Name: Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Lernen Sie die Whole-mount-Immunhistochemie zur Analyse des Gefäßsystems in embryonaler Mäuselimbenhaut. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Konfokalmikroskopie für Studien zur vaskulären Entwicklung.

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Wir danken K. Gill für die Unterstützung bei der Maus Zucht und Pflege sowie für Labor-Management. Danke auch an Mukoyama lab Mitglieder für technische Hilfe. Die Finanzierung wurde von Intramural Research Program der Nationalfeiertag Institutes of Health zur Verfügung gestellt.

1. Sammeln embryonalen Maus-Limb Skin (E13.5 ~ E17.5) <ol><li> Euthanize gesteckt Weibchen durch zugelassene Verfahren. Nach unseren zugelassenen Tier-Protokoll sind die Weibchen von CO 2 Belastung eingeschläfert und dann durch Genickbruch gewährleistet. Legen Sie das Tier auf seinen saugfähigen Papiertuch und legen Sie ihn gründlich in 70% EtOH / H 2 O aus einer Spritzflasche. </li><li> Präparieren Sie die Gebärmutter intakt und legen Sie sie in einem 100 x 15 mm Petrischale mit eiskaltem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) zu waschen Blut. </li><li> Separate und sezieren des Embryos. Entfernen Sie die sehr dünne Amnion aus dem Embryo. </li><li> (Option) Dissect eines einzigen Embryos in einem 35 x 10 mm Petrischale, wenn jeder Embryo muss genotypisiert werden. Dissected Schwanz ist ein 0,2 ml PCR-Röhrchen für die Genotypisierung übertragen. </li><li> Schneiden Sie die Vorderbeine des Embryos und Transfer Vorderbeine durch einen Ring Pinzette in 24-Well-Platte mit 2 ml eiskaltem frischen 4% Paraformaldehyd (PFA) in Phosphatpuffer Saline (PBS). </li><li> Fix die Vorderbeine mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Am folgenden Tag, entfernen Sie die PFA und waschen dreimal für 5 min in 2 ml PBS mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie die Vorderbeine in 100% Methanol (MeOH) und speichert sie bei -20 ° C Enzym Gefrierschrank (Gefrierschrank mit kritischen Temperatur-Steuerung und ohne automatische Abtauung). Primärantikörper in Tabelle 1 der Arbeit nach der 100% MeOH Behandlung aufgeführt. </li><li> Peel off Haut aus dem Vorderbein mit feinen Pinzette. Limb Haut, wenn entwässert, sollte einfach zu trennen von der Extremität. Der erste Platz der Extremität mit Bauchseite (Handfläche) nach oben. Dann mit feinen Pinzetten, schneiden Sie die Haut wie im Video gezeigt. Next um den gesamten Leib sezieren, Peeling die Haut sanft, ohne Schäden. </li></ol> 2. Whole-mount immunhistochemische Färbung von Limb Skins <ol><li> Rehydrieren die Extremität Skins in 5ml Polypropylen mit rundem Boden Rohr durch Inkubation durch die abgestufte Reihe von MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) für jeweils 5 min. Beachten Sie, dass der Austausch-Lösungen sollten vorsichtig sein, um eine Beschädigung des Körpers skins. </li><li> Zweimal waschen für 5 min in PBT mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. </li><li> Blockieren Sie die Gliedmaßen Skins entweder mit 10% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 Blockierungspuffer für Ziege Sekundärantikörper oder 10% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100 Blockierungspuffer für Esel Sekundärantikörper für 2 Stunden unter leichtem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 2ml-Reaktionsgefäß