Dichtstoff nach vorne eingefädelt. Die Spitze der Elektrode ist nun in das vordere Ende der Elektrode eingefädelt. Schrumpfschlauch kann auch hinzugefügt, um die Saugleitung von der Seite Port verstärken. Elektroden werden auf Mikromanipulatoren, die magnetische steht angebracht sind, und stellte in der Nähe der Aufnahme Schüssel montiert. BNC Koaxialkabel sind ein headstage, dass an einen Verstärker verkabelt ist beigefügt. Der Verstärker ist mit einem Adapter (PolyView), die zu einem Analog-Digital-Karte (National Instruments) in einen PC mit Software zur Datenerfassung (PolyView) verbunden ist. Bei der Aufnahme von elektrophysiologischen Daten ist es notwendig, alle Einmischung von außen zu eliminieren. Die Aufnahme Gericht, Verstärker und Kopf der Bühne auf einer Luft-Tabelle innerhalb eines Faradayschen Käfigs platziert elektrische und mechanische Störungen zu verhindern, beziehungsweise. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein kommerziell erhältlicher Saugelektrode kann durch Zugabe eines schwereren gauge Silberdraht und eine Spitze aus Kunststoff, die Hand auf einem Spiritusbrenner zu ziehen, oder konstruiert mit handelsüblichen Kunststoffrohren von spezifischen Größen geändert werden. Darüber hinaus ist das Paraffin Dichtstoff mit haltbarer Silikon abdichten Dichtungsmasse ersetzt. <img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Eine schematische Darstellung des Saugelektrode in Bezug auf die Luft-Tabelle (für die mechanische Trennung), Faraday-Käfig (elektrische isolation), Verstärker und Computer. Es wird darauf hingewiesen, dass es eine Masse bezogen, um die Aufnahme Schüssel und einen zweiten Grund, dass die Luft Tisch und Faraday-Käfig verwiesen wird.

<ol><li>Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+rhythmic+locomotor+burst+patterns+using+a+continuous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform.</a> Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Gallarda, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, 233-236 (2008).</li>
<li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+motor+projection+patterns+in+the+chick+hind+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of motor projection patterns in the chick hind limb.</a> J Physiol. 284, 391-414 (1978).</li>
<li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Chanin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+chloride+by+use+of+the+silver-silver+chloride+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode.</a> Science. 119, 323-324 (1954).</li>
<li>Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+controlling+vertebrate+locomotion%3A+moving+in+a+new+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction.</a> Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).</li>
</ol>

Entwicklung des Nervensystems kann studierte unter Verwendung von isolierten Nagetier Rückenmark werden. In Anwesenheit von Neurotransmittern, können fiktive Bewegung aus dem Rückenmark in Form von strukturierten elektrische Aktivität 1,3 erzeugt werden. Diese rhythmischen Ausbrüche sind bei 0,2 bis 0,5 Hz hergestellt und sind in links-rechts und Beuger-Strecker Wechsel gemustert. An verschiedenen Entwicklungsstadien, variiert die Robustheit und Muster dieser Aktivität 1. Genetische Mutationen könn...

<table><tbody><tr><td>PTFE-Sub-Lite-Wand-Schlauch (kleiner Schlauch)</td><td>Zeus</td><td>36AWG</td><td>0,005&amp;#8221;ID x 0,003&amp;#8221; Wand (kleine Teile). Erhältlich auch in 0,003&amp;#8221; bis 0,006&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Großer Schlauch (0,86 mm (0,34&amp;#8221;))</td><td>BD Biosciences</td><td>427420</td><td>0,86 mm (0,34&amp;#8221;) Außendurchmesser, 1,27 mm (0,050&amp;#8221;)</td></tr><tr><td>Elektrodenhülse</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>Klebstoff</td><td>JB Weld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klebstoff: Silikonkitt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lötzinn und Lötkolben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorbleiche</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silberdraht: 0,010&amp;#8221;</td><td>A-M Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insektennadeln: Austerlitz 0,1 mm</td><td>Feine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnetständer</td><td>Narishige International</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>Miniboard (Headstage)</td><td>Grass Technologies</td><td>F-15EB/B1</td><td></td></tr><tr><td>Polyview-Anpassungseinheit</td><td>Grass Technologies</td><td>PVA 8</td><td></td></tr><tr><td>Bipolares tragbares Physiodata-Verstärkersystem</td><td>Grass Technologies</td><td>15LT</td><td></td></tr><tr><td>ANALOG-DIGITAL-KARTE</td><td>National Instruments</td><td>6035E</td><td></td></tr><tr><td>Lufttisch; Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spinal cord elektrophysiologie ii: extrazelluläre saugelektrode fabrication

