Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe des fokussierten Ionenstrahls und des Rasterelektronenmikroskops serielle Bilder durch eine bestimmte Region des Hirngewebes zu sammeln. Dies wird erreicht, indem das Gehirn zuerst in Scheiben geschnitten wird, die gefärbt und dann mit Harz eingebettet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die interessierende Region aus dem eingebetteten Gehirnabschnitt herauszuschneiden und auf einen leeren Harzblock zu montieren.

Der dritte Schritt besteht darin, den Harzblock mit einem Ultramikrotom zu beschneiden und mit dem Ionenstrahl des Mikroskops nur den abzubildenden Bereich zu isolieren. Der letzte Schritt besteht darin, eine Fläche des Harzblocks seriell abzubilden, wobei der Ionenstrahl verwendet wird, um vor jeder Aufnahme wiederholt dünne Schichten zu entfernen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die serielle Bilder durch einen interessierenden Bereich zeigen.

Die Bildserie wird automatisch erfasst, und der Datensatz verfügt in der Regel über isotrope Voxel, sodass die Bildstrukturen aus jedem Winkel im Stapel betrachtet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den bestehenden Methoden wie der Transmissionselektronenmikroskopie mit seriellem Schnitt besteht darin, dass eine viel höhere Z-Auflösung erreicht werden kann. Und im Vergleich zur Elektronentomographie ist sie in der Lage, viel größere Volumina mit einer optimalen Auflösung für in Harz eingebettete Proben abzubilden.

Das Verfahren beginnt mit der Präparierung des fixierten Gehirns einer anästhesierten perfundierten Ratte. Betten Sie das Gehirn in warme 5%-Aeros in eine Kunststoffform ein, richten Sie das Gehirn in den richtigen Winkel aus, bevor die Aros fest eingestellt werden. Montieren Sie den Aeros-Block mit dem Gehirn darin auf einem Probenhalter mit einer Vibrato-Schnitte. 80-Mikrometer-Koronalschnitte schneiden so viele Abschnitte, wie benötigt werden, um die interessierende Region einzubeziehen.

Geben Sie anschließend die Proben in 20-Milliliter-Isolierfläschchen aus Glas. Platzieren Sie bis zu 10 Abschnitte pro Durchstechflasche. Die Proben werden dreimal für jeweils fünf Minuten in 0,1 molaren K-Coat-Puffer gespült.

Anschließend werden die Proben 30 Minuten lang mit 1,5 % Kaliumcyanid und 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 molar K Coat-Puffer gefärbt. Färben Sie die Proben 30 Minuten lang mit 1 %Osmiumtetroxid in 0,1 molaren K-Coat-Puffer. Nach diesem Spülen einmal drei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser spülen, dann 30 Minuten lang mit 1%al Acetat in doppelt destilliertem Wasser färben.

Spülen Sie die Abschnitte anschließend fünf Minuten lang in doppelt destilliertem Wasser ab und dehydrieren Sie sie dann in einer abgestuften Alkoholserie, wobei Sie für jeden Wechsel zwei Minuten einplanen. Der nächste Schritt besteht darin, die Abschnitte in steigenden Konzentrationen von Duran-Harz einzubetten, das mit Alkohol vermischt wird, wobei zwischen den Wechseln 30 Minuten liegen. Beginnen Sie mit 50 bis 50 % Ethanol zu Harz, dann 30 bis 70, dann 10 bis 90, schließlich an den Abschnitten auf 100% Harz für 30 Minuten.

Ersetzen Sie dann das Medium durch 100% frisches Duran-Harz. Eine Stunde lang langsam auf dem Walzenmischer rühren. Nach dem Einbetten legen Sie die Schnitte mit einem hölzernen Cocktailspieß auf Glasmikroskop-Objektträger, die zuvor mit Schimmeltrennmitteln beschichtet wurden.

Legen Sie so viele Abschnitte wie möglich auf die Folien, aber achten Sie darauf, die Folien nicht zu überladen. Stellen Sie sicher, dass sich auch ein Identitätsetikett zwischen den Objektträgern befindet. Legen Sie die Objektträger für 24 Stunden in einen 65 Grad Celsius heißen Ofen.

Am nächsten Tag nehmen Sie die Proben aus dem Ofen. Schieben Sie vorsichtig eine Rasierklinge zwischen die Objektträger und entfernen Sie die Harzschicht mit den Proben zwischen den Objektträgern, wobei Sie die Harzschicht mit den Fingern halten. Waschen Sie die Probe vorsichtig unter fließendem Wasser.

Um Schimmeltrennungsmittel zu entfernen, legen Sie die Probe unter ein Präpariermikroskop mit Durchlichtbeleuchtung und verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Leistung. Markieren Sie den interessierenden Bereich mit einer feinen Nadel. Schneide mit einer Rasierklinge ein kleines Quadrat von drei Millimetern mal drei Millimetern um den interessierenden Bereich herum.