mit 800μl des primären Antikörpern (entsprechender Verdünnung in den Tabellen aufgeführt) in den Blocking-Puffer (entweder 10% Ziegenserum / PBS + 0,2 % TX100 oder 10% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). Inkubieren der Extremität Skins mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei 4 ° C über Nacht. Beachten Sie, dass mehrere primäre Antikörper aus verschiedenen Spezies (zB Ratte monoklonale Antikörper + polyklonalen Kaninchen-Antikörper) abgeleitet gleichzeitig genutzt werden können. </li><li> Am folgenden Tag, Ort der Extremität Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 5ml Polypropylen mit rundem Boden Rohr mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2 % Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). </li><li> Wash fünfmal für 15 min unter leichtem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 2ml-Reaktionsgefäß mit 800μl der Sekundärantikörper in den Blocking-Puffer (entweder 10% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 10% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). In der Regel verwenden wir Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 Verdünnungen) oder Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 Verdünnung). Filtern Sie die sekundären Antikörper-Lösung mit 0,22 &amp;mgr; m PVDF-Membran Spritzenfilter, um aggregierte Partikel der sekundären Antikörper zu entfernen. Inkubieren der Extremität Skins im Dunkeln oder mit Alufolie umwickelt für 1 Stunde mit leichtem Rühren auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass verschiedene fluoreszierende konjugierte sekundäre Antikörper von verschiedenen Spezies abgeleitet gleichzeitig genutzt werden können. </li><li> Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 5ml Polypropylen mit rundem Boden Rohr mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). Wash fünfmal für 15 min im Dunkeln oder umwickelt mit Alufolie mit leichtem Rühren auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. </li><li> (Option für die Gegenfärbung gegen Kern) Inkubieren der Extremität Skins mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100) mit To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 Verdünnung) in der Dunkelheit oder umwickelt mit Alufolie für 10 min unter leichtem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Zimmertemperatur Temre. Dann waschen dreimal 5 min mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100) im Dunkeln oder durch Aluminium-Folie mit leichtem Rühren auf gewickelt dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass starke und spezifische Färbung für Keime für Um-pro-3 ist in einer spezifischen Emission (HeNe 633 nm Anregung) beobachtet. </li></ol> 3. Montage des Limb Skins auf Slide <ol><li> Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale. Entfernen Sie Staub, Kristallen, Fasern von der inneren Schicht der Haut mit feinen Pinzetten unter dem Stereomikroskop mit geringer Beleuchtung auf umfangreiche Foto Bleichen zu vermeiden. </li><li> Übertragen Sie die Extremitäten Skins, um Klebstoff Objektträger durch einen Ring Pinzette. Legen Sie die Haut mit der inneren Schicht liegt oben auf der Folie (dh in Richtung Deckglas). Flatten die Felle sorgfältig mit feinen Pinzette und entfernen carry-over Waschpuffer durch Kimwipe. </li><li> Berg in anti-fade Montage Medien ohne Luftblasen. Wir verwenden 25 "x25" Deckglas. Cure auf einer ebenen Fläche in der Dunkelheit (zB montiert die Proben unter Verwendung ProLong Gold-Reagenz werden über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur vorgelegt, bevor viewing). Für die langfristige Lagerung, Deckglasränder, um die Folie und lagern bei 4 ° C. </li></ol> 4. Konfokale Mikroskopie <ol><li> Richten Sie entsprechende Laser für Fluorophore. Wir verwenden Leica TCS SP5 konfokalen Mikroskop mit drei Laserquellen mit Argon 488nm (für Alexa Fluor 488 und GFP), DPSS 561nm (für Alexa Fluor 568 und Cy3) und HeNe 633nm (für Alexa Fluor 633, Cy5 und To-Pro-3) . </li><li> Verwenden sequenziellen Scan-Tool zu vermeiden oder zu vermindern das Übersprechen in dem alle Farbstoffe in Doppel-oder Dreifach-gefärbten Proben gleichzeitig begeistert sein. In der sequentiellen Scan-Modus, werden die Bilder in einer sequenziellen Reihenfolge aufgezeichnet werden. </li><li> Weitere allgemeine Informationen über Fluoreszenzfarbstoffe und Laser für die Anregung kann in "Die konfokale Mikroskopie für Biologen" gegründet werden, indem Hibbs (2004) </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Whole-mount Triple-Label konfokalen Mikroskopie in immnofluorescence Maus forelimb Haut an E15.5 mit Antikörpern gegen die pan-Endothelzell-Marker PECAM-1 (Abbildung 1A-C, D blau), die Neurofilament Marker 2H3 (Abbildung 1A grün) und die glatte Muskelzelle Marker αSMA (Abbildung 1A, B rot) zeigte eine charakteristische Verzweigungsmuster αSMA + Arterien, mit 2H3 + peripheren Nerven in den Gliedmaßen Haut ausgerichtet. Neben der Blutgefäße Verzweigungen, ist dieser Teil der Haut Gefäßsystem Modell zur Strukturierung von Lymphgefäßsystem Verzweigung mit Antikörpern gegen das lymphatische Endothel-Zell-Marker LYVE-1 (Abb. 1D, E rot) und Neuropilin2 (NRP2) (Abbildung 1D-, F grün-Studie ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (AC) Arterien align mit peripheren Nerven in der embryonalen Körpers Haut. Whole-mount Triple-Label konfokalen Mikroskopie immnofluorescence mit Antikörpern gegen die pan-Endothelzell-Marker PECAM-1 (AC, blau), die Neurofilament Marker 2H3 (A, grün) und der glatten Muskelzellen Marker αSMA (A und B, rot ) gezeigt. Am E15.5, 2H3 + peripheren Nerven (offene Pfeile) assoziieren mit Arterien (Pfeilspitzen), die durch αSMA abgedeckt werden + glatten Muskelzellen. (DF) Lymphgefäßsystems in der embryonalen Körpers Haut. Triple-Label konfokalen Mikroskopie immnofluorescence mit Antikörpern gegen die pan-Endothelzell-Marker PECAM-1 (D, blau), des lymphatischen Endothelzellen Marker LYVE-1 (D und E, rot) und Neuropilin2 (NRP2) (D und F, grün ) gezeigt. Lymphgefäße werden visualisiert sowohl LYVE-1 und NRP2, während LYVE-1 wird auch durch eine Teilmenge von Makrophagen (offene Pfeilspitzen) ausgedrückt. Maßstab: 100 um.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

Das Gefäßsystem ist entscheidend für die Entwicklung der Organe während der Embryonalentwicklung sowie für Orgel Wartung und reproduktiven Funktionen in die Erwachsenen, weil es genügend Sauerstoff und Nährstoffe zu den Organen liefert. Proper Gefäßnetz ist mit komplexen und mehrstufigen Verfahren durch Angiogenese, in dem bereits bestehenden Netz von Kapillaren mit stark verzweigten und hierarchischen Strukturen neu organisiert ist gut etabliert. Obwohl zahlreiche Arbeiten haben gezeigt worden, dass eine Vielzahl von M...

