Patterning Cells auf optisch transparenten Indium-Zinn-Oxid-Elektroden

Hallo, ich bin Isha. Ich bin Doktorandin im zweiten Jahr in Dr. Zen's Labor. Wir befinden uns hier an der Abteilung für Biomedizinische Technik der University of California Davis.

Heute werde ich Ihnen die Steuerung von Ian auf mikrofabrizierten, optisch transparenten Indium-10-Oxid-Elektroden zeigen. Bei Bemühungen zur Gewebezüchtung und Regeneration wurde versucht, das Mikroumfeld des Organs nachzuahmen. Um dieses Mikroumfeld in vitro zu erzeugen, ist es entscheidend, Zellen räumlich und zeitlich auf einem Substrat zu isolieren. Wir interessieren uns für die Entwicklung von Oberflächen, auf denen wir die Position verschiedener Leberzelltypen kontrollieren können.

In dem heutigen Experiment verwenden wir Oberflächenmodifikation, Mikrofertigung und Elektrochemie, um eine Oberfläche herzustellen, die von zellulär nichtadhäsiv zu zellulär adhäsiv geschaltet werden kann. Der erste Schritt ist die Photolithographie. Hier ist ein Flussdiagramm, das zeigt, wie dieser Prozess ablaufen wird.

Das Blaue ist das Glaslicht, das Grün ist Indium-10-Oxid, das auf dem Glaslicht aufgebracht ist. Zunächst tragen wir hier auf das mit Indium-10-Oxid beschichtete Glaslicht einen rot dargestellten Fotolack mittels Schleuderbeschichtung auf. Danach werden wir dieses Material durch eine Fotomaske hindurch UV-Licht aussetzen, wobei die belichteten Bereiche in einer Entwicklerlösung entwickelt werden.

Die ITO-Bereiche, die nicht durch Fotolack geschützt sind, werden im ITO-Ätzverfahren entfernt. Anschließend wird der gesamte verbleibende Fotolack in Aceton entfernt, um unsere ITO-Elektroden zu bilden. Hier ist das Flussdiagramm der verbleibenden drei Schritte.

Zunächst werden wir die gesamte Oberfläche mit Peg-Cylin modifizieren. Dadurch wird die Oberfläche nicht anhaftend, sodass keine Zellen oder Proteine daran binden können. Anschließend werden wir mittels Elektrochemie gezielt Peg-Cylin von den beiden Elektroden entfernen, die wir zuvor hergestellt haben.

Und schließlich werden wir Fibroblasten auf der Oberfläche inkubieren, wobei sie gezielt nur an die Streifenbereiche binden. Nun sind wir bereit, unser Experiment zu beginnen. Der erste Schritt umfasst die Photolithographie, die in einem Reinraum durchgeführt wird.

Gehen wir nun also weiter in den Reinraum. Wir befinden uns nun in unserem Reinraum. Bevor wir mit unserem Experiment beginnen, werden unsere mit Indium-Zinn-Oxid oder ITO beschichteten Proben bei 200 °C in unserem Ofen getrocknet.

Auf diese Weise können wir alle unsere Oberflächen trocknen. Und nach dem Anbacken bei 200 °C bringen wir sie auf unsere Spin-Beschichtungsanlage und tragen tatsächlich den Fotolack auf. Nachdem wir unser ITO-Substrat getrocknet haben, nehmen wir es und platzieren es auf dem Spannfutter der Spin-Beschichtungsanlage.

Diese Spannfutter ist gerade groß genug, um ein Viertel eines Glaslichts zu halten. Danach werden wir Vakuum anlegen. Anschließend tragen wir einen positiven Photoresist auf das Substrat auf.

Nach dem Auftragen des Fotolacks beginnen wir unmittelbar. Dies umfasst zwei Schritte: Zunächst das Verteilen und anschließend das Spin-Beschichten im Schritt des Verteilens.

