Name: Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Lernen Sie mikrochirurgische Techniken zur temporären und permanenten Koronarligatur sowie intramyokardialer Injektion im Mäuseherz. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Ischämie/Reperfusionsschäden.

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Ich möchte die Abteilung Forschung und Graduate Studies für die Bereitstellung von Mitteln, um meine Forschungen und die Abteilung für Vergleichende Medizin für ihre Wachsamkeit und Hilfe zu unterstützen anzuerkennen. Ich möchte auch an das Department of Physiology für ihre Unterstützung und Beratung sowie die Studenten und Techniker in meinem Labor für ihre Hilfe erkennen. Schließlich möchte Ich mag meine Post-Doc-Mentor, Dr. Charles E. Murry, für die Ausbildung die Möglichkeit, während der Zeit lernte ich die Maus Mikrochirurgie danken.

<ol><li> Sterile chirurgische Instrumente (Tabelle 1) und 3 "Wattestäbchen Applikatoren sind auf einem sterilen underpad platziert. Die Perle Sterilisator (Germinator 500) eingeschaltet ist. </li><li> Mäuse (Alter:&gt; 6 Wochen; wt:&gt; 18g) werden anästhesiert mit einer ip Injektion von 20 &amp;mgr; l / g BW von Tribromethanol (250mg/kg, Dauer - ca. 40 Minuten). </li><li> Wenn die Mäuse nicht mehr auf Fuß-und Zuziehen, ein steriles Gleitmittel (Tears Erneute) sind auf die Augen aufgetragen, um sie vor Austrocknung und der linken Seite der Brust zu schützen, ist mit Enthaarungscreme (zB Nair) beschichtet, um Fell von der Haut entfernen. </li><li> Die Enthaarungscreme ist weg mit fließend warmem Wasser und betadine / Alkohol swabbing wird verwendet, um den OP-Bereich zu desinfizieren gewaschen. </li><li> Die Maus ist an einem warmen deltaphase isothermen Pad, die zu einem Plexiglas-Tisch fixiert ist gelegt. Jedes Glied ist immobilisiert mit Klebeband und einem dicken Faden horizontal unter der Spitze Zähne aufgestellt, um den Oberkiefer in Position zu halten. </li><li> Die Tabelle ist vertikal angeordnet und einen faseroptischen Licht direkt glänzte auf den Halsbereich für transösophageale Beleuchtung. Dies erfordert eine präzise Platzierung, so dass die Öffnung der Kehle, als einem gut beleuchteten Öffnung betrachtet wird, so dass die Luftröhre zu visualisieren, um das Einführen der PE-Schlauch zu erleichtern. </li><li> Der Schlauch wird dann an das Beatmungsgerät (verbunden mit einem 95% O 2 / 5% CO 2) verbunden ist konstant Überdruckbeatmung (TOPO Ventilator zu verwalten; bei 125 Atemzüge / min; inspiratorischen Spitzendruck 10-12 cm H 2 O; * Beachten Sie : Einstellungen variieren je nach Belastung und Geschlecht 1-3). Nach Belüftung durch synchrone Bewegungen der Brust bestätigt wird, wird die Verbindung zum Pad mit Klebeband fixiert Extubation während der Operation zu vermeiden. </li><li> Mit Hakenpinzette die Haut nach oben ziehen und weg von der Brust, ein # 10 sterile Skalpell an einem # 3 Skalpellgriff wird ein 1,5 cm Hautschnitt parallel zum Brustbein zu machen. </li><li> Curved Vanna Mikroschere werden verwendet, um die Brustmuskeln geschnitten und machen ein kleines Loch in den Interkostalraum Muskel. </li><li> Gerade, sind stumpf Mikroschere verwendet, um durch 3 Rippen schneiden. </li><li> Eine 9mm pädiatrische Ophthalmologie Spekulum wird verwendet, um den Brustkorb eingezogen. </li><li> Mit der gebogenen Pinzette, ziehen Sie den Herzbeutel vom Herzen weg und nutzen Sie die gezahnten Pinzette vorsichtig aufreißen. </li><li> Mit dem Castroviejo Nadelhalter, ein 6mm konisch Punkt 3 / 8 Nadelfäden die 8-0 Polyethylen Naht unterhalb des linken vorderen absteigenden Koronararterie (entlang der Längsachse des Herzens) senkrecht dazu. <ol><li> Für eine temporäre Ligatur, die für zeitlich Reperfusion entfernt werden können, ist ein steriles 0,5-1cm Stück PE90 auf das Herz parallel zu der koronaren Arterie platziert. Die Naht, die zunächst unter der Koronararterie wurde geschleift, wird dann um den Schlauch verbunden. Zur