Name: Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Erfahren Sie den Competitive Homing-Assay zur Analyse der Migration von darmtropen T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen in Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung gewebespezifischer Wanderungsfähigkeiten in vivo.

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EJV wird durch ein Stipendium der Crohn s &amp; Colitis Foundation of America (CCFA) unterstützt. JRM wird durch Zuschüsse aus CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) und NIH Director s New Innovator Award unterstützt.

1. Ex-vivo-Generation von gut-Homing und Kontrolle T-Zellen (siehe Abbildung 1) <ol><li> Isolieren Splenozyten von Maischen ein Milz von Wildtyp-Mäusen. Resuspendieren der Zellen Suspension in PBS und zentrifugieren Sie für 5 'bei 400 x g. Entfernen Sie den Überstand und lysieren die roten Blutkörperchen durch Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml ACK-Lysepuffer für 2-3 Minuten. Danach werden 5 ml PBS. Zentrifugieren Sie für 5 'bei 400 xg und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren insgesamt Splenozyten bei 1 x 10 6 / ml in IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-Mercaptoethanol + Penicillin / Streptomycin (komplett IMDM). Trennen Sie die Zellen in zwei Gruppen, von denen einer mit RA (oder synthetischen RAR-Agonisten, wie zB AM80 oder Am580) bis zu einer Endkonzentration von 100-200 nM 3 ergänzt. T-Zellen in Anwesenheit von RA-oder RAR-Agonisten aktiviert wird hochregulieren a4b7and CCR9 und wird gut-tropic T-Zellen werden, während T-Zellen ohne RA aktiviert Kontrolle T-Zellen werden wird. </li><li> Fügen Sie 1,5-2,0 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte zuvor mit anti-CD3 (10 mg / ml) und anti-CD28 (10 mg / ml) beschichtet und bei 37 ° C in 5% CO 2 (für die Beschichtung der Platte 500 ml / well anti-CD3 und anti-CD28 in PBS und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ˚ C und dann zweimal waschen mit 2 ml PBS). </li><li> Um T-Zell-Überstimulation zu vermeiden, nach 2-3 Tagen übertragen die Zellsuspensionen in ein neues unbeschichteten 24-Well-Platte. Inkubieren für weitere 2-3 Tage. Je nach Zelldichte und Proliferation der Medien könnte Säure (gelb), in welchem ​​Fall es nötig sein, die Hälfte der Medien mit frischen komplette IMDM ersetzen werden könnte. Ernte der Zellen nach 4-5 Tagen (gerechnet ab Tag 0). </li><li> Typische Endausbeuten sind 1-2 x 10 6 Effektor-T-Zellen / well. Deshalb sollte ein Minimum von 9-12 Vertiefungen jeder gut-tropic T-Zellen und T-Zellen steuern ausplattiert, um am Ende mit 10-20 x 10 6 T-Zellen pro Zustand sein. </li></ol> 2. Analyse der Darm-Homing-Rezeptoren auf aktivierten T-Zellen Nach 4-5 Tagen der Kultur sollten wir beobachten eine hohe Expression von gut-Homing-Rezeptoren a4b7and CCR9 auf T-Zellen in Anwesenheit von RA-oder RAR-Agonisten aktiviert, während die Control T-Zellen ein sehr niedriges Niveau dieser Rezeptoren 4 Express sollte. Durchflusszytometrie (FACS)-Analyse. <ol><li> Sammeln Sie zwischen 0,2-0,5 x10 6 Zellen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 300 g bei 4 ° C. </li><li> Inkubieren mit anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) und anti-CD8-PerCP für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Nach der Inkubation für 5 min zentrifugieren bei 300 g 4 ° C. Waschen und die Zellen in Färbepuffer und analysieren durch FACS. </li></ol> 3. T-Zell-Markierung mit CFSE und CMTMR Zelle Tracker <ol><li> Bewahren Sie alle Lösungen bei 37 ° C vor dem Start. Wash gut-tropic T-Zellen (a4b7 Hohe CCR9 High) und Kontrolle T-Zellen (a4b7 Low / Neg CCR9 Low / Neg) zweimal mit PBS zur Entfernung des Serums. Passen Sie T-Zell-Konzentration von 10-15 x 10 6 / ml in PBS. </li><li> Add CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidylester) oder CMTMR (chlormethyl-benzoyl-amino-Tetramethylrhodamin) Fluorophore entweder gut-tropic T und Kontrolle T-Zellen zu einer Endkonzentration von 5 mM und 10 mM bzw. vorsichtig vortexen, Inkubation für 20 min bei 37 ° C. Es wird empfohlen, die Markierungen in der gleichen oder in einem separaten Experiment Swap, um mögliche intrinsische Effekte von Fluorophoren auf T-Zell-Migration ausschließen. </li><li> Nach der Inkubation löschen mit 1 Volumen FBS und Inkubation für 1-5 min bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie 10-mal mit warmem PBS und zentrifugieren Sie für 5 min bei 300 g. Zweimal waschen mit PBS resuspendieren und in völliger IMDM. </li><li> Idealerweise sollte 10-20 x 10 6 Zellen jeder T Bevölkerung im Verhältnis 1:1 gemischt und anschließend zentrifugiert bei 300 xg für 5 min. Schließlich die Zellen in 200-250 ml warmem PBS und injizieren über die Schwanzvene. </li><li> Zur Berechnung der exakten Eingabe-Verhältnis (idealerweise nahe 1) zu retten 5-10 mL des injizierten Zellsuspension und mit 300 ml PBS verdünnt und analysiert mittels FACS. </li></ol> 4. Die Analyse der T-Zell-Homing Obwohl Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten (zwischen 1 h und mehreren Tagen post T-Zell-Injektion) analysiert werden kann, ist Homing von gut-tropic T-Zellen am besten zwischen 12-24 h nach der Injektion