Patterning Cells auf optisch transparenten Indium-Zinn-Oxid-Elektroden

Hallo, ich bin Isha. Ich bin Doktorandin im zweiten Jahr im Labor von Dr. Zen. Wir sind hier am Department of Biomedical Engineering an der University of California Davis.

Heute zeige ich Ihnen die Kontrolle von Ian an mikrofabrizierten, optisch transparenten Indium-10-Oxid-Elektroden im Rahmen von Tissue Engineering und Regenerationsbemühungen, um die Mikroumgebung des Organs nachzuahmen. Um diese Mikroumgebung in vitro zu schaffen, ist es unerlässlich, Zellen räumlich und zeitlich auf einem Substrat zu isolieren. Wir sind daran interessiert, Oberflächen zu entwerfen, auf denen wir die Position verschiedener Leberzelltypen kontrollieren können.

Im heutigen Experiment werden wir Oberflächenmodifikation, Mikrofabrikation und Elektrochemie nutzen, um eine Oberfläche zu formen, die von zellnicht-adhäsiv auf zelladhäsiv umgeschaltet werden kann. Der erste Schritt ist die Fotolithographie. Hier ist ein Flussdiagramm, das zeigt, wie dieser Prozess ablaufen wird.

Das Blau ist das Glaslicht, das Grün ist Indium-10-Oxid, das auf das Glaslicht aufgetragen ist. Zuerst werden wir den Fotolack rot drehen, der hier auf dem Indium 10 oxidbeschichteten Glaslicht gezeigt wird. Dann werden wir das durch eine Fotomaske an ultraviolettes Licht weitergeben und die belichteten Bereiche werden in einer Entwicklungslösung entwickelt.

Die ITO-Bereiche, die nicht durch Fotolack geschützt sind, werden in IT oing entfernt. Und schließlich wird der gesamte verbleibende Fotolack in Aceton entfernt, um unsere ITO-Elektroden zu bilden. Hier ist das Flussdiagramm der verbleibenden drei Schritte.

Zuerst werden wir die gesamte Oberfläche mit Peg Cylin modifizieren. Dadurch wird die Oberfläche nicht mehr verschmutzt und es werden keine Zellen oder Proteine mehr daran binden. Als nächstes werden wir die Elektrochemie verwenden, um spezifisch Peg-Cylin von den beiden Elektroden zu absorbieren, die wir zuvor hergestellt haben.

Und schließlich werden wir Fibroblasten auf der Oberfläche inkubieren und sie werden selektiv nur an die Streifenregionen binden. Jetzt sind wir also bereit, unser Experiment zu beginnen. Der erste Schritt ist die Fotolithographie, die in einem Reinraum durchgeführt wird.

Also los geht's in den Reinraum. Jetzt sind wir also hier, in unserem Reinraum. Bevor wir mit unserem Experiment beginnen, lassen wir unsere mit Indiumzinnoxid oder ITO beschichteten Proben bei 200 °C in unserem Ofen einbrennen.

Auf diese Weise können wir alle unsere Oberflächen dehydrieren. Und nachdem wir es bei 200 °C gebacken haben, legen wir es auf unsere Spin-Tech und tragen den Fotolack auf. Nachdem wir also unser ITO-Substrat dehydriert haben, nehmen wir es und legen es auf das Futter des Spin-Techs.

Dieses Spannfutter ist gerade groß genug, um ein Viertel einer Glasleuchte aufzunehmen. Dann werden wir Vakuum anwenden. Danach tragen wir einen positiven Ton und Fotolack auf das Substrat auf.

Nach dem Auftragen des Fotolacks legen wir einfach los und fangen an. Dies umfasst zwei Schritte. Der erste ist das Streichen und der zweite ist die Schleuderbeschichtung im Spreizschritt.

Das Chuck dreht sich mit 800 U/min und verteilt den Fotolack gleichmäßig auf der gesamten Oberfläche. Der nächste ist jedoch der Spin-Schritt, der bei 4.000 U/min liegt und bei 4.000 U/min eine wirklich dünne Schicht bildet. Mit dünn meine ich etwa ein Mikrometer.

