Ein 1,5 Stunden-Verfahren für die Identifizierung von Enterococcus Spezies direkt aus Blutkulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Enterococcus-Arten aus positiven Blutkulturflaschen mithilfe der Peptid-Nukleinsäure-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (PNA-FISH) und der C2-Hybridisierung schnell zu identifizieren. Sobald die Blutkulturen vorbereitet und mittels Gram-Färbung auf das Vorhandensein von Enterokokken geprüft wurden, werden die Proben auf PNA-FISH-Mikroskopobjektträgern fixiert. Anschließend werden die Objektträger mit PNA-Sonden inkubiert, die spezifisch für die interessierenden Organismen sind.

Nachdem die Sonden hybridisiert haben, erfolgt eine stringente Waschung, um überschüssige, nicht hybridisierte Sonde zu entfernen. Es wird Einbettmedium zu den Objektträgern hinzugefügt, die anschließend mit Deckgläsern versiegelt werden. Die im Probenmaterial vorhandenen Enterococcus-Arten können mittels Fluoreszenzmikroskopie identifiziert werden.

Dieses PNA-FISH-Identifizierungsprotokoll ist einzigartig, da es eine schnelle und spezifische Methode zur Identifizierung von Enterococcus aus einer Blutkultur bietet. Inkubieren Sie zwei Blutkulturflaschen, eine aerobe und eine anaerobe, die venöses Blut von einem Patienten enthalten, bei dem ein septischer Zustand vermutet wird, in einem automatisierten Blutkulturgerät bei 35 Grad Celsius. Sobald das Gerät anzeigt, dass mikrobielles Wachstum detektiert wurde, nehmen Sie die Flasche heraus und schwenken Sie die Blutkulturflaschen vorsichtig, um die Bakterien gleichmäßig erneut in Suspension zu bringen.

Überführen Sie dann mit einer sterilen Spritze und Nadel etwa fünf Milliliter Blut aus jeder Flasche aseptisch in ein separates Schraubverschlussröhrchen. Sobald alle Proben verteilt wurden, überführen Sie mit einer sterilen Pipette einen Tropfen Blut aus jedem Röhrchen auf einen separaten Objektträger aus Glas. Lassen Sie den Objektträger etwa 15 Minuten lang an der Luft trocknen.

Danach, nachdem der Objektträger vollständig trocken ist, den Objektträger zur Fixierung der Probe in Methanol eintauchen. Nach der Fixierung der Objektträger diese waschen und eine Standard-Gram-Färbung durchführen, um die Morphologie der in jeder Blutkultur vorhandenen Organismen zu bestimmen. Die gefärbten Objektträger mit einem Mikroskop unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs untersuchen.

Geben Sie eine Caucus-Art an, die als grampositive Kokken erscheint, die typischerweise in Paaren oder kurzen Ketten angeordnet sind. Geben Sie einen Tropfen Fixierungslösung in das Feld eines P- und eines Fisch-Mikroskopobjektträgers. Mischen Sie vorsichtig das Röhrchen mit der zu testenden Blutkultur.

Übertragen Sie anschließend 10 Mikroliter der Kultur auf den Tropfen der Fixierungslösung und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Probe zu emulgieren. Legen Sie die Objektträger für jeweils 20 Minuten auf eine Heizplatte bei 55 Grad Celsius, um die Ausstriche in jedem Test zu fixieren. Stellen Sie sicher, dass positive und negative Kontroll-Objektträger zur Qualitätsbeurteilung des Assays mitgeführt werden.

Falls erforderlich, können Hornhaut-Kontrollpräparate von einem Van DX bezogen oder unter Verwendung von Referenzkulturen hergestellt werden. Sobald der Abstrich bereit ist, geben Sie einen Tropfen EFI-Hornhaut-O-E-P-N-A in das Reservoir mit der Blutkulturprobe sowie in die positiven und negativen Kontrollreservoirs. Um eine Kontamination der Sonden-Stammlösung zu vermeiden, achten Sie darauf, dass die Tropferspitze der Flasche den Blutabstrich nicht berührt.

Legen Sie ein Deckglas auf die Probe, wobei darauf geachtet werden sollte, Luftblasen zu vermeiden. Anschließend inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang auf einem Heizblock bei 55 Grad Celsius. Um die Hybridisierung des PNA nach der Inkubation zu ermöglichen, stellen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter.

Das beladene Objektträgerhalter in eine Färbeschale mit vorgewärmter 55 Grad Celsius warmer Waschlösung eintauchen. Um überschüssiges PNA von der Probe zu entfernen, vorsichtig die Deckglasabdeckung durch Schwenken des Objektträgers im Puffer oder mit einer Pinzette abnehmen. Den Objektträger 30 Minuten bei 55 Grad Celsius in der Waschlösung inkubieren.

Entfernen Sie dann den Objektträger aus der Färbevorrichtung und lassen Sie ihn an der Luft trocknen. Sobald der Objektträger trocken ist, geben Sie einen Tropfen Montagemedium mit Raumtemperatur auf den Objektträger und legen vorsichtig ein Deckglas auf die Probe. Untersuchen Sie die Objektträger innerhalb von zwei Stunden nach der Herstellung mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines Dualbandfilters.

Mithilfe dieser Methode können iffy, callous, die links in Grün dargestellt sind, von eum in Rot unterschieden werden. Im mittleren Feld ganz rechts ist ein negatives Ergebnis zu sehen. Drei Dinge sind zu beachten, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen: Die Instrumententemperaturen müssen bei den eingestellten Temperaturen gehalten werden.

Sie müssen die Färbeprozedur genau befolgen, wie in der Packungsbeilage beschrieben. Und schließlich benötigen Sie einen erfahrenen Auswerter, der eine gründliche Analyse des Objektträgers durchführt. Dieses Protokoll ist nützlich bei der Entscheidungsfindung für die Therapie der Behandlung einer durch Enterococcus verursachten Sepsis.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.