dokumentiert. Längere Zeit Punkte erhöhen die möglichen Auswirkungen der anderen Variablen, die die endgültige Anzahl der Zellen / Kennzahlen, wie z. B. T-Zell-Apoptose und T-Zell-Ausstieg aus dem Gewebe. Nach den Mäusen eingeschläfert, Zellsuspensionen aus verschiedenen Geweben, unverzüglich isoliert werden, um Zelltod zu verringern, könnten die Auswirkungen auf den endgültigen Erträge und Ergebnisse. Gewebe von Interesse sind, Dünndarm, Dickdarm, Milz, Lymphknoten, Peyer-Plaques, Leber, Lunge und Blut. Wenn dieinjizierten T-Zellen sind bona fide gut-tropic T-Zellen, sollten sie zu Hause im Durchschnitt 5-10 mal besser (oder höher) auf die Dünndarmschleimhaut im Vergleich zu T-Zellen zu steuern. Allerdings sollten auch andere Gewebe wie Blut und der Milz, nicht zeigen eine bevorzugte T-Zell-Migration. Isolierung von Lymphozyten aus der intestinalen Lamina propria und der intraepithelialen Fach wurde bereits 5 beschrieben. <ol><li> FACS-Färbung: Die Proben werden erneut suspendiert in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen gesammelt, bei einer Dichte nicht höher als 3,0 x 10 6 Zellen / ml. Wenn kongene CD45.1 + oder Thy1.1 + Mäusen als Empfänger verwendet wurden, werden die Zellen mit den entsprechenden kongene Marker (zB CD45.2 oder Thy1.2) mit einigen Linie Marker (zB TCRbchain, CD4, CD8 kombiniert gebeizt , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> Während FACS-Analyse werden die Zellen gated auf der kongene Marker (zB CD45.1) und dann auf die spezifischen Linie Marker (z. B. CD4/CD8) und analysiert das Verhältnis zwischen CMTMR und CFSE-positiven Zellen. </li><li> Die Daten werden in der Regel als Homing Index (HALLO), die als das Verhältnis CFSE / CMTMR (oder CMTMR / CFSE) in jedem Gewebe durch die entsprechende Eingabe-Verhältnis (siehe unten) dividiert wird zum Ausdruck gebracht. Wenn die Eingabe-Verhältnis ist sehr nahe bei 1, dann das Gewebe Verhältnisse werden entsprechend der HALLO. </li></ol> HALLO = CFSE Gewebe / CMTMR Gewebe: CFSE Input / CMTMR Eingang Blut sollte auch analysiert, um festzustellen, ob beide T-Zell-Populationen gleichermaßen in den Kreislauf vertreten oder, wenn man T-Zell-Population ist in Bezug auf die anderen (z. B. durch bevorzugte Trapping in der Lunge / Leber oder durch eine verminderte Lebensfähigkeit) verringert werden. Dies könnte geschehen, wenn Vergleich naiv oder Ruhestätten Memory T-Zellen im Vergleich zu den zuletzt aktivierten Effektor-T-Zellen, da diese möglicherweise in einem größeren Ausmaß in die Lunge abgefangen werden. Wenn die HALLO im Blut ist deutlich anders als 1, kann man HALLO normalisieren im Gewebe durch die HALLO im Blut. Das Blut kann via Herzpunktion von Mäusen betäubt (mit Avertin oder Isofluoran vor Euthanasie) bezogen werden und sollten zweimal mit ACK-Puffer lysiert werden, bevor Sie es für FACS-Färbung. Blut Normalisierung = HALLO Gewebe / HALLO Blut 5. Repräsentative Ergebnisse Empfänger-Mäuse (Thy1.1 +) wurden euthanized18h post-Injektion. Zellsuspensionen wurden aus der Milz, periphere Lymphknoten (PLN), mesenterialen Lymphknoten (MLN) und Dünndarm Lamina propia (LP) erzeugt. Danach wurden die Zellen für Thy1.2 und CD8 gefärbt und dann analysiert durch FACS durch Gating auf lebensfähigen Thy1.2 + CD8 +-Zellen, die schließlich für das Verhältnis zwischen CMTMR +-Zellen (gut-tropic T-Zellen) und CFSE wurden analysiert + Zellen (Kontrolle T-Zellen) durch die Eingabe dividiert. Die Ergebnisse können wie in Abbildung 2, in der es versteht sich, dass gut-tropischen und Kontrolle T-Zellen auch für die Milz (HALLO nahe zu 1, gekennzeichnet mit einer roten Linie) homed kann gezeigt werden. Im Gegensatz dazu gut-tropic T-Zellen etwa 10-mal effizienter auf die LP migriert im Vergleich zu T-Zellen zu steuern. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1:. Schematische Darstellung der Erzeugung und Kennzeichnung von gut-tropischen und nicht-gut tropic T-Zellen T-Zellen sind aus Wildtyp-Mäusen isoliert und aktiviert mit anti-CD3/anti-CD28 und in der Gegenwart oder Abwesenheit von 100-200 nm alle - trans-Retinsäure (RA). Nach 4-5 Tagen RA-behandelten T-Zellen erwerben die Expression von gut Homing-Rezeptoren CCR9 und a4b7. Dann werden gut-tropischen und Kontrolle T-Zellen differentiell mit CFSE oder CMTMR gekennzeichnet, gewaschen, gemischt im Verhältnis 1:1 und in eine Empfänger-Maus über die Schwanzvene. Einige markierten Zellen werden verwendet, um die CFSE / CMTMR Eingabe-Verhältnis (sollte nahe bei 1 liegen) zu bestimmen. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2:. Beispiel Homing Analyse Mäuse analysiert 12-18 h post T-Zell-Injektion und Einzelzell-Suspensionen aus den Organen von Interesse sind, erhalten. Die Zellen werden mit anti-Thy1.2 (kongene Marker) plus anti-CD8 und dann Thy1.2 gebeizt + CD8 + T-Zellen sind für das Verhältnis von CMTMR analysiert + und CFSE + Zellen in jedem Gewebe durch FACS. Das Gewebe CMTMR / CFSE Verhältnisse sind dann durch den Eingang CMTMR / CFSE Verhältnis normalisiert, um die Homing-Indizes (HALLO) zu erhalten. In diesem Beispiel CMTMR + und CFSE + Zellen sind gut-tropischen und Kontrolle Effektor-T-Zellen.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