Zeit ist es freigesetzt wird, ist die Ligatur gelockert. Dies kann beliebig wiederholt und die Zeit der Okklusion / Reokklusion können 4 modifiziert werden können. Abhängig von der Länge des Protokolls und der Art der Anästhesie verwendet, kann eine Ergänzung notwendig sein. </li><li> Für eine dauerhafte Okklusion, ist die Ligatur unter der Koronararterie geschnürt einfach gebunden. Blanchieren und Dyskinesien sind offensichtlich und das lange Ende des Fadens wird geschnitten 5-10. </li><li> Für intramyokardialen Injektion (s), eine sterile Hamilton-Spritze mit einer 30-Gauge sterilen abgeschrägten Nadel wird in die Basis des Herzens über den Bereich der Verletzung auf der rechten Seite der Ligatur eingeführt. Die Nadel wird dann in den Bereich der Verletzung Fortgeschrittene und zurückgezogen geringfügig, so dass die Fase etwa an der Grenzzone zu sehen. Einige der Lösung in der Spritze (2-3μl) ist in das Herz injiziert und die Nadel an ihrem Platz gehalten. Die Spritze wird zurückgezogen anderen 1-3mm und der Rest der Lösung injiziert. Die Spritze wird in Position gehalten, bis die Blase, die durch die entstandene Lösung wird abgeführt. Die Nadel wird dann entfernt. Wenn es eine Blutung, ist ein Wattestäbchen vorsichtig auf die Nadel Insertionsstelle gedrückt, bis die Blutung aufhört 5-7. </li></ol></li><li> Sobald die myokardiale Manipulationen vollständig sind, werden die Rippe Retraktoren entfernt und der Brusthöhle ist mit 2-3 Matratzennähten mit 6-0 surgipro Naht verschlossen. </li><li> Zwei, drei Matratzennähten werden dann gemacht, um die Brustmuskeln zu schließen, 1-3 Tropfen von 0,25% Marcain 1:10 in steriler Kochsalzlösung (0.1ml/25g Maus) ist es, den Muskel aufgetragen und dann 2-3 Matratzennähte gemacht nahe der Haut. </li><li> Die Maus ist aus dem Beatmungsgerät entfernt. Sobald rhythmische, schnelle, flache Atmung überprüft wird, kann die Maus extubiert werden. </li><li> 0,5 ml warme sterile Kochsalzlösung in die dorsale subkutane Raum injiziert und die Maus auf eine wärmende Unterlage in einen Käfig gesetzt, bis sie die Mobilität (1 Stunde minimum) gewinnt. </li><li> Für das Überleben Experimente sind Mäuse zurück in ihre Käfige gesetzt und kehrte nach dem Vivarium, bis die Zeit des Opfers. Während der ersten 2 Tage, angefeuchtete Lebensmittelplatziert auf dem Käfig vom Boden bis zur Fütterung zu erleichtern (so sie nicht auf bis das kann Schmerzen verursachen) und Buprenorphin sollten alle 6-12-Stunden verabreicht werden. Post-operative Betreuung umfasst auch tägliche Überwachung der ersten Woche eine ausreichende Mobilität, Pflege, und Essgewohnheiten zu überprüfen. </li><li> Die chirurgischen Instrumente werden mit Ethanol abgewischt sauber und in die Perle Sterilisator, bevor die nächste Operation. </li><li> Zum Zeitpunkt der Tötung werden die Mäuse mit Natrium-Pentobarbital (65mg/ml, 55-65 mg / kg). Wenn eine angemessene Ebene der Narkose erreicht ist, wird die Brusthöhle eröffnet. </li><li> Während das Herz noch schlägt, eine Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel mit kaltem Kaliumchlorid (KCl, 30mm) oder 2,3-Butandion Monoxim (BDM; 10 mM) wird verwendet, um die Punktion der hinteren basalen Bereich des Ventrikels und die Lösung langsam in die Kammer injiziert, bis das Herz in Diastole verhaftet wird. </li><li> Wenn das Herz entfernt wird, wird eine Spritze mit PBS verwendet, um retrograd perfuse spülen das Herz kein Blut, die Reste zu beseitigen. Für akute Studien, am Ende der Reperfusion Zeit ist der LAD mit der ursprünglichen Stelle der Okklusion wieder ligiert. Eine Lösung, die 1% Evans-Blau in die Aorta injiziert. Wenn das Herz gewonnen wird, ist es quer in 3 Abschnitte von gleicher Dicke geschnitten, inkubiert in 1% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid und bebildert für morphometrische Analysen 11. Bei chronischen Studien, ist das Herz dann in Fixativ eingetaucht, dann verarbeitet und nach Routineverfahren eingebettet. Folien können dann histologisch gefärbt werden und abgebildet für morphometrische Analysen (mit Scion, NIH Image J oder Image Pro Plus) 9,10,12. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Wenn es richtig gemacht, Preise für das Überleben in Mäusen (männlich: Alter 8-10 Wochen, 22-28g; weiblich: Alter 10-12 Wochen, 20-26g) sind: über 90% der akuten Ischämie / Reperfusion und ischämische Präkonditionierung Experimente, über 85% in permanenten Ligatur Studien und ca. 80% für intramyokardialen Injektionen. Seit Anfang Verletzung ist gut sichtbar durch metabolische Veränderungen und nicht strukturell, Infarktgröße Bestimmung in Ischämie / Reperfusion und ischämische Präkonditionierung Experimente ist durch Infusion von 1% Evans blauen Farbstoff in die Aorta, die das Herz, das nicht von der LAD versorgt wird perfuse durchgeführt ( Abbildung 1A). Wenn das Herz entfernt und quer halbieren, wird das Gewebe in 1% ige Lösung von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid zu Infarktgröße (Abbildung 1B) messen inkubiert. Die Flächen werden mit Scion oder NIH-Imaging-Software, die vom Anwender mit einem Mikrometer bei gleicher Vergrößerung abgebildet werden können. Diese Zahlen werden verwendet, um gefährdete Gebiet / linken Ventrikels und Infarktgröße / gefährdete Gebiet 11 zu berechnen. Der Stamm Unterschiede können in Variationen des Körpergewichts und des Herzens Größe und so darauf geachtet werden, diese Maßnahmen zu Herzen Gewicht, Körpergewicht oder Tibia Länge für Vergleichszwecke zu normalisieren sollte führen. Permanent Arterienligation Ergebnisse in grobe strukturelle Veränderungen wie Nekrosen, Wandverdünnung und Kammer Dilatation. Vergleich der Wirkungen der Behandlung und / oder Zeit auf die Infarktgröße und Nekrose in Bezug auf die linke Herzkammer, Kammer-Bereich, Septumwand und linksventrikulären freien Wandstärke in der permanenten Okklusion Modell (Abbildung 2A) können auch unter Verwendung von Scion oder NIH Bildgebung werden Software. Collagen Färbung mit Picrosirius rot / schnell grün (Abbildung 2B) kann verwendet werden, um insterstitial Fibrose, die funktionale Indizes der Wand Versteifung 8-10 korreliert zu messen. Das Bild in Abbildung 3 stellt die Verteilung der 6UL Lösung (Evans-Blau) in der Grenzzone des Herzens nach dem dauerhaften Arterienligation injiziert. Beachten Sie, dass es in Richtung der Verletzungen geht ebenso wie gegen die Basis und auch transmural. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. A. Evan 's Blue in die Aorta vor Exzision injiziert. Dieses Bild zeigt die durchbluteten Regionen des Herzens (gefärbt) und die eingeschlossenen Fläche (ungefärbten). B. Evan' s Blue und TTC-Färbung nach akuter Ischämie / Reperfusion. Dies ist ein repräsentatives Bild (20x), die den blauen Farbstoff Verteilung, die die unoccluded Regionen sowie TTC-Färbung von metabolisch lebensfähiges Gewebe (rot) gefärbt. Nekrotischen Bereichen nicht verfärben und so bleiben sie blass (umrissen). <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. A. Hämatoxylin und Eosin-Färbung. Dies ist ein repräsentatives Bild (20x) von H &amp; E Färbung von einer Maus Herzen quer durch den Infarkt Region um 4 Tage verkürzt post-MI (20x). Der * kennzeichnet Gewebsnekrose, zeigen Pfeile, um Granulationsgewebe, RV = rechter Ventrikel und LV = linker Ventrikel. B. Picrosirius rot und schnell grün färben. Dies ist einerepräsentatives Bild (20x) von Picrosirius rot / grün Färbung schnell von einem Querschnitt der Maus Herz 4 Wochen post-MI. Das Zytoplasma färbt grün und kollagenen Fasern sind rot. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Evans Blau Farbstoff Fleck Verteilung folgenden 6UL intramyokardialen Injektion. Dies ist ein repräsentatives Bild zeigt die globale Verteilung und transmurale des blauen Farbstoffs Evans ganzen Herzen nach 6UL intramyokardialen Injektion an der Grenzzone unmittelbar nach einer koronaren Ligation (12x).