Wenn man das Wort Foto, Widerstand aufbricht, wird es zu Foto und Widerstand. Es wird durch Licht aktiviert. Daher arbeiten wir im Reinraum und verwenden gefiltertes Licht, damit unser Fototürlack nicht durch das Licht aktiviert wird und resistent gegen Vermögenswerte ist, die wir später beim Ätzen verwenden werden.

Jetzt sind wir also fertig mit der Schleuderbeschichtung, dem Fotolack auf der Oberfläche, und wir nehmen ihn einfach heraus und gehen zu unserem nächsten Schritt über. Nachdem wir die Probe eine Minute und 45 Sekunden lang gebacken haben, nehmen wir sie von der heißen Platte und legen sie auf unsere Kanonenmaskenauskleidung. Hier nehmen wir eine Maske, die wir brauchen, und dann legen wir die Maske auf unser Substrat, um einen Kontaktdruck zwischen unserem Substrat mit Portresist und der Maske zu haben, wir platzieren sie mit einer vier Zoll großen Glasscheibe, nur um ihr Gewicht zu verleihen.

Und wenn wir damit fertig sind, setzen wir einfach den Verschluss wieder auf und belichten die Probe dann mit UV-Licht. Sobald die Belichtung abgeschlossen ist, schieben wir den Deckel einfach in umgekehrter Reihenfolge weg. Wir nehmen unsere Glaswaffel heraus, wir nehmen unsere Maske heraus, und dann entfernen wir unser Substrat und übernehmen es für die Entwicklung.

Nachdem wir das Beispiel verfügbar gemacht haben, platzieren wir es in einer Entwicklerlösung. Als die Probe UV-Licht ausgesetzt wurde, bildete sich Wasserstoffionen, die sich mit der Base und der Entwicklerlösung neutralisierten und tatsächlich von der Oberfläche entfernt wurden. Jetzt möchten Sie also sicherstellen, dass Sie bei der Probe ständig dem Substrat ausweichen.

Und wenn Sie das tun, können Sie in etwa der ersten Minute oder anderthalb Minuten sehen, dass die ex-freigelegten Bereiche tatsächlich entwickelt und von der Oberfläche entfernt werden. Aber damit die Entwicklung abgeschlossen werden kann, lassen wir sie etwa fünf Minuten lang in der Entwicklerlösung sitzen. Nachdem die Entwicklung abgeschlossen ist, werden wir es herausnehmen, wir werden es waschen und mit Wasser füllen und dann mit einer Stickstoffpistole trocknen.

Sobald wir unsere Probe getrocknet haben, werden wir sie unter unserem Mikroskop visualisieren. Hier betrachten wir die Probe unter dem Mikroskop. Wir haben es einfach herausgenommen, nachdem wir es fünf Minuten lang entwickelt hatten.

Es gibt zwei Bereiche, die Sie hier sehen können, einen dunkleren Bereich, der von Fotolack bedeckt ist, und den helleren Bereich, in dem der Fotolack entfernt wurde. In Bezug auf die Maske, die wir zuvor verwendet haben, waren die dunkleren Bereiche auf der Maske die dunkleren Regionen, die wir gerade unter dem Mikroskop sehen, während die klaren Regionen, die wir hier sehen, auf der Maske transparent waren. Eines der Designs, das hier gezeigt wird, besteht nur aus Arrays unterschiedlicher Größe, die von 500 bis 50 Mikrometern reichen, während das andere Design aus 1000-Mikrometer-Kreisen besteht, die nur miteinander verbunden sind.

Hier haben wir also ein anderes Design, das nach dem gleichen Verfahren hergestellt wurde. Hier haben wir individuell adressierbare Elektroden. Was ich damit meine, ist, dass verschiedene Regionen von ITO miteinander verbunden sind und unterschiedlich aktiviert werden können.