Obwohl Homing Experimente sehr wertvolle Informationen über die Migration des gesamten Zell-Populationen in einem bestimmten Gewebe zu schaffen, sollte es im Auge behalten werden, dass diese Tests nicht direkt analysieren endothelialen Adhäsion und daher nicht zu diskriminieren, in der Stufe (n) des mehrstufigen Haftung Kaskade (Tethering / Walz-, Aktivierungs-oder Kleben) eine gegebene Homing-Rezeptor wirkt. Der Goldstandard der spezifischen Rolle der Homing-Rezeptoren in die Haftung Kaskade zu definieren, ist Intravit...

Tiere: C57BL / 6 Mäuse werden häufig für T-Zell-Isolierung verwendet. Darüber hinaus sind CD45.1 und Thy1.1 kongene Stämme durch Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) zur Verfügung. Kulturmedien: IMDM (Iscove-Modified Dulbecco Medium + L-Glutamin + Hepes) plus 10% Hitze-inaktiviertes FBS (fötales Rinderserum, niedrige Endotoxin, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin (HyClone Antibiotika, Waltham, MA), 0,5 mg / ml Fungizone / Amphotericin B (Gibco) und 50 mM b-Mercaptoethanol. ACK Red Blood Cell Lysis-Puffer (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), auf pH 7,2-7,4 und bei Raumtemperatur lagern anpassen). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). Durchflusszytometrie (FACS) Medien (PBS oder IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Wenn Färbung mit Selectin-Fc-Chimären, Medien mit 2 mM Ca + + soll in allen Stufen (einschließlich FACS-Akquisition) verwendet werden. IMDM ist in diesem Fall empfohlen. T-Zell-Kennzeichnung und adoptiven Transfer: CFSE (Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester), CMTMR ((5 - (und-6 )-((( 4-Chlormethyl) benzoyl) amino) Tetramethylrhodamin) von Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1000 x Vorräte sollten in DMSO hergestellt werden (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) und bei -20 ° C. Polyklonale T-Zell-Aktivierung: 24-well oder 96-well-Platten (Gewebe-Kultur behandelt, Polystyrol, mit flachem Boden mit Deckel, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) für 2 Stunden bei 37 ° C mit 50 ml PBS, jeweils inkubiert , mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörper (10 mg / ml). Dann werden Kulturplatten zweimal mit PBS gewaschen und sofort für die T-Zell-Kultur verwendet. Alternativ können Dynabeads mit anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) beschichtet für T-Zell-Aktivierung statt Platte gebundene Antikörper verwendet werden. Durchflusszytometrie (FACS) Färbung: polyklonale Aktivierung: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-Homing-Rezeptoren: gereinigtes CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), Isotyp-Kontrolle (IgG2a, k). Skin-Homing-Rezeptoren: P-Selektin-Fc (gereinigtes Maus P-Selectin - IgG-Fusionsprotein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-Selektin-Fc (rekombinantes Maus E-Selectin/Fc Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) plus entsprechende sekundäre Reagenz Ziege F (ab &#39;) 2 Anti-Human-IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans-Retinsäure (Sigma, St. Louis, MO) wird in absolutem Ethanol oder DMSO mit einer gelben Glühbirne oder eine indirekte Lichtquelle während der Vorbereitung resuspendiert. Shop-Aliquots in Glasflaschen bei -80 ° C und vor Licht geschützt zu allen Zeiten. Synthetische RAR-Agonisten: AM80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing-assays auf gut-trope t-zell-migration study