Dieses Tier-Protokoll wurde von zugelassen und wird in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der East Carolina University gesetzt.

Koronare Herzkrankheit weiterhin ein epidemiologisch und steuerlich erhebliche Problem der öffentlichen Gesundheit werden. Erhebliche Grundlagenforschung ist noch nötig, um die Mechanismen, durch die Verletzung und den Umbau vor und wie potenzielle Therapeutika modulieren kann diese Prozesse, wenn sie für den klinischen Einsatz entwickelt werden, zu verstehen. Nagetiere werden am häufigsten verwendet und die breite Palette von genetisch veränderten Mäusen zur Verfügung stellt, diese Art ein attraktives Modell. Obwohl es Unterschiede zwischen Mäusen und anderen Tierarten, es gibt viele Vorteile zu einem Mausmodell. Verwenden eines einfachen Binokular oder Lupe und gut beleuchtet Bedingungen ermöglichen das Gefäßsystem zu leicht zu erkennen (für detaillierte makroskopischen Anatomie des Gefäßsystems, siehe Salto-Tellez et al., 2004 13). Um das Risiko von post-operative Sterblichkeit, ist es sehr wichtig, um zu vermeiden Durchtrennung großer Gefäße, da die gesamte Blutvolumen eines 25g Maus ist weniger als 2 ml 14. Für den Fall, dass eine übermäßige Blutungen auftreten, können sanfte Anwendung von Druck oder stecknadelkopfgroße Verätzungen verwendet werden, um die Blutung zu stoppen. Dieses Verfahren kann auch in einer Vielzahl von Arten modifiziert werden. Zum Beispiel können Mäuse betäubt werden mit Isofluran, Ketamin / Xylazin oder Natrium-Pentobarbital und entsprechende Auswahl wird durch die Dauer des Protokolls 15-18 bestimmt. Die Zehen Prise Reflex ist das am häufigsten verwendete Index der Tiefe der Anästhesie. Weitere, um die Wahrscheinlichkeit für das langfristige Überleben zu verbessern, verwenden einige Forscher Antiarrhythmika wie Lidocain, um die Inzidenz von tödlichen Arrhythmien 19,20 es jedoch zu berücksichtigen, dass dieser vor kurzem wurde gezeigt, dass antiapoptotischen Eigenschaften in eine akute haben reduzieren Modell 21. Auch, um postoperative Schmerzen zu reduzieren, können Schmerzmittel wie Buprenorphin für die ersten 48 Stunden nach der Operation 3,16,17,22,23 verabreicht werden. Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur während der Operation (vor allem für längere Protokolle), ist eine rektale Sonde in Reihe mit einem Heizkissen oft an die Stelle der isothermen Pad verwendet. Für Ischämie / Reperfusion und / oder ischämische Prä-oder postconditioning: die Dauer der Okklusion (s) und Reperfusion (s) können verändert werden; für die permanente Okklusion, die Größe des Infarktes kann durch Einstellen der Lage der Ligatur geändert werden; und für intramyokardialen Injektionen (zB Zellen, Proteine), kann es 1-3 Injektionsstellen werden und das Volumen pro Injektion kann bis zu 15 ul 24. Wenn Zellen injiziert wird, verwendet der Feinheit der Nadel (in der Regel 26-30) 5,25,26 basierend auf der Größe der Zellen sollte so gewählt werden, der Innendurchmesser der Nadel ist groß genug, um zu vermeiden Scheeren. Um zu vermeiden, verwirrt durch entzündliche Prozesse durch die Operation ausgelöst haben einige Forscher berichteten über eine Schlinge, die ex vivo zu verschließen und reperfuse die Herzen in einem geschlossenen Kasten mit der Maus an einer beliebigen Stelle nach der Operation 27-29 manipuliert wird. In jüngerer Zeit Gao et al. 30 haben gezeigt, dass temporäre und permanente Okklusion ohne die Notwendigkeit für die Belüftung durchgeführt werden kann und ein paar Labors haben damit begonnen, Ultraschall verwenden, um bei geschlossener Brust intramyokardialen Injektionen 25,31 auszuführen. Seit der ersten Studie demonstriert Machbarkeit der Ligation der Koronararterie in Mäusen wurde von Johns und Olson 1954 32 Erscheinungsweise, viele andere dieses Modell übernommen und modifiziert sie, um verschiedene Aspekte der myokardialen Verletzungen und Umbau 3,33-45 studieren. Die Art von Mäusen in Bezug auf Größe, Fortpflanzungsfähigkeit, und vergleichsweise weniger Aufwand für Anschaffung und Wartung machen diese Art ein ansprechendes Werkzeug für ein breites Spektrum von physiologischen und pathophysiologischen Studien. Da die Miniaturisierung von Technologie für die Bildgebung in vivo Fortschritte 46-49, sowie Mittel zur Durchführung und Analyse von großen Maßstab Genomik und Proteomik, Wirkstoff-Screening, die Wirksamkeit der Zell-und / oder Protein-Therapien sowie Biomaterialien 50-64, kombiniert mit der zunehmend breite Palette von genetischen Manipulationen durch ubiquitäre oder Gewebe spezifische transgene oder Mutanten / Knockout-Mäusen ergab, wird die Maus-Modell des Myokardinfarkts zweifellos auch weiterhin ein unverzichtbares Werkzeug in die Bewertung der akuten kardialen Verletzungen und langfristigen Umbau werden. Deshalb gibt es unbestreitbaren Wert in der Lage, diese Experimente zuverlässig und reproduzierbar durchführen.