Verwende Acrylkleber, um den kleinen Harzblock an der Oberseite eines leeren Harzblocks zu befestigen. Klemmen Sie dann den Block in die Halterung des Ultramikrotoms. Schauen Sie durch das angebrachte Stereomikroskop und schneiden Sie mit einer Rasierklinge um den interessierenden Bereich herum, bis nur noch eine kleine Pyramide aus Material übrig bleibt.

Schneiden Sie die Kante des Blocks in der Nähe des interessierenden Bereichs in einem Winkel zur Oberseite des Blocks mit einem Glasmesser, das am Ultramikrotom befestigt ist. Schneiden Sie den Block weiter zu, sodass der interessierende Bereich in Bezug auf die Abmessungen der Blockoberfläche genau lokalisiert werden kann. Entfernen Sie den Block aus dem Ultramikrotom und legen Sie ihn unter ein Durchlichtmikroskop.

Fotografieren Sie die Region von Interesse. Schneide den abgeschnittenen Block mit einer Juweliersäge mit Kohlefarbe vom restlichen Harzstummel ab. Kleben Sie den SA-Off-Block auf einen REM-Probenhalter und richten Sie ihn so aus, dass die abzubildende Seite zur äußersten Kante zeigt.

Nachdem der Kleber getrocknet ist, überführen Sie das Präparat in ein Sichel- und Vakuumverdampfungssystem und beschichten Sie den Block mit einer dünnen Goldschicht von mehr als 20 Nanometern. Der in Harz eingebettete Gewebeblock ist nun bereit, im fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskop abgebildet zu werden. Führen Sie die Probe in ihrem Halter bei geringer Vergrößerung in das Mikroskop ein und richten Sie den Block mit Hilfe der Sekundärelektronenbildgebung so aus, dass der interessierende Bereich und die Seite des abzubildenden Blocks nach oben zeigen.

Der Bediener richtet den Block so aus, dass die abzubildende Fläche parallel zum Fräsbalken liegt. Dies führt dazu, dass der Elektronenstrahl mit einem Ionenstrahlstrom von 13 bis 27 Nanoampere in einem Winkel von 54 Grad zu dieser Fläche ausgerichtet wird. Bei 30 Kilovolt.

Entfernen Sie ein schmales Harzband von der Vorderseite des abzubildenden Bereichs. Wechseln Sie als Nächstes in den Modus für die rückseitige Streuung, um die gefräste Fläche anzuzeigen, die über dem interessierenden Bereich liegt. Lokalisieren Sie anhand des zuvor aufgenommenen lichtmikroskopischen Referenzbildes und des Bildes der gefrästen Fläche den genauen Bereich auf dem zu fräsenden Block und bilden Sie es mit dem Gasinjektionssystem des Mikroskops ab.

Eine etwa ein Mikrometer dicke Schutzschicht aus Kohlenstoff oder Metall mit einem Strom von 700 Pikoampere auf die Oberfläche des Blocks oberhalb des interessierenden Bereichs auftragen. Fräsen Sie abschließend den Bereich des Blocks, in dem die endgültigen Bilder aufgenommen werden. Lassen Sie den Fräsbalken diese Bildfläche vollständig fräsen, bis keine Fräsartefakte mehr auf der Fläche zu sehen sind.

Wählen Sie die Mikroskopparameter für die serielle Bildgebung des Gesichts aus. Typische Parameter sind Spannungen zwischen 1,2 und zwei Kilovolt mit Pixelgrößen zwischen vier und 20 Nanometern. Die Pixelverweilzeit sollte etwa 10 Mikrosekunden betragen, sodass die Gesamtzeit zum Fräsen des Gesichts und zur Aufnahme eines Bildes weniger als zwei Minuten beträgt.

Lassen Sie das Mikroskop mindestens zwei Stunden ruhen, damit sich die Temperatur ändert. Um sich aufzulösen, starten Sie den Fräs- und Bildgebungsprozess, um serielle Bilder durch den interessierenden Bereich aufzunehmen. Diese Abbildung zeigt das umgekehrte Kontrast-Rück-Streubild der Blockfläche, das die Ultra-Struktur innerhalb einer Region des Wrap-Gehirns zeigt.

Alle Membranen sind sichtbar, ebenso wie große makromolekulare Strukturen. Diese Abbildung setzt sich aus insgesamt 1.600 Bildern zusammen, die in einem Abstand von fünf Nanometern aufgenommen wurden, was zu einem Bildstapel mit isotropen Voxeln führt. Dieser Stapel kann in jeder Ebene mit der gleichen Auflösung abgebildet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Gehirngewebe für die serielle Bildgebung mit dem fokussierten Rasterelektronenmikroskop vorbereiten können.