Die Spindel dreht sich mit 800 U/min und verteilt damit gleichmäßig den Fotolack auf der gesamten Oberfläche. Der nächste Schritt ist jedoch der Schleuderschritt, der bei 4.000 U/min erfolgt; bei dieser Drehzahl bildet sich eine sehr dünne Schicht. Mit dünn meine ich etwa einen Mikrometer.

Wenn man das Wort „Photoresist“ zerlegt, ergibt sich „Photo“ und „Resist“. Es wird durch Licht aktiviert. Daher arbeiten wir im Reinraum und verwenden gefiltertes Licht, damit unser Photoresist nicht durch Licht aktiviert wird. Außerdem ist er resistent gegenüber Ätzmitteln, eine Eigenschaft, die wir später beim Ätzen nutzen werden.

Jetzt sind wir mit dem Spin-Coating des Fotolacks auf der Oberfläche fertig und werden ihn einfach herausnehmen und mit dem nächsten Schritt fortfahren. Nachdem die Probe eine Minute und 45 Sekunden lang gebacken wurde, nehmen wir sie vom Heiztisch und bringen sie zu unserem Cannon-Maskenliner. Hier nehmen wir die benötigte Maske und legen sie auf unser Substrat, um einen Kontaktabdruck zwischen unserem Substrat mit Fotolack und der Maske zu erzielen. Dazu legen wir eine vier Zoll große Glasscheibe darauf, um zusätzliches Gewicht hinzuzufügen.

Und sobald wir damit fertig sind, setzen wir den Verschluss einfach wieder auf und belichten die Probe mit UV-Licht. Sobald die Belichtung abgeschlossen ist, entfernen wir den Deckel in umgekehrter Reihenfolge. Wir nehmen unsere Glasscheibe heraus, entfernen unsere Maske und nehmen dann unser Substrat heraus, um es zur Entwicklung weiterzugeben.

Nach der Belichtung des Probenstücks wird es in eine Entwicklerlösung gegeben. Bei Bestrahlung mit UV-Licht bilden sich Wasserstoffionen, die mit der Base in der Entwicklerlösung neutralisiert werden und tatsächlich von der Oberfläche entfernt werden. Daher ist es wichtig, dass Sie beim Bearbeiten der Probe das Substrat kontinuierlich bewegen.

Und wenn Sie dies tun, können Sie sehen, dass innerhalb der ersten Minute oder einer Minute und einer halben Minute die belichteten Bereiche tatsächlich entwickelt und von der Oberfläche entfernt werden. Für eine vollständige Entwicklung lassen wir es jedoch etwa fünf Minuten im Entwicklerbad. Nach Abschluss der Entwicklung nehmen wir es heraus, spülen es mit destilliertem Wasser ab und trocknen es mit einer Stickstoffpistole.

Nachdem wir unsere Probe getrocknet haben, bringen wir sie zur Visualisierung unter das Mikroskop. Hier betrachten wir die Probe unter dem Mikroskop. Wir haben sie gerade nach einer Entwicklungszeit von fünf Minuten herausgenommen.

Es gibt zwei Bereiche, die Sie hier sehen können: einen dunkleren Bereich, der mit Fotolack bedeckt ist, und einen helleren Bereich, wo der Fotolack entfernt wurde. Bezogen auf die Maske, die wir zuvor verwendet haben, entsprechen die dunklen Bereiche auf der Maske den dunklen Bereichen, die wir jetzt unter dem Mikroskop sehen, während die klaren Bereiche hier auf der Maske transparent waren. Eines der hier gezeigten Designs besteht aus Arrays verschiedener Größen, die von 500 auf 50 Mikrometer abnehmen, während das andere Design aus 1000-Mikrometer-Kreisen besteht, die einfach miteinander verbunden sind.

Hier haben wir ein anderes Design, das mit dem gleichen Verfahren hergestellt wurde. Hier liegen individuell ansteuerbare Elektroden vor. Damit meine ich, dass verschiedene Bereiche des ITO miteinander verbunden sind und unterschiedlich aktiviert werden können.