<table><tbody><tr><td>Lange Vanna-Schere</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-159</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präzisionsschere</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-161</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette &amp;#8211; gerade, 1x2 Zähne</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-205</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff Nr. 3</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-64</td><td>#10 steriles Skalpellblatt</td></tr><tr><td>Pinzette &amp;#8211; halbgekrümmt, gezahnt</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-19</td><td></td></tr><tr><td>Gewebeschere</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-410</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo-Nadelhalter</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-1828</td><td></td></tr><tr><td>Cook Augenspekulum</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-63</td><td></td></tr><tr><td>Surgipro II 8-0</td><td>Suture Express</td><td>VP-900-X</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Suture Express</td><td>8776</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Bead-Sterilisator</td><td>Cellpoint Scientific</td><td>65369-1</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase isothermes Heizpad</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton-Spritze – 25&amp;mu;l</td><td>Hamilton Co</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>30-Gauge-Schneidnadel mit Abschrägung</td><td>Hamilton Co</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Beatmungsgerät</td><td>Kent Scientific</td><td>TOPO</td><td></td></tr></tbody></table>

koronare ligation und intramyokardialen injection in einem mausmodell der infarkt

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mausmodelle sind ein wertvolles Hilfsmittel, um akute Verletzungen und chronische Umbauprozesse des Myokards in vivo zu untersuchen. Durch die Möglichkeit genetischer Modifikationen des gesamten Organismus oder des Myokards sowie durch eine Vielzahl biologischer und/oder synthetischer Materialien besteht ein großes Potenzial, beliebige Kombinationen dieser Ansätze einzusetzen, um das Ausmaß akuter ischämischer Schädigungen zu verringern und das Einsetzen einer Herzinsuffizienz infolge des myokardialen Umbaus hinauszuzögern.
Hier stellen wir die Methoden und Materialien vor, die zur zuverlässigen Durchführung dieser Mikrochirurgie verwendet werden, sowie die erforderlichen Modifikationen für Studien mit vorübergehender (mit Reperfusion) oder dauerhafter Okklusion der Koronararterie sowie für intramyokardiale Injektionen. Die Effekte am Herzen, die während des Eingriffs sowie am Ende des Experiments beobachtet werden können, zusätzlich zur histologischen Auswertung, bestätigen die Wirksamkeit.
Kurz gesagt umfasst die chirurgische Vorbereitung die Anästhesie der Mäuse, das Entfernen des Fells an der Brust und anschließend die Desinfektion des Operationsgebiets. Die intratracheale Intubation erfolgt mittels transösophagealer Beleuchtung mit einem faseroptischen Licht. Anschließend wird die Kanüle mit einem Beatmungsgerät verbunden. Ein Schnitt an der Brust legt die Brustmuskulatur frei, die durchtrennt wird, um die Rippen sichtbar zu machen. Für Ischämie/Reperfusion-Studien wird ein 1 cm langes Stück PE-Schlauch über das Herz gelegt, um daran die Ligatur anzubringen, sodass die Okklusion und Reperfusion individuell angepasst werden kann. Für intramyokardiale Injektionen wird eine Hamilton-Spritze mit steriler 30-Gauge-Schneidnadel verwendet. Nach Abschluss der myokardialen Eingriffe werden Rippenkorb, Brustmuskulatur und Haut nacheinander verschlossen. Die Analgesie mittels Line-Block wird durch 0,25 % Marcain in steriler Kochsalzlösung erreicht, die vor dem Verschluss der Haut auf die Muskelschicht aufgetragen wird. Die Mäuse erhalten eine subkutane Kochsalzinjektion und werden in eine Wärmekammer gebracht, bis sie sternale Rückenlage einnehmen. Anschließend werden sie in den Tierstall zurückgebracht und unter Standardbedingungen bis zur Gewebegewinnung gehalten. Zum Zeitpunkt der Tötung werden die Mäuse anästhesiert, das Herz wird mittels KCl oder BDM in der Diastole stillgelegt, mit Kochsalzlösung gespült und in Fixiermittel eingetaucht. Danach werden routinemäßige Verfahren zur Gewebeaufbereitung, Einbettung, Schnittführung und histologischen Färbung durchgeführt.
Die nichtchirurgische Intubation einer Maus sowie die beschriebenen mikrochirurgischen Manipulationen machen dieses Modell technisch anspruchsvoll hinsichtlich Erlernen und Reproduzierbarkeit. Diese Verfahren, kombiniert mit der Schwierigkeit, konsistente Handgriffe bei der Ligatur zur zeitlich gesteuerten Okklusion(en) und Reperfusion oder bei intramyokardialen Injektionen durchzuführen, können ebenfalls die Überlebensrate beeinflussen, sodass eine Optimierung und Konsistenz von entscheidender Bedeutung sind.