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Um ihre Funktion ausüben Lymphozyten benötigen, um das Blut zu verlassen und wandern in verschiedenen Geweben im Körper. Lymphozyten-Adhäsion an Endothelzellen und Gewebe Extravasation ist ein mehrstufiger Prozess durch verschiedene Adhäsionsmoleküle gesteuert (Homing-Rezeptoren) auf Lymphozyten und ihre jeweiligen Liganden (Addressine) auf Endothelzellen 1 2 angezeigt ausgedrückt. Obwohl die Funktion dieser Adhäsionsrezeptoren teilweise untersucht werden können ex vivo, der ultimative Test für ihre physiologische Relevanz ist, ihre Rolle bei der In-vivo-Lymphozyten Adhäsion und Migration zu bewerten. Intravitalmikroskopie (IVM) und Homing-Experimente: Zwei sich ergänzende Strategien sind für diesen Zweck verwendet worden. Obwohl IVM war wesentlich an den genauen Anteil der spezifischen Adhäsionsrezeptoren während die Haftung Kaskade in Echtzeit und in verschiedenen Geweben zu definieren, IVM zeitaufwendig und arbeitsintensiv ist, ist es oft erfordert die Entwicklung von anspruchsvollen chirurgischen Techniken, braucht es vor Isolierung von homogenen Zellpopulationen und es erlaubt die Analyse von nur einem Gewebe / Organ zu einem bestimmten Zeitpunkt. Im Gegensatz dazu ermöglichen wettbewerbsfähige Homing Experimente die direkte und gleichzeitige Vergleich bei der Migration von zwei (oder sogar mehr) Zellpopulationen in der gleichen Maus und sie erlauben auch die Analyse von vielen Geweben und einer hohen Anzahl von Zellen in das gleiche Experiment. Hier beschreiben wir die klassischen kompetitiven Homing-Protokoll verwendet, um den Vorteil / Nachteil eines bestimmten Zelltyp zu Hause, um spezifische Gewebe zu bestimmen, wie ein Steuerelement Zellpopulation verglichen. Wir entschieden uns für die Migration von gut-tropic gegenüber nicht gut-tropic T-Zellen zeigen, da die Darmschleimhaut ist die größte Körperoberfläche in Kontakt mit der äußeren Umgebung und es ist auch die extra-lymphatischen Gewebes mit den besten definierten wandernde Anforderungen . Darüber hinaus haben neuere Arbeiten festgestellt, dass die Vitamin-A-Metaboliten all-trans-Retinsäure (RA) die wichtigsten molekularen Mechanismus für die Induktion gut-spezifische Adhäsion Rezeptoren (Integrine a4b7and Chemokinrezeptor CCR9) auf Lymphozyten ist. So können wir ohne weiteres erzeugen eine große Anzahl von gut-tropischen und nicht gut-tropic Lymphozyten ex vivo durch Aktivierung von T-Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von RA, bzw., was schließlich in der Wettbewerbssituation Homing hier beschriebenen Experimente verwendet werden.

Competitive Homing Experimente erlauben die direkte Beurteilung der wandernde Eigenschaften von zwei verschiedenen Zellpopulationen in einem einzigen Mausklick. Hier veranschaulichen wir dieses Verfahren durch einen Vergleich der Migration von ex vivo generierten gut-tropic versus nicht-gut tropic T-Zellen.