Beispielsweise sind hier die zentralen kreisförmigen Bereiche mit einem elektrischen Anschluss verbunden, während die äußersten rechteckigen Bereiche mit einem anderen elektrischen Anschluss verbunden sind. Auf diese Weise können wir diese beiden unterschiedlichen Oberflächen zu verschiedenen Zeitpunkten stimulieren. Nach der Betrachtung unserer Proben ist der nächste Schritt, dass wir die Probe ätzen.

Die Bereiche, die nicht durch die Fotolackmaske geschützt sind, werden bei der ITO-Ätzung abgetragen. Vorher müssen wir sicherstellen, dass wir geeignete Schutzkleidung tragen, da die ITO-Ätzlösung Säuren enthält. Nachdem ich nun meinen säurebeständigen Schutzanzug angelegt und meinen Gesichtsschutz angebracht habe, werde ich etwas ITO-Ätzmittel in einen Glasbecher füllen.

Das ITO-Ätzen besteht aus 20 % Salzsäure, 5 % Salpetersäure und dem Rest destilliertem Wasser. Dann bringen Sie die Probe herüber und legen sie in die Ätzlösung. Zuvor hatten wir unter dem Mikroskop gesehen, dass einige Bereiche nicht durch Fotolack geschützt waren.

Die Säuren beim ITO-Ätzen griffen diese Bereiche an und führten dazu, dass das ITO aus diesen Regionen weggeätzt wurde. Während das ITO langsam von der Oberfläche abgebaut wird, verändert es seine Farbe. Hier sehen Sie, dass es sich von einem ursprünglich bläulichen Schimmer zu einem violettlichen Schimmer verfärbt hat und sich nun weiter in Richtung eines gelblichen Schimmers verändert.

Die Farbänderung zeigt an, dass das ITO abgetragen wird. Hier sind wir nun bei 15 Minuten. Das gesamte ITO ist vollständig abgetragen.

Und was Sie gerade sehen, sind Fotos geschützter ITO-Bereiche. Nachdem das Ätzen abgeschlossen ist, verbleiben noch einige Säuren auf der Oberfläche. Um diese Säuren zu entfernen, werden wir das Objekt in eine Natriumcarbonat-Lösung geben, die alle Säuren neutralisieren wird.

Nachdem wir die Säuren neutralisiert haben, nehmen wir das Objekt heraus, reinigen es mit entionisiertem Wasser und trocknen es anschließend mit Stickstoff. Damit ist die Säureätzung abgeschlossen. Keine Säuren mehr, ich ziehe meinen Schutzanzug aus.

Wir nehmen es heraus, übertragen es und betrachten es unter dem Mikroskop. Nun beobachten wir die Probe unter dem Mikroskop. Dies ist nach der Durchführung der ITO-Ätzung.

In diesem Fall handelt es sich bei den dunkleren Bereichen um Glasbereiche, von denen ITO weggeätzt wurde. Die helleren Bereiche sind ITO, das in diesem Fall durch Fotolack geschützt ist. Erneut handelt es sich hierbei um Arrays von 500 bis 50 Mikrometern, und im anderen Fall haben wir unsere miteinander verbundenen Kreise mit jeweils tausend Mikrometern.

Wir haben also gerade unter dem Mikroskop geschaut und festgestellt, dass es Glasbereiche und ITO-Bereiche gab, wobei die ITO-Bereiche jedoch durch Fotolack geschützt waren. Nun müssen wir diesen Fotolack entfernen. Dazu nehmen wir unser Substrat, geben es in Aceton und stellen es dann in den Ultraschallbad, wo es einfach 10 Minuten lang ultraschallbehandelt wird.

Dadurch wird sichergestellt, dass der gesamte Fotolack entfernt wird. Man könnte die Strukturen auch allein als Töne nutzen, doch durch das Beschallen, bei dem Schallwellen eingesetzt werden, um den Fotolack abzulösen, wird gewährleistet, dass der Fotolack korrekt entfernt wird. Nach dem Entnehmen aus dem Ultraschallbad wird die Probe in entionisiertem Wasser gespült und erneut mit Stickstoff getrocknet. Nun sind die Muster deutlich auf dem Glas-Substrat sichtbar. Dies sind die Muster, die ursprünglich durch den Fotolack geschützt waren.