Zahlreiche genetische Manipulationen und / oder intramyokardialen Injektionen von Genen, Proteinen, Zellen und / oder Biomaterialien basieren auf die Dimension der Zeit in Studien zur akuten Ischämie / Reperfusion und chronischer Umbau in Mäusen überlagert. Dieses Video zeigt die mikrochirurgische Verfahren für die Ischämie / Reperfusion, permanent koronare Ligation und intramyokardialen Injektion Studien.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Mausmodelle sind ein wertvolles Instrument zur Untersuchung von akuten Verletzungen und chronischem Remodeling des Myokards in vivo. Mit dem Aufkommen genetischer Modifikationen an ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die mikrochirurgischen Methoden zur Durchführung einer vorübergehenden oder dauerhaften Ligatur der Koronararterie sowie einer intramyokardialen Injektion im Herzen der Maus zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Operationsbereich präpariert und desinfiziert wird. Anschließend wird die Maus mit PE-90-Schlauchkanüle intubiert, um während der Thorakotomie eine Beatmung mit positivem Druck bereitzustellen.Nach der Isolierung kann die Koronararterie vorübergehend oder dauerhaft verschlossen werden. Zusätzlich kann eine Substanz in das Herz injiziert werden. Die Ergebnisse zeigen das Ausmaß der am Herzen verursachten Schädigung anhand histologischer und morphometrischer Endpunkte, Gewebe- und Serumproteinkennzeichen sowie funktioneller Indizes.Mein Name ist TKA Rag und ich arbeite an der Abteilung für Physiologie an der Brody School of Medicine der East Carolina University. Der Zweck dieses Videos besteht darin, die mikrochirurgischen Verfahren zur vorübergehenden und dauerhaften Ligatur der Koronararterie sowie zur intramyokardialen Injektion in das Herz einer Maus zu demonstrieren. Legen Sie zunächst sterile chirurgische Instrumente und drei Zoll lange Wattestäbchen auf eine sterile Unterlage.Schalten Sie als Nächstes einen Perlensterilisator ein, damit er bereit ist, Instrumente zwischen den einzelnen Eingriffen zu sterilisieren. Um das Tier auf die Operation vorzubereiten, tragen Sie ein steriles Gleitmittel auf die Augen einer anästhesierten Maus auf. Entfernen Sie anschließend mit einem Enthaarungsmittel wie Nare das Fell von der linken Seite der Brust.Den Enthaarungscreme gründlich abwischen, um chemische Verbrennungen oder Dermatitis zu vermeiden. Die Maus auf eine isotherme Delta-Phasen-Auflage legen, die an einem Plexiglastisch befestigt ist. Jedes Gliedmaßen mit Klebeband fixieren und einen dicken Faden unter die oberen Zähne legen, um den Oberkiefer an Ort und Stelle zu halten.Reinigen Sie die Operationsstelle insgesamt dreimal abwechselnd mit Betadine und Alkohol. Verwenden Sie ein faseroptisches Licht, um den Halsbereich auszuleuchten und die Trachea während des Einführens des PE-Schlauchs besser sichtbar zu machen. Sobald die Stelle ausgeleuchtet ist, führen Sie den Schlauch vorsichtig durch den Mund ein.Verbinden Sie den Schlauch mit einem Beatmungsgerät, um eine Beatmung mit positivem Druck durchzuführen. Sobald die Beatmung durch synchronisierte Brustbewegungen bestätigt ist, befestigen Sie die Verbindung mit Klebeband an der Unterlage, um sie an Ort und Stelle zu halten. Ziehen Sie während der Operation mit einer gezahnten Pinzette die Haut vom Brustkorb nach oben weg und führen Sie einen 1,5 cm langen Schnitt in der Haut parallel zum Brustbein durch.Verwenden Sie anschließend gebogene Vana-Mikroscheren, um die Brustmuskulatur zu durchtrennen und ein kleines Loch in den Interkostalmuskel zu schneiden. Nachdem der Muskel zurückgezogen wurde, schneiden Sie mit geraden stumpfen Mikroscheren durch drei Rippen. Verwenden Sie einen Spekulum, um den Rippenkorb zurückzuhalten.