Zum Beispiel sind hier die zentralen kreisförmigen Bereiche mit einem elektrischen Pad verbunden, während die äußersten rechteckigen Bereiche mit einem anderen elektrischen Pad verbunden sind. Auf diese Weise können wir diese beiden unterschiedlichen Oberflächen zu unterschiedlichen Zeitpunkten stimulieren. Nachdem wir uns unsere Proben angesehen haben, ist der nächste Schritt, zu dem wir übergehen, das Ätzen der Probe.

Alle Regionen, die nicht durch die Fotos geschützt sind, werden in einer ITO-Radierung weggeätzt. Bevor wir das tun, müssen wir sicherstellen, dass wir geeignete Kleidung anziehen, da das ITO-Ätzen Säuren enthält. Und jetzt, nachdem ich meinen Säureschutzkittel angezogen und meinen Gesichtsschutz aufgesetzt habe, werde ich etwas ITO-Ätzung in ein Glasbecherglas gießen.

Die ITO-Ätzung besteht aus 20 % Chlorwasserstoff, 5 % Salpetersäure und der Rest ist DI-Wasser. Und dann bringe ich meine Probe rüber und lege sie in die Radierung. Zu Beginn des Mikroskops sahen wir, dass es einige Regionen gab, die nicht durch Fotoerhebungen geschützt waren.

Die Säuren in der ITO-Ätzung griffen diese Regionen an und bewirkten, dass das ITO aus diesen Bereichen weggeätzt wurde. Wenn sich das ITO langsam von der Oberfläche absetzt, ändert es seine Farbe. Hier können Sie sehen, dass es sich von einer bläulichen Veränderung, die es ursprünglich hatte, zu dieser violetten Veränderung gewandelt hat und es geht nun weiter zur gelben Börse.

Die Farbänderung deutet darauf hin, dass das ITO weggeätzt wird. Jetzt sind wir also bei 15 Minuten. Das ganze ITO ist komplett weggeätzt.

Und was Sie gerade sehen, sind Fotos, die in ITO-Regionen geschützt sind. Nachdem das Ätzen abgeschlossen ist, verbleiben also noch einige Säuren auf der Oberfläche. Um diese Säure zu entfernen, geben wir sie in eine Natriumcarbonatlösung, die die gesamte Säure neutralisiert.

Nachdem wir die Säuren neutralisiert haben, nehmen wir es heraus und reinigen es mit DI-Wasser und trocknen es dann mit dem Stickstoff. Jetzt sind wir also fertig mit dem Säureätzen. Kein LSD mehr, ich bin aus meinem heißen Kleid raus.

Wir werden es herausnehmen, übertragen und unter unserem Mikroskop visualisieren. Jetzt betrachten wir die Probe unter dem Mikroskop. Dies geschah, nachdem wir die ITO-Ätzung durchgeführt hatten.

In diesem Fall handelt es sich bei den dunkleren Bereichen um Glasbereiche, aus denen ITO weggeätzt wurde. Und die helleren Bereiche sind ITO, die in diesem Fall durch Fotolack geschützt sind. Auch hier handelt es sich um die Arrays von 500 bis 50 Mikrometern, und im anderen Fall haben wir unsere miteinander verbundenen Kreise von jeweils tausend Mikrometern.

Wir haben also einfach unter das Mikroskop geschaut und gesehen, dass es Glasbereiche und ITO-Regionen gab, aber die ITO-Bereiche waren durch Fotolack geschützt. Jetzt müssen wir diesen Fotolack herausnehmen. Alles, was wir tun werden, ist, unser Substrat zu nehmen, es in Aceton zu geben, es dann in das Beschallungsmittel zu legen und einfach 10 Minuten lang zu beschallen.

Dies stellt sicher, dass der gesamte entfernte Fotowiderstand als Töne für sich genommen verwendet werden kann, jedoch durch Schallschlag, der Schallwellen zum Auftreffen verwendet und sicherstellt, dass der Fotolack korrekt entfernt wird. Nachdem man es aus der Schallluft genommen hat, wird es in DI-Wasser gewaschen, wieder in Stickstoff getrocknet und jetzt kann man die Muster auf dem Glassubstrat deutlich sehen. Dies waren die Muster, die zunächst durch den Fotolack geschützt wurden.