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

Um ihre Funktion auszuüben, müssen Lymphozyten das Blut verlassen und in verschiedene Gewebe des Körpers migrieren. Die Adhäsion von Lymphozyten an das Endothel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die gewebespezifischen Migrationsfähigkeiten von zwei oder mehr Zellsubpopulationen im selben Maus-Empfänger zu vergleichen, wodurch die Analyse vieler Gewebe und Zellen in einem einzigen Experiment ermöglicht wird. Hier zeigen wir eine Methode zum Vergleich der Migrationsfähigkeiten von in vitro erzeugten, darmtropen und kontrollierten T-Zellen in einer Wildtyp-Maus. Die Methode kann beispielsweise verwendet werden, um die Fähigkeit darmtropen T-Zellen zu untersuchen, in die mesenterialen Lymphknoten des Darms, periphere Lymphknoten und die Milz zu wandern.Im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen müssen zunächst gastrointestinaltrophe und Kontroll-Effektor-T-Zellen in vitro generiert werden. Anschließend müssen die experimentellen und kontrollierten T-Zellen mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert und im Verhältnis 1:1 gemischt werden. Danach wird das Zellgemisch – mit Ausnahme einer kleinen Menge, die zur Bestätigung des Eingangsverhältnisses verwendet wird – in die Empfängermaus injiziert.Schließlich wird die Maus 18 Stunden nach der adoptiven Übertragung getötet, und die Organe von Interesse werden mittels Durchflusszytometrie auf das Vorhandensein von gastrointestinalen und Kontroll-T-Zellen analysiert. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren wie der adoptiven Übertragung einzelner Zellpopulationen liegt darin, dass eine Kombination verschiedener Subtypen in dieselbe Empfängermaus injiziert wird, wodurch die Variabilität, die mit intravenösen Injektionen oder der Verwendung unterschiedlicher Empfänger-Mäuse verbunden ist, stark reduziert wird. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von Erkrankungen, die mit einer massiven Leukozyteninfiltration assoziiert sind, wie beispielsweise der entzündlichen Darmerkrankung.Beispielsweise ermöglicht es uns, die Anzahl der Moleküle zu bestimmen, die während der normalen sowie der aranen Lymphozytenwanderung in den Darm benötigt werden. Darüber hinaus erlaubt uns dieses Verfahren, die Wirksamkeit von Arzneimitteln zu bewerten, die darauf abzielen, den Leukozyten-Transport zu blockieren. Beschriften Sie jedes Loch einer 24-Loch-Platte mit 500 Mikrolitern PBS, das 10 Milligramm pro Milliliter Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörper enthält. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden bei 37 °C in 5 % Kohlendioxid, während die Löcher beschichtet werden.Ein Wildtyp-Maus opfern und die Milz dissezieren, wobei diese in ein 50-Milliliter-Gefäß mit Medium gegeben wird. Die PLE-Zellen isolieren, indem die Milz zwischen zwei Objektträgern zerdrückt und über einer Petrischale aufgelöst wird. Die Zellen in PBS resuspendieren, die Zellsuspension mit einer Pipette in ein neues 50-Milliliter-Konischgefäß überführen und fünf Minuten lang zentrifugieren.Bei 400 Gs bei Raumtemperatur entfernen Sie den Überstand und lysieren die roten Blutkörperchen, indem Sie das Zellpellet in vier Milliliter Aktiv-Lysepuffer suspendieren und zwei bis drei Minuten inkubieren. Beenden Sie die Lyse durch Zugabe von fünf Milliliter PBS, zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut fünf Minuten bei 400 Gs bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das resultierende Pellet in einer Konzentration von einmal 10 der sechs Zellen pro Milliliter in vollständigem Eis.Coves-modifiziertes Delcos-Medium oder IMDM gleichermaßen, die resultierende Zellsuspension auf zwei separate Röhrchen aufteilen, eines der