Öffnen Sie vorsichtig den Herzbeutel, um das Herz sichtbar zu machen, wobei Sie einen TRO-Viejo-Nadelhalter und eine Nadel mit konischem Punkt sowie einen daran befestigten Polyethylenslit unter der linken absteigenden Koronararterie verwenden, um eine vorübergehende Ligatur anzulegen, die zur zeitlich begrenzten Reperfusion entfernt werden kann. Schneiden Sie ein 0,5 bis 1 cm langes Stück PE 90 zu und legen Sie es auf das Herz. Binden Sie parallel zur Koronararterie den unter diese geschlungenen Faden an das Schlauchstück. Nach einer festgelegten Zeitspanne lockern Sie die Ligatur, um die Reperfusion zu ermöglichen, oder führen Sie eine dauerhafte Okklusion durch.Die unter die Koronararterie geschlungene Ligatur wird zugebunden. Eine Blässe und Dyskinesie sollten erkennbar sein. Schneiden Sie das lange Ende der Naht für intramyokardiale Injektionen ab, und führen Sie eine sterile 30-Gauge-Nadel in die Herzbasis oberhalb des verletzten Bereichs rechts der Ligatur ein.Führen Sie die Nadel in den verletzten Bereich ein und ziehen Sie sie leicht zurück, sodass die Schneide etwa am Übergangsbereich sichtbar ist. Injizieren Sie eine kleine Menge der Lösung und halten Sie die Nadel an Ort und Stelle. Ziehen Sie die Spritze um weitere ein bis drei Millimeter zurück und injizieren Sie den Rest der Lösung.Halten Sie die Spritze so lange an Ort und Stelle, bis das durch die Lösung entstandene Blut verschwunden ist. Sobald es verschwunden ist, entfernen Sie die Nadel. Falls Blutungen auftreten, drücken Sie vorsichtig einen mit Watte bestückten Applikator auf die Stelle, bis die Blutung stoppt.Nach Abschluss der myokardialen Manipulationen die Rippenretraktoren entfernen und die Brusthöhle mit zwei bis drei Matratzenraffnähten verschließen. Anschließend die Brustmuskulatur mit zwei bis drei Matratzenraffnähten verschließen. Ein bis drei Tropfen von 0,25 %marking in steriler Kochsalzlösung auf den Muskel auftragen und die Haut mit zusätzlichen zwei bis drei Matratzenraffnähten verschließen.Nehmen Sie die Maus vom Beatmungsgerät und stellen Sie sicher, dass eine rhythmische, schnelle, flache Atmung vorliegt. Injizieren Sie 0,5 Milliliter warme sterile Kochsalzlösung in den dorsalen subkutanen Raum und stellen Sie die Maus in einen Käfig mit einer Heizplatte, bis sie sich wieder bewegen kann. Für Überlebensversuche werden die Mäuse in ihre Heimkäfige zurückgebracht und in das Tierhaus zurückgegeben, bis zum Zeitpunkt der Tötung.Reinigen Sie die chirurgischen Instrumente mit Ethanol und führen Sie sie zur Vorbereitung auf die nächste Operation zum Sammeln von Proben für die Analyse in den Kugelsterilisator ein. Isolieren Sie das Herz und punktieren Sie die hintere basale Region des Ventrikels mit einer Nadel, die kaliumchloridhaltige Lösung oder eine zwei-drei-Butan-Dion-Monoxid-Lösung enthält. Injizieren Sie die Lösung langsam in die Kammer, bis das Herz in der Diastole stillsteht. Entfernen Sie das Herz und spülen Sie es mit PBS, um verbleibendes Blut zu entfernen.Nach der Perfusion wird das Herz in Fixiermittel eingetaucht und anschließend gemäß routinemäßiger Verfahren verarbeitet und eingebettet. Die akute Schädigung durch vorübergehende Ligatur kann mittels Färbung sichtbar gemacht werden. In diesem Bild verteilt sich der blaue Farbstoff auf die okkludierten Bereiche des Herzens, und die TTC-Färbung markiert metabolisch vitales Gewebe.In Rot erscheinen nekrotische Bereiche ungefärbt und bleiben daher blass. Mit Bildgebungssoftware kann die betroffene Fläche in Relation zum linken Ventrikel sowie die Infarktfläche in Relation zur betroffenen Fläche berechnet werden. In diesem Beispiel wurde ein verletztes Herz vier Tage nach einem Myokardinfarkt quer durch den Infarktbereich geschnitten und mit Hämat, Hämatin und Eosin gefärbt.Der Stern kennzeichnet eine Gewebenekrose, während die Pfeile auf die Kollagenfärbung des Granulationsgewebes mit Prose zeigen. Siriusrot und Schnellgrün können zur Messung der interstitiellen Fibrose verwendet werden, die mit funktionellen Indizes der Wandversteifung korreliert. Dieses Bild eines Mausherzens vier Wochen nach einem Myokardinfarkt zeigt das Zytoplasma grün und die Kollagenfasern rot gefärbt.Diese Bildserie zeigt die Verteilung von sechs Mikrolitern Evans-Blau-Farbstofflösung, die in die Grenzzone des Herzens nach dauerhafter Arterienligatur injiziert wurde. Beachten Sie, dass sich der Farbstoff sowohl in Richtung der Verletzung als auch zur Basis hin ausbreitet und zudem transmural verläuft. Die Visualisierung der Koronararterie und eine zuverlässige Okklusion darzustellen, ist sehr anspruchsvoll und erfordert viel Übung, um darin versiert zu werden.Während des Eingriffs ist es sehr wichtig, darauf zu achten, die Lunge nicht zu verletzen, und außerdem darauf zu achten, eine Extubation des Tieres während der chirurgischen Manipulationen zu vermeiden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt, wie eine schnelle und zuverlässige Modell nutzen, um pathobiologischen und pathophysiologischen Prozessen der Myokardischämie zu studieren.