Nachdem wir uns nun unsere Proben angesehen und unsere ITO-Muster gefunden oder hergestellt haben, beginnen wir mit der zweiten Phase des Experiments. In dieser Phase wird die Oberfläche mit einer selbstorganisierten Monoschicht aus PEG-Cyclin modifiziert. Aber bevor wir das tun, müssen wir sicherstellen, dass die Oberfläche reaktiv ist.

Dazu legen wir es in einen Plasmareiniger. Dadurch werden Hydroxylgruppen auf der Oberfläche eingebracht und sie somit reaktiv. Dazu geben wir einfach unsere Probe in den Plasmareiniger und schalten dann unsere Vakuumpumpe ein.

Wir schalten den Sauerstoff ein, wir schalten die Hauptenergie ein. Diese Kraft wird genutzt, um das Sauerstoffgas in Plasma umzuwandeln, das dann eingebracht wird und so die Hydroxylrillen bildet. Und sobald wir das Gerät eingeschaltet haben, drücken wir auf Start.

Nachdem der Prozess abgeschlossen ist, nehmen wir unser Substrat heraus, lagern es in einer Schale und gehen weiter nach draußen in den Reinraum und gehen zum nächsten Schritt über. Jetzt, da wir den Reinraum verlassen haben und unsere ideale Musterung abgeschlossen haben, werden wir die Oberfläche, die wir gerade mit Polyethylenglykol, CYLIN oder PEG Cylin strukturiert haben, modifizieren. Es ist wichtig zu wissen, dass Peg Cylin auf Feuchtigkeit reagiert.

Daher muss alles, was wir Holz verwenden, feuchtigkeitsfrei sein. Die Gläser, die wir hier verwendet haben, die Tierschalen, sie wurden über Nacht bei hundert Grad Celsius gebacken. Und der Bottich, den wir als Lösungsmittel verwenden werden, ist auch wasserfrei.

Es enthält keine Feuchtigkeit. Jetzt gieße ich Kann, wasserfreies Tolu, in diese beiden Glaslautsprecher, von denen einer unsere Probe enthält. Jetzt müssen wir zwei Petrischalen verwenden, weil eine davon der Ort ist, an dem wir die Modifikation vornehmen werden.

Und das andere werden wir später verwenden, wenn die Modifikation abgeschlossen ist, um unser Substrat tatsächlich damit zu waschen. Nachdem ich also unsere Pizzaformen aus Glas hineingelegt habe, werde ich sie einfach übernehmen und in unsere Luftschleusenkammer hier im Handschuhfach übertragen. Nach dem Schließen der Schleusenkammer werden wir Stickstoff in die Kammer einführen.

Nun ist die Hauptkammer hier bereits mit Stickstoff gefüllt. Daher wollen wir diese Kammer nur öffnen, wenn sie mit Stickstoff gefüllt ist. Sobald beide Kammern mit Stickstoff gefüllt sind, werden wir alle unsere Proben zusammen mit einer Pipette übertragen.

Wir werden unseren Stift und eine Pinzette haben, die wir später verwenden werden, um die Proben zu übertragen. Wir ziehen also unsere Handschuhe an, öffnen die Kammer hier und nehmen langsam und vorsichtig alles, was wir in unserer Luftschleuse haben, heraus und legen es in die Hauptkammer. Das ist die Petrischale mit unserem Substrat und die Petrischale nur mit Toluol, die wir zum Waschen verwenden werden.

Der vorhandene pxi wurde unter Stickstoff verpackt und Sie sollten diese Flasche nicht öffnen, es sei denn, Sie befinden sich in einer stickstoffhaltigen Umgebung. Wenn Sie also die Probe einmal herausnehmen möchten, legen Sie sie wieder in den Beutel. Sie nehmen also Ihr Cylin heraus und die Konzentration, die wir verwenden werden, beträgt 2% in Toluol.