Röhrchen mit all-trans-Retinsäure oder RA auf eine Endkonzentration von 100 bis 200 Nanomolar³ ergänzen. Das Röhrchen vor direktem Licht schützen, um den Abbau der all-trans-Retinsäure zu vermeiden. Die 24-Loch-Platte aus dem Inkubator nehmen und jedes Loch zweimal mit je zwei Millilitern PBS waschen.Geben Sie 1,5 bis zwei Milliliter der mit RA ergänzten Zellsuspension in die Hälfte der 24-Loch-Platte. Fügen Sie anschließend die gleiche Menge der Kontrollzellen in jedes Loch der zweiten Hälfte der 24-Loch-Platte hinzu und stellen Sie die Platte in den Inkubator zurück. Nach zwei bis drei Tagen überführen Sie die Zellsuspensionen in eine neue, nicht beschichtete 24-Loch-Platte.Um eine Überstimulation der T-Zellen zu vermeiden, inkubieren Sie die Zellen für zusätzliche zwei bis drei Tage. Falls das Medium aufgrund der Zelldichte und/oder Proliferation gelb wird, geben Sie 500 Mikroliter frisches IMDM pro Vertiefung hinzu, um ein Endvolumen von einem Milliliter pro Vertiefung zu erreichen. Um die Zellen zu gewinnen, sammeln Sie am Tag vier oder fünf das Überstandmedium, wobei der Tag, an dem die Zellen ausgesät wurden, als Tag null gezählt wird. Typische Endausbeuten betragen ein- bis zweimal 10 der sechs Effektor-T-Zellen pro Mulde. Daher sollten mindestens neun bis zwölf Mulden jeweils der gastrointestinaltropen und kontrollierten T-Zellen beimpft werden, um 10 bis 20 mal 10 hoch sechs T-Zellen pro Gruppe zu erzeugen. Um die Expression von Alpha vier, Beta sieben und CCR neun auf ra zu überprüfen.Aktivierte und kontrollierte T-Zellen sammeln zwischen 0,2 und 0,5 mal 10 hoch 6 der frisch gewonnenen experimentellen und Kontrollzellen in vier Milliliter fassende FACS-Röhrchen und zentrifugieren diese fünf Minuten bei 300 ×g und vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Markierungspuffer. Inkubieren Sie sie 15 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln mit Anti-CD4-FSE, Anti-CD4β7-PE, Anti-CCR9-APC und Anti-CD8-PerP.Nach der Inkubation die Zellen mit PBS bei 300 ×g und 4 °C fünf Minuten lang waschen, den Überstand verwerfen und die Zellen erneut in Puffer resuspendieren. Die Analyse mittels Durchflusszytometrie erfolgt zu Beginn dieses Schritts. Für die spätere Verwendung im Färbeprotokoll eine Flasche IMDM und eine Flasche PBS auf 37 °C vorwärmen.Nachdem die T-Zell-Homing-Phänotypen der beiden Zellkulturen mittels Durchflusszytometrie wie im vorherigen Schritt beschrieben bestätigt wurden, zentrifugieren Sie die frisch gewonnenen Populationen an alpha vier, beta sieben, hoch CCR neun, hoch gastrointestinal tropischen und alpha vier, beta sieben, niedrig oder negativ für CCR neun, niedrig oder negativ kontrollierten T-Zellen bei 300 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen anschließend noch zweimal mit PBS, um das Serum zu entfernen, und stellen Sie die T-Zell-Konzentration jeder Gruppe auf 10 bis 15 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in PBS ein. Geben Sie CFSE oder C-M-T-M-R-Farbstoffe entweder zu den gastrointestinal tropischen T-Zellen oder zu den Kontroll-T-Zellen hinzu.Hier wird CFSE der Kontrollzellpopulation zugesetzt und C-M-T-M-R dem Darm zugegeben. Tropische T-Zellen auf eine Endkonzentration von jeweils fünf Millimolar und 10 Millimolar. Vorsichtig die Zellen fünf Sekunden lang verwirbeln und die Röhrchen 20 Minuten bei 37 Grad Celsius im Wasserbad inkubieren. Nach der Inkubationszeit die Färbung durch Zugabe von fünf Millilitern FPS stoppen und eine bis fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.10-mal mit warmer PBS verdünnen und fünf Minuten bei 300 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Das Überstand entfernen und die Zellen zwei weitere Male mit PBS waschen, anschließend in vollständigem