LAD-Ligation: einem Mausmodell der Myokardinfarkt

Das chirurgische Verfahren zum experimentellen Herzinfarkt in Mäusen zu induzieren beginnt mit linken Thorakotomie zwischen der dritten und der vierten Rippe, um die vordere Oberfläche des Herzens und linken Lunge visualisieren. Die linke Koronararterie ligiert ist, wird die Brust geschlossen und der Maus erlaubt ist, spontan zu erholen.

Geändert Technik für Coronary Artery Ligation in Mäuse

In diesem Video beschreiben wir einen chirurgischen Eingriff, um ein Mausmodell für einen Myokardinfarkt zu erstellen, indem die linke anteriore absteigende Koronararterie dauerhaft ligiert wird.

Generierung eines Mausmodells des Myokardinfarkts: Ein chirurgisches Verfahren zur dauerhaften Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie im Mausmodell

Wir stellen ein chirurgisches Verfahren, experimentelle Ischämie / Reperfusions (I / R) Schädigung induzieren Myokardinfarkt (MI) in Mausmodellen, die für mehr Klarheit in der Positionierung der Ligation an der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) simulieren können, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen MI Experimente in Mäusen.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Ein hochgradig reproduzierbares Modell für Myokardinfarkt bei Mäusen mit minimalinvasiven Manipulationen wird beschrieben. Das Modell kann einfach durchgeführt werden, was zu einer hohen Reproduzierbarkeit und Überlebensrate führt. Somit wird das beschriebene Modell die Anzahl der benötigten Tiere reduzieren, wie es das 3R-Prinzip (Replacement, Refinement and Reduction) verlangt.

Minimal-invasive chirurgische Verfahren zur Induktion Myokardinfarkt in Mice

Herzinsuffizienz ist die Hauptursache für Krankenhausaufenthalte und eine der Haupttodesursachen. Ein Modell der permanenten Ligatur der linken anterioren absteigenden Koronararterie bei Mäusen wird angewendet, um den ventrikulären Umbau und die kardiale Dysfunktion nach einem Myokardinfarkt zu untersuchen. Die Technik der invasiven hämodynamischen Messungen an Mäusen wird vorgestellt.

Permanent Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie bei Mäusen: Ein Modell der Post-Myokardinfarkt Umbau und Herzinsuffizienz

Wir bieten eine zuverlässige Methode für die Ligatur der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) in einem Mausmodell an. Diese Methode ist vergleichsweise weniger invasiv als andere Methoden, die eine endotracheale Intubation, einen linksseitigen Thorakotomieansatz und eine Thorakozentese umfassen. Diese Methode kann sowohl als Modell für akuten als auch für chronischen Myokardinfarkt (MI) verwendet werden.

Murine linken vorderen absteigenden (LAD) Koronararterienligatur: ein verbessertes und vereinfachtes Modell für Myokardinfarkts

Hierin beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren, das zeigt, wie eine dauerhafte Ligation der links-vorderen absteigenden Herzkranzgefäße bei Mäusen erreicht werden kann. Dieses Modell ist von hoher Relevanz für die Untersuchung der Pathophysiologie des Myokardinfarkts und der damit einhergehenden biologischen Prozesse.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Dieser Artikel zeigt ein Modell zur Untersuchung des Herzumbaus nach Myokard-Kryoverletzung bei Mäusen.

Ein Cryoinjury-Modell zur Untersuchung des Myokardinfarkts in der Maus

Hier wird ein chirurgisches Verfahren zur permanenten Ligatur der linken Koronararterie bei Mäusen vorgestellt. Mit diesem Modell kann die Pathophysiologie und die damit verbundene Entzündungsreaktion nach Myokardinfarkt untersucht werden.

Linke Koronararterienligatur: Ein chirurgisches Mausmodell des Myokardinfarkts

Lernen Sie mikrochirurgische Techniken zur temporären und permanenten Koronarligatur sowie intramyokardialer Injektion im Mäuseherz. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Ischämie/Reperfusionsschäden.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

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