Also nimmst du es heraus, legst es in die Höhe, wir mischen es. Gut auch kammern und sicherstellen, dass es gut vermischt ist, und lassen Sie die Probe dann zwei Stunden lang in Toin inkubieren. Jetzt, da zwei Stunden vergangen sind und unsere Probe in PXI war, werden wir die Probe herausnehmen und in eine frische Toin-Lösung überführen, wo wir sie kurz waschen, umdrehen und in unsere Luftschleusenkammer bringen.

Sobald es in unserer Schleusenkammer ist, öffnen wir einfach unsere Kammer und nehmen unsere modifizierte Oberfläche heraus, und wir können mit der Stickstoffkanone fahren. Wir legen es wieder in eine saubere, trockene Petrischale und legen es für weitere zwei Stunden bei hundert Grad Celsius in einen Ofen. Jetzt, da die Proben zwei Stunden lang bei hundert Grad Celsius im Ofen gebacken wurden, werden wir unsere Drähte nehmen und an die Elektroden anbringen, die wir vorbereitet haben.

Dazu stellen wir eine Eins-zu-Eins-Mischung aus Silber-Epoxidharz und einem Härtungsmittel her. Das ist also das Silber-Epoxidharz, und jetzt fügen wir die gleiche Menge Aushärtung hinzu. Wir wollen es gut mischen, und dann nehmen wir es und verwenden es, um unsere Drähte zu befestigen.

Also legen wir unseren Draht auf die Elektroden, die wir verwenden wollen, und dann codieren wir ihn. Löten funktioniert nicht mit ITO, daher müssen wir Silberepoxidharz und das Härtungsmittel verwenden. Und dann backen wir so, dass das gesamte Härter, das wir früher verwendet haben, entfernt wird und aushärtet und wir es als Elektrode verwenden können.

Jetzt, da wir zwei Phasen abgeschlossen haben, beginnen wir mit der dritten Phase eines Experiments, in der der elektrochemische Teil durchgeführt wird. Dazu nehmen wir eine Probe und legen sie in unsere elektrochemische Zelle. Nachdem wir es in unsere elektrochemische Zelle gelegt haben, platzieren wir einfach einen O-Ring darauf.

Dadurch wird der Bereich isoliert, in dem die Elektrochemie stattfinden wird, und dann werden wir die Zelle einfach versiegeln. Also habe ich meine Probe mit meinem Draht in der elektrochemischen Zelle platziert. Jetzt bin ich bereit, den Potentialwert zu verwenden, um die Spannung anzulegen.

Den weißen Draht befestige ich hier an der Referenzelektrode, den roten, die Gegenelektrode und schließlich den grünen, den ich an unserer Arbeitselektrode anbringe. Sobald alle diese Elektroden angebracht sind, füge ich nur noch eine x Lösung von Phosphatphosphatpuffer Kochsalzlösung oder PBS zur Elektrochemikalie selbst hinzu. Um dies zu verdeutlichen, die Art und Weise, wie es funktionieren wird, ist die gesamte Oberfläche, die ab sofort mit PXI modifiziert wird.

Also werden alle Elektroden, einschließlich der umgebenden Glasbereiche, mit PXI modifiziert. Sobald ich die Spannung überall dort anwende, wo ITO vorhanden ist, was die Elektrodendesigns sind, die wir gemacht haben, wird sich die Stiftinsel nur von dieser Oberfläche lösen und in den umliegenden Regionen wird nichts mehr beeinflusst. Daher entfernen wir selektiv die Stiftinsel von unserem Substrat.

Jetzt drücke ich auf Play, und das startet und legt eine Spannung von minus 1,4 Volt an unsere Arbeitselektrode an. Wenn die Spannung angelegt wird, kommt es zu einer Farbveränderung, die Sie an den Elektroden sehen können. Es wechselt von dem transparenten grünlich-blauen Ting, das wir bräunen mussten, zu bräunen.

Wir vermuten, dass an den Elektroden eine Oxidationsreaktion abläuft, die dazu führt, dass sie braun werden. Dies ist auch einer der Indikatoren dafür, dass der pxi tatsächlich von der Oberfläche entfernt wurde. Und noch einmal: Wo immer man Braun sieht, wurde die Peg Island entfernt.