IMDM resuspendieren. Idealerweise sollten 10 bis 20 × 10⁶ Zellen jeder T-Zell-Population im Verhältnis 1:1 in 4-Milliliter-Falcontubes gemischt werden.Um das genaue Eingabeverhältnis zu berechnen, lagern Sie fünf bis 10 Mikroliter der tubi-injizierten Zellsuspension, die als Input bezeichnet wird, bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die zu injizierende Zellmischung bei Raumtemperatur mit 300 × g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie die zu injizierenden Zellen in 250 bis 300 Mikroliter warmer PBS. Befüllen Sie eine Ein-Kubikzentimeter-Insulinspritze mit einer 28-Gauge-Nadel mit den Zellen für die Injektion.Injizieren Sie 250 Mikroliter der Zellmischung über die Schwanzvene. Analysieren Sie abschließend die Eingabezellen mittels Durchflusszytometrie, um den Prozentsatz der CFSE- und C-M-T-M-R-positiven Zellen zu bestimmen, die zuvor injiziert wurden. Dies stellt das verwendete Eingabeverhältnis dar.Bei der abschließenden Berechnung des Homing-Index suspendieren wir die Zellproben aus den Geweben zur Analyse des T-Zell-Homing in einer Dichte von nicht mehr als dreimal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter. Wenn kongäne Mäuse als Empfänger in diesem Video verwendet werden, wurden CD45.1-positive Zellen mit dem geeigneten kongänen Marker gefärbt, kombiniert mit einem Linien-Marker während der Durchflusszytometrie; die Zellen werden dabei anhand des gewählten kongänen Markers und anschließend anhand des spezifischen Linien-Markers CD8 gezielt ausgewählt und die Verhältnisse zwischen CMTMR- und CFSE-positiven Zellen analysiert.Die Daten werden dann als Homing-Index oder hi ausgedrückt, der als Verhältnis zwischen den beiden verschiedenen Farbstoffen in jedem Gewebe, dividiert durch das entsprechende Eingangsverhältnis, berechnet wird. Das Eingangsverhältnis ist das Verhältnis zwischen CFSE-positiven und CMTM TMR-positiven Zellen in der Spritze vor der Injektion, berechnet aus dem beiseitegestellten und zu diesem Zweck mittels Durchflusszytometrie analysierten Aliquot von fünf bis 10 Mikroliter Zellsuspension. Wenn das Eingangsverhältnis sehr nahe bei eins liegt, entsprechen die Gewebeverhältnisse dem hi.Falls der HI-Wert im Blut signifikant von eins abweicht, kann der HI-Wert in den analysierten Geweben durch den HI-Wert im Blut normalisiert werden, indem das Verhältnis des HI-Werts im Gewebe zum HI-Wert in den aus der Milz, peripheren Lymphknoten oder mesenterialen Lymphknoten (MLN) bzw. der Lamina propria (LP) des Dünndarms gewonnenen Zellsuspensionen 18 Stunden nach Injektion berechnet wird. Es wurden C-M-T-M-R- und CFSE-Expression auf selektierten CD8-positiven, CD45.1-positiven Zellen analysiert. RA-aktivierte, α4β7- und CCR9-exprimierende, C-M-T-M-R-positive T-Zellen wanderten in vergleichbarer Anzahl zur Kontrolle in die Milz ein, zeigten jedoch eine deutliche Zunahme der Homing-Fähigkeit zum Darm und zu trainierenden lymphatischen Geweben. Die Berechnung des HI-Werts für jedes Gewebe bestätigte weiterhin, dass guttropische und Kontroll-T-Zellen gleich effizient zur Milz wanderten, während guttropische T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen etwa zehnmal effizienter in die LP migrierten, nachdem die Methode beherrscht wurde.Die Verwendung kongener Mäuse anstelle der Farbstoffmarkierung kann durchgeführt werden, um die Migrationsfähigkeit zusätzlicher Zelltypen wie dendritischer Zellen oder Mikrophagen zu beurteilen. Da diese Zelltypen dazu neigen, den Farbstoff nach der Injektion in die Empfängermäuse zu verlieren, ermöglicht die Verwendung kongener Tiere eine bessere Verfolgung der Zellen über deutlich längere Zeiträume nach der adoptiven Übertragung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