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Entwicklung von neuronalen Schaltungen und Fortbewegung kann studierte mit Neugeborenen Nagetier Rückenmark central pattern generator (CPG) Verhalten sein. Wir demonstrieren eine Methode, um Saugelektroden, die zur ZMG-Aktivität zu untersuchen sind, oder fiktive Bewegung herzustellen, in seziert Nagetier Rückenmark. Das Nagetier Rückenmark sind in künstlichen Liquor gelegt und die ventralen Wurzeln sind in den Saugelektrode gezogen. Die Elektrode wird durch die Änderung einer im Handel erhältlichen Saugelektrode gebaut. Ein schwerer Silberdraht wird anstelle des Standard-Draht durch das kommerziell erhältliche Elektrode gegeben werden. Das Glas Spitze auf dem kommerziellen Elektrode ist mit einem Kunststoff-Spitze für erhöhte Haltbarkeit ersetzt. Wir bereiten handgezeichneten Elektroden und Elektroden von bestimmten Größen von Rohren gefertigt, wodurch Konsistenz und Reproduzierbarkeit. Die Daten werden gesammelt, mit einem Verstärker und neurogram Akquisition Software. Aufnahmen werden auf einer Luft-Tabelle innerhalb eines Faradayschen Käfigs durchgeführt mechanischen und elektrischen Störungen zu verhindern, beziehungsweise.

Eine Demonstration der Herstellung und Verwendung einer extrazellulären Saugelektrode zur elektrophysiologischen Ableitungen von Neugeborenen Nagetier Rückenmark messen<em&gt; In-vitro-</em

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Die Entwicklung neuronaler Schaltkreise und der Fortbewegung kann anhand des Verhaltens des zentralen Mustergenerators (CPG) im Rückenmark neugeborener Nagetiere untersucht werden. Wir demonstrieren ...