Und auf den umgebenden Glasbereichen ist immer noch PXI bestückt. Wir legen also 60 Sekunden lang eine Spannung von minus 1,4 Watt an. Dies gibt genügend Zeit, um alle pxi zu entfernen, die auf den Elektroden vorhanden waren.

Wir können diese Methode auch verwenden, um Elektroden abzuisolieren, die individuell adressiert sind. In diesem Fall gab es drei Reihen von Kreisen, die entfernt werden sollen. Wir können auswählen, was, welche wir abisolieren möchten, indem wir alle drei verschiedenen Elektroden verwenden.

Jetzt haben wir also unseren dritten Teil der Elektrochemie erfolgreich abgeschlossen, in dem wir die PG-Silierung selektiv von unseren ITO-Elektroden entfernt haben. Ich waschte es kurz, wusch es kurz mit PBS- und DI-Wasser, entfernte den Draht und legte die Proben in normale Sechs-Well-Platten. Jetzt gehen wir weiter und kultivieren Zellen auf diesen Elektroden.

Jetzt sind wir also hier im Gewebekulturraum. Für die letzte Phase des Experiments werden wir heute Fibroblasten verwenden, drei T-Zellen. Die Konzentration, die wir zum Aussäen der Zellen verwenden, liegt zwischen 0,5 und 1,5 Millionen Zellen pro Mil.

Nachdem wir die Zellen ausgesät haben, lassen wir die Zellen etwa 20 Minuten lang auf unsere Probe. Das würde ihm genügend Zeit geben, ihn an den abgestreiften Bereichen anzubringen. Also legen wir es in den Inkubator.

Jetzt sind also 20 Minuten vergangen und wir sind bereit, uns die Zellen anzusehen, die sich an den abgestreiften Regionen von ITO orientiert haben, den braunen Regionen, die wir zuvor gesehen haben, und sie würden nur spezifisch an diese Regionen binden und sich nirgendwo außerhalb dieser Regionen anheften. Hier sehen Sie, dass es sich bei den braunen Bereichen um ITO-Regionen handelte, die von PXI befreit wurden. Durch den Einsatz der Elektrochemie haben sich die Zellen nur an diese braunen Bereiche und nicht an die umgebenden Glasbereiche angeheftet.

In diesem anderen Bild sehen wir wieder, dass Seltz an den abgestreiften Bereichen haftet. Das sind die braunen Bereiche, aber über diesen braunen Bereichen kann man kaum sehen und ITO Design PEG wurde nicht von diesem ITO-Design entfernt, daher sind keine Zellen daran befestigt. Okay, das war's.

Wir sind mit dem Protokoll fertig und die Zellen haben ein Muster auf den ITO-Elektroden und das ist genau das, was wir wollten. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Zelladhäsion auf mikrofabrizierten, optisch transparenten Indium-10-Oxid-Elektroden kontrollieren können. Heute habe ich euch gezeigt, wie man THREET drei Fibroblasten auf diesen Elektroden modelliert.

Wir haben das gleiche Verfahren auch verwendet, um Hep G zwei Zellen, Satellitenzellen und Ratten-Primärzellen zu strukturieren. Derzeitige Techniken zur Zellstrukturierung erlauben nur den Zusammenbau von zwei Zelltypen auf der Oberfläche. Die Flexibilität dieser Technik wird es in Zukunft ermöglichen, mehrere Zelltypen auf der Oberfläche zu assemblieren, die räumlich isoliert sind.

Wir planen, diese Technik zu nutzen, um drei verschiedene Leberzelltypen räumlich auf dem ITO-Substrat zu isolieren, um die in vivo Mikroumgebung nachzuahmen. Auf diese Weise können wir unreife Zellen oder Stammzellen zusammen mit reifen Zellen und Stützzellen räumlich isolieren. Dies schafft eine lehrreiche Umgebung, in der die unreifen Zellen wachsen und sich differenzieren können.