Nun, da wir unsere Proben untersucht und unsere ITO-Muster gefunden oder hergestellt haben, beginnen wir die zweite Phase des Experiments. Bei dieser Phase erfolgt die Modifizierung der Oberfläche mit einer selbstorganisierten Monoschicht aus PEG Cyclin. Doch zuvor müssen wir sicherstellen, dass die Oberfläche reaktiv ist.

Dazu geben wir es in einen Plasma-Reiniger. Dies führt Hydroxylgruppen auf der Oberfläche ein und macht sie dadurch reaktiv. Dazu platzieren wir einfach unsere Probe in den Plasma-Reiniger und schalten dann unsere Vakuumpumpe ein.

Wir schalten den Sauerstoff ein, anschließend die Hauptstromversorgung. Diese Energie dient dazu, das Sauerstoffgas in Plasma umzuwandeln, das dann eingeleitet wird und so die Hydroxyl-Rillen bildet. Sobald die Stromversorgung eingeschaltet ist, starten wir den Vorgang.

Jetzt, nachdem der Prozess abgeschlossen ist, nehmen wir unser Substrat heraus, lagern es in einer Schale und verlassen den Reinraum, ziehen die Schutzkleidung aus und fahren mit dem nächsten Schritt fort. Da wir nun den Reinraum verlassen haben und unsere ideale Strukturierung abgeschlossen ist, werden wir die Oberfläche, die wir gerade mit Polyethylenglykol, CYLIN oder PEG-Cylin strukturiert haben, modifizieren. Es ist entscheidend zu wissen, dass PEG-Cylin feuchtigkeitsempfindlich ist.

Daher muss alles, was wir aus Holz verwenden, feuchtigkeitsfrei sein. Das hier verwendete Glasgeschirr, die Petrischalen, wurde über Nacht bei 100 °C ausgebacken. Und das Lösungsmittel, das wir verwenden werden, ist ebenfalls wasserfrei.

Es enthält keine Feuchtigkeit. Nun werde ich trockenes, wasserfreies Toluol in beide Glasgefäße geben, von denen eines unsere Probe enthält. Wir müssen zwei Petrischalen verwenden, da in einer von ihnen die Modifizierung durchgeführt wird.

Und die andere werden wir später verwenden, nachdem die Modifikation abgeschlossen ist, um unser Substrat tatsächlich damit zu waschen. Nachdem wir unsere Glaspetrischalen eingestellt haben, nehme ich sie nun und übertrage sie in unsere Schleusenkammer hier im Handschuhkasten. Nach dem Schließen der Schleusenkammer werden wir Stickstoff in die Kammer einleiten.

Der Hauptkammer hier ist bereits mit Stickstoff gefüllt. Daher sollten wir diese Kammer nicht öffnen, es sei denn, sie ist mit Stickstoff gefüllt. Sobald beide Kammern mit Stickstoff gefüllt sind, werden wir alle unsere Proben zusammen mit einer Pipette überführen.

Wir haben unseren Stift und eine Pinzette, die wir später zum Übertragen der Proben verwenden werden. Zuerst ziehen wir unsere Handschuhe an, öffnen hier die Kammer und nehmen langsam und vorsichtig alles aus unserem Luftschleusenraum heraus, um es in die Hauptkammer zu legen. Dies ist die Petrischale mit unserem Substrat und die Petrischale, die lediglich Toluol enthält und die wir zum Waschen verwenden werden.

Das vorhandene pxi wurde unter Stickstoff verpackt, und Sie sollten diese Flasche nicht öffnen, es sei denn, Sie befinden sich in einer Stickstoffatmosphäre. Sobald Sie daher die Probe entnehmen möchten, legen Sie sie zurück in die Tüte. Sie entnehmen also Ihren Cylin, und die Konzentration, die wir verwenden werden, beträgt 2 % in Toluol.