Hallo. Mein Name ist Resh Gary Dory, und ich bin wissenschaftlicher Mitarbeiter im Faf-Labor des Salk-Instituts für Biologische Studien. Heute zeige ich Ihnen, wie man extrazelluläre Saug-Elektroden mit zwei Methoden herstellt. Diese Elektroden können zur Ableitung elektrophysiologischer Signale aus Rückenmarksgeweben in vitro verwendet werden.Verwenden Sie eine Alkohollampe als Wärmequelle, um die PE 90-Kunststoffschläuche auf die gewünschte Breite zu schmelzen. Halten Sie die Schläuche über die brennende Flamme und ziehen Sie sie heraus, sobald sie zu schmelzen beginnen. Ziehen Sie vorsichtig an den Enden, wobei darauf zu achten ist, dass die Mitte nicht bricht. Dieser Vorgang wird erneut gezeigt.Entfernen Sie die Röhre, während sie weich wird und schmilzt, und ziehen Sie vorsichtig die Enden auseinander. Schneiden Sie die Röhre mit einer scharfen Rasierklinge an einer Stelle ab, die der ungefähren Breite der zu messenden Probe am dicken Ende der Röhre entspricht. Führen Sie den Schnitt in einem Winkel von 45 Grad aus.Ein Feral und ein O-Ring müssen nun auf das dicke Ende aufgesteckt werden. Führen Sie dieses Ende des Schlauchs durch die sechseckige Öffnung des Ferals. Danach stecken Sie das Ende des Schlauchs in den gummiartigen O-Ring.Dieser Aufbau wird an der Vorderseite der Elektrode verschraubt. Schneiden Sie ein ein Zentimeter langes Stück Zeus-Kleinschlauch mit einer scharfen Rasierklinge ab und prüfen Sie die Enden auf einen sauberen Schnitt und eine offene Bohrung. Schneiden Sie ein 10 Zentimeter langes Stück PE 90-Schlauch mit einer scharfen Rasierklinge ab. Geben Sie einen Tropfen JB-Weld mit Mundabsaugung in die Mitte des Kleinschlauchs.Ziehen Sie den kleinen Schlauch und die Naht in die Bohrung des großen Schlauchs und lassen Sie diesen Aufbau über Nacht aushärten. Obwohl dies nicht dargestellt ist, sollte am dicken Ende dieses Schlauchs ein 45-Grad-Schnitt angebracht und eine Verschraubungsmutter und eine Dichtscheibe an diesem Ende montiert werden, wie zuvor gezeigt.Zerlegen Sie eine Standard-Saugelektrode, indem Sie die Buchse vom vorderen Ende der Elektrode und den BNC-Stecker vom hinteren Ende abschrauben. An der Seite des Elektrodenrohrs muss nun ein seitlicher Anschluss mit niedrigem Winkel angebracht werden. Erhitzen Sie ein Metallstück mit einem Bunsenbrenner.Drücken Sie das erhitzte Metall in einem flachen Winkel in das vorhandene Loch an der Seite des Laufs. Entfernen Sie den silbernen Draht aus dem BNC-Stecker, indem Sie an der Stelle ziehen, an der der Draht mit dem Stecker verbunden ist. Lassen Sie den BNC-Stecker eine Stunde lang in Xylol einweichen, um das Wachs zu entfernen.Nachdem das Wachs entfernt wurde, spülen Sie den Verbinder mit Wasser ab und trocknen Sie ihn mit Papiertüchern. Schneiden Sie ein 15 Zentimeter langes Stück Silberdraht ab. Legen Sie den Draht 15 Minuten lang in Bleiche ein.Danach mit Papiertüchern abspülen und trocknen. Die Silberdraht an den BNC-Stecker löten. Den Silberdraht in das hintere Ende des Saug-Elektrodenrohrs einführen und so viel Platz lassen, dass der BNC-Stecker seitlich verbleiben kann.Führen Sie den Saugschlauch etwa drei Zentimeter in die Seitenöffnung ein. Injizieren Sie Silikondichtmasse in die hintere Öffnung der Saugelektrode, wobei Sie verhindern, dass sie aus der Seitenöffnung austritt, indem Sie diese mit dem Finger abdecken. Injizieren Sie die Dichtmasse etwa zwei bis drei Zentimeter in den Elektrodenkolben hinein.Wenn der erste Versuch fehlschlägt, schrauben Sie den BNC-Stecker fest an, wodurch die Dichtmasse nach vorne gedrückt wird. Lassen Sie die Dichtmasse über Nacht aushärten. Schrauben Sie das Feral des Schlauchs, das entweder mit der gezogenen Spitze oder der abgeschnittenen Spitze hergestellt wurde, direkt an die Vorderseite der Elektrodenrichtvorrichtung.Das Röhrchen erleichtert das Durchführen des Silberdrahts durch die Elektrode, was nun abgeschlossen ist. Die Ableitungseinrichtung wird zur Verringerung äußerer Störungen in eine Faraday-Kabine gestellt. Unsere Einrichtung befindet sich außerdem auf einem Lufttisch, um mechanische Störungen auszuschließen.Die Elektroden werden auf magnetischen Stativ-Mikromanipulatoren montiert und in die Nähe der Ableitungsschale gebracht. Die BNC-Koaxialkabel werden mit einer Kopfstufe verbunden, die an einen Verstärker angeschlossen ist. Der Verstärker ist über Kabel mit einem Poly-View-Adapter verbunden, der wiederum mit dem Computer verbunden ist.Dieser Aufbau wird vergrößert dargestellt. Die BNC-Koaxialkabel sind mit einer Kopfstufe verbunden. Die Kopfstufe ist mit dem Verstärker verbunden.Der Verstärkerausgang verlässt die Faraday-Kammer und ist mit einem Poly-View-Adapter verbunden. Der Poly-View-Adapter ist mit dem Computer verbunden, auf dem die entsprechende Aufnahmesoftware installiert ist. Der gesamte Aufbau muss ordnungsgemäß geerdet sein.Ein externer Massepunkt wird hergestellt, indem der Faraday-Käfig und der Lufttisch mit einer Masseverbindung verbunden werden. Ein interner Massepunkt wird hergestellt, indem die Schnellschale mit der Kopfstufe verdrahtet wird. Es ist außerdem erforderlich, die Türen des Käfigs mit dem Hauptkörper zu verbinden.Mit der richtigen Einrichtung können nun Daten gesammelt werden. Vielen Dank, dass Sie sich dieses Video angesehen haben, und wir hoffen, es hilft Ihnen bei Ihren zukünftigen Experimenten weiter.

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