T-Lymphozyten-Migration tritt bei der Referenzfahrt zu lymphatischen Organen, Ausfahrt aus dem Gefäßsystem, und das Eintreten in den peripheren Geweben. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden, um T-Lymphozyten-Migration zu analysieren...

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

Dieses Video beschreibt die Bildgebung von residenten tumorinfiltrierenden CD8-T-Zellen, die mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern in menschlichen Lungentumorschnitten markiert wurden. Diese Technik ermöglicht Echtzeitanalysen der Migration von CD8-T-Zellen mittels konfokaler Mikroskopie.

Echtzeit-Analyse der residenten T-Zell-Migration in verschiedenen Tumorregionen mittels konfokaler Mikroskopie

Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

In diesem Protokoll werden Lymphozyten in die obere Kammer eines Transmigrationssystems gelegt, die durch eine poröse Membran von der unteren Kammer getrennt sind. Chemokin wird der unteren Kammer hinzugefügt, was eine aktive Migration entlang eines Chemokingradienten induziert. Nach 48 h werden Lymphozyten in beiden Kammern gezählt, um die Transmigration zu quantitieren.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming-regulatorischen T-Zell-Induktion vor. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen des aktiven Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und des aktiven VitaminS A (Retinoinsäure oder RA) de novo zu produzieren.

In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur primären Isolierung von murinen T-Zellen und eine Zeitraffermikroskopie der T-Zellmigration unter spezifischen Umweltbedingungen mit quantitativer Analyse.

Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen

Wir stellen verbesserte Protokolle für die retrovirale Transduktion von Transportrezeptoren und kompetitives Homing vor, um die Rezeptor-vermittelte organ- und mikroumgebungsspezifische Lymphozytenpositionierung zu untersuchen. Diese Methode bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen des Transports von Immunzellen und hat potenzielle Anwendungen in der zukünftigen Grundlagen- und Therapieforschung.

Effiziente retrovirale Transduktion und kompetitives Homing zur Untersuchung der GPCR-vermittelten T-Zell-Lokalisierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen

Erfahren Sie den Competitive Homing-Assay zur Analyse der Migration von darmtropen T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen in Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung gewebespezifischer Wanderungsfähigkeiten in vivo.

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

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