Also nehmen Sie es heraus, geben es in das hohe Gefäß hinein und mischen es. Auch die Kammer wird gründlich gemischt, um sicherzustellen, dass die Mischung homogen ist, und anschließend lässt man die Probe zwei Stunden lang in Toin inkubieren. Da nun zwei Stunden vergangen sind und unsere Probe in Pxi war, nehmen wir die Probe heraus und überführen sie in eine frische Toin-Lösung, in der wir sie kurz waschen, darin schwenken und danach in unsere Airlock-Kammer überführen.

Sobald es sich in unserer Luftschleuse befindet, öffnen wir einfach die Kammer und nehmen unsere modifizierte Oberfläche heraus, wobei wir mit der Stickstoffpistole arbeiten können. Wir legen sie erneut in eine saubere, trockene Petrischale und stellen sie für zwei weitere Stunden in einen Ofen bei hundert Grad C. Nachdem die Proben nun zwei Stunden lang bei hundert Grad C im Ofen erhitzt wurden, nehmen wir sie heraus und befestigen die Drähte an den zuvor präparierten Elektroden.

Wir stellen eine 1:1-Mischung aus silberhaltigem Epoxidharz und einem Härter her. Dies ist das silberhaltige Epoxidharz, und nun fügen wir die gleiche Menge Härter hinzu. Wir müssen es gut vermischen und verwenden es anschließend, um unsere Drähte anzubringen.

Wir platzieren also unseren Draht auf den Elektroden, die wir verwenden möchten, und verschalten ihn anschließend. Auf ITO funktioniert das Löten nicht, daher müssen wir silberhaltiges Epoxidharz zusammen mit dem Härter verwenden. Danach backen wir das Bauteil, damit der zuvor verwendete Härter vollständig entfernt wird, das Material aushärtet und wir es als Elektrode nutzen können.

Nachdem wir nun zwei Phasen abgeschlossen haben, beginnen wir die dritte Phase eines Experiments, nämlich den elektrochemischen Teil. Dazu entnehmen wir eine Probe und geben sie in unsere elektrochemische Zelle. Nachdem wir die Probe in die elektrochemische Zelle gegeben haben, legen wir einfach einen O-Ring darauf.

Dadurch wird der Bereich isoliert, in dem die Elektrochemie stattfinden soll, und anschließend verschließe ich die Zelle. Ich habe meine Probe mit dem angebrachten Draht bereits in die elektrochemische Zelle eingebracht. Nun bin ich bereit, mit dem Potentiostaten die Spannung anzulegen.

Der weiße Draht wird hier mit der Referenzelektrode verbunden, der rote mit der Gegenelektrode und schließlich der grüne mit unserer Arbeitselektrode. Sobald alle diese Elektroden angeschlossen sind, füge ich eine 1×-Lösung von Phosphat-Puffer-Salzlösung oder PBS zum elektrochemischen System hinzu. Zur Klarstellung: Die gesamte Oberfläche ist derzeit mit pxi modifiziert.

Alle Elektroden, einschließlich der umgebenden Glasbereiche, werden somit mit PXI modifiziert. Sobald ich überall dort eine Spannung anlege, wo ITO vorhanden ist – also bei den Elektrodenstrukturen, die wir hergestellt haben – löst sich die PEG-Insel nur von diesen Oberflächen, während die umgebenden Bereiche unbeeinflusst bleiben. Auf diese Weise entfernen wir selektiv die PEG-Insel von unserem Substrat.

Jetzt drücke ich auf „Play“, wodurch eine Spannung von minus 1,4 Volt an unserer Arbeitselektrode angelegt wird. Sobald die Spannung angelegt ist, können Sie eine Farbänderung an den Elektroden beobachten. Sie wechselt von dem ursprünglichen transparenten grünlich-blauen Ton zu braun.

Wir vermuten, dass eine Oxidationsreaktion an den Elektroden ablaufen könnte, wodurch diese braun werden. Dies ist ebenfalls ein Hinweis darauf, dass das pxi tatsächlich von der Oberfläche abgetragen wurde. Und erneut zeigt sich dort, wo Braun zu sehen ist, dass die Peg-Insel entfernt wurde.

Und die umgebenden Glasbereiche weisen weiterhin montiertes PXI auf. Daher wenden wir eine Spannung von minus 1,4 Watt für 60 Sekunden an. Dies bietet ausreichend Zeit, um sämtliches PXI, das auf den Elektroden vorhanden war, zu entfernen.

Wir können diese Methode auch verwenden, um Elektroden abzuziehen, die einzeln angesprochen werden. In diesem Fall gab es drei Reihen von Kreisen, die abgezogen werden sollen. Wir können auswählen, welche wir abziehen möchten, indem wir alle drei verschiedenen Elektroden verwenden.

Jetzt haben wir erfolgreich den dritten Teil der Elektrochemie abgeschlossen, bei dem wir PG-Siling selektiv von unseren ITO-Elektroden entfernt haben. Ich habe sie kurz mit PBS und entsalztem Wasser gewaschen, den Draht entfernt und die Proben in gewöhnliche Sechs-Well-Platten gegeben. Als Nächstes werden wir Zellen auf diesen Elektroden kultivieren.

Jetzt befinden wir uns hier im Zellkulturlabor. Für die abschließende Phase des Experiments werden wir heute Fibroblasten verwenden, die sogenannten drei T drei-Zellen. Die Konzentration, mit der wir die Zellen ansäen, liegt zwischen 0,5 und 1,5 Millionen Zellen pro Mil.

Nach dem Aussäen der Zellen lassen wir diese etwa 20 Minuten lang auf unserer Probe, damit sie ausreichend Zeit haben, sich an den entblößten Regionen anzulagern. Anschließend stellen wir sie in den Inkubator.

Nun sind bereits 20 Minuten vergangen, und wir können uns die Zellen ansehen, die sich auf den freigelegten Bereichen von ITO, den zuvor sichtbaren braunen Regionen, angeordnet haben. Diese binden spezifisch ausschließlich an diese Bereiche und heften sich nicht außerhalb davon an. Hier sehen Sie die braunen Regionen, bei denen es sich um ITO-Bereiche handelt, von denen pxi entfernt wurde. Mithilfe der Elektrochemie haben sich die Zellen lediglich an diesen braunen Regionen und nicht an den umgebenden Glasbereichen angeheftet.

In diesem anderen Bild sehen wir erneut, wie sich Seltz an die abgetragenen Bereiche anheftet. Das sind die braunen Bereiche, aber oberhalb dieser braunen Bereiche ist kaum etwas zu erkennen, und das ITO-Design mit PEG wurde von diesem ITO-Design nicht abgetragen, weshalb sich keine Zellen daran angeheftet haben. Gut, das war's.

Wir haben das Protokoll abgeschlossen, und die Zellen weisen ein Muster auf den ITO-Elektroden auf, genau wie gewünscht. Ich habe Ihnen soeben die Steuerung der Zelladhäsion auf mikrofabrizierten, optisch transparenten Indiumzinn-Oxid-Elektroden gezeigt. Heute habe ich Ihnen demonstriert, wie man DREI Drei Fibroblasten auf diesen Elektroden anordnet.

Wir haben dasselbe Verfahren auch zur Musterung von Hep-G2-Zellen, Satellitenzellen und primären Rattenzellen verwendet. Aktuelle Techniken zur Zellmusterung erlauben lediglich die Anordnung von zwei Zelltypen auf der Oberfläche. Die Flexibilität dieser Technik wird künftig die Anordnung mehrerer Zelltypen auf der Oberfläche ermöglichen, die räumlich voneinander isoliert sind.

Wir planen, diese Technik zu verwenden, um drei verschiedene Leberzelltypen räumlich auf dem ITO-Substrat zu isolieren, um so die in-vivo-Mikroumgebung nachzuahmen. Dadurch können wir unreife Zellen oder Stammzellen räumlich von reifen Zellen und unterstützenden Zellen trennen. Dies schafft eine anleitende Umgebung, in der unreife Zellen wachsen und sich differenzieren können.