Antibodies Pan-Endothelzell-Marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Spezies </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Arbeitsbedingung </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Armenische Hamster (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> 1:100-Verdünnung Nr. 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300 Verdünnung </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 Verdünnung </td></tr><tr><td> Collagen IV </td><td> Rabbit (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 Verdünnung Nr. 2 </td></tr></tbody></table> Arterielle Endothelzellen Marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Spezies </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Arbeitsbedingung </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Rabbit (P) </td><td> Der Alex Kolodkin Labor # 3 </td><td></td><td> 1:3000 Verdünnung </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Goat (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr></tbody></table> Venöse Endothelzellen Marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Spezies </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Arbeitsbedingung </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Goat (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> 1:100-Verdünnung </td></tr></tbody></table> Lymphatische Endothelzellen Marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Spezies </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Arbeitsbedingung </td></tr><tr><td> LYVE-1 Nr. 4 </td><td> Rabbit (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr><tr><td> LYVE-1 Nr. 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Rabbit (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000-Verdünnung </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Goat (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> 1:50-Verdünnung </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Rabbit (P) </td><td> Cell Signaling </td><td> 3366 </td><td> 1; 100-Verdünnung </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Goldhamster (M) </td><td> Hybridoma der Bank </td><td> 8.1.1 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr></tbody></table> Glatte Muskelzellen / Perizyten Marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Spezies </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Arbeitsbedingung </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Maus (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> 1:500-Verdünnung Nr. 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Rabbit (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Rabbit (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr></tbody></table> Antikörper für GFP-Reporter <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Spezies </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Arbeitsbedingung </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rabbit (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 Verdünnung </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai Tesque </td><td> 04404-84 </td><td> 1:1000-Verdünnung </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Chick (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 Verdünnung </td></tr></tbody></table> Antikörper für LacZ Reporter <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Spezies </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Arbeitsbedingung </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Rabbit (P) </td><td> MP Biomedical </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 Verdünnung </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Goat (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500 Verdünnung </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chick (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr></tbody></table> Antikörper für periphere Axon <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Spezies </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Arbeitsbedingung </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Maus (M) # 7 </td><td> Hybridoma der Bank </td><td> 2H3 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Maus (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> 1:500 Verdünnung </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> Rabbit (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000-Verdünnung </td></tr></tbody></table> Antikörper für die Migration von Schwann-Zellen <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Rabbit (P) </td><td> Die Thomas Müller-Labor Nr. 9 </td><td></td><td> 1:3000 Verdünnung </td></tr></tbody></table> (P): polyklonaler Antikörper, (M): monoklonaler Antikörper # 1: Goat anti-armenischen Hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) Antikörper sollte als sekundärer Antikörper verwendet werden. # 2: Die Collagen IV Antikörper kann verwendet werden, um die Blutgefäße nach in-situ-Hybridisierung nachgewiesen werden. # 3: Die Neuropilin1 Antikörper wird freundlicherweise von der Alex Kolodkin Labor in der Johns Hopkins University zur Verfügung gestellt. Sheep anti-human Neuropilin1 Antikörper ist in R &amp; D (AF3870), obwohl wir es noch nicht getestet noch. # 4: Die LYVE-1-Antikörper auch erkennen, eine Teilmenge von Makrophagen in der embryonalen Haut. # 5: Die Anti-αSMA Antikörper Maus IgG2a monoklonaler Antikörper. # 6: Die Cy3-konjugierten αSMA Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur zusammen mit sec inkubiertondary Antikörper für andere primäre Antikörper. # 7: 2H3-Antikörper IgG1 monoklonaler Antikörper gegen Neurofilament. # 8: Tuj1 Antikörper Maus IgG2a monoklonaler Antikörper gegen Neuron-spezifische Klasse III beta-Tubulin. # 9: Die BFABP (Gehirn-spezifische fatty acid binding protein)-Antikörper wird freundlicherweise von der Thomas Müller-Labor in Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin zur Verfügung gestellt.

whole-mount immunhistochemische analyse für embryonale limb haut gefäßsystem: ein modellsystem zur vascular branching morphogenese in embryo-studie

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunhistochemische Analyse zur Abbildung des gesamten Gefäßsystem ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der zellulären Mechanismen der Verzweigung Morphogenese. Wir haben das Bein Haut Gefäßsystem Modell der vaskulären Entwicklung, in der eine bereits bestehende primitive Kapillarplexus in eine hierarchisch verzweigten Gefäßnetz reorganisiert wird Studie entwickelt. Whole-mount konfokalen Mikroskopie mit mehreren Kennzeichnung ermöglicht robuste Bildgebung von intakten Blutgefäßen sowie deren zelluläre Komponenten, einschließlich Endothelzellen, Perizyten und glatte Muskelzellen, mit spezifischen fluoreszierenden Marker. Advances in diesem Teil der Haut Gefäßsystem Modell mit genetischen Studien haben ein besseres Verständnis molekularer Mechanismen der vaskulären Entwicklung und Strukturierung. Das Glied Haut Gefäßsystem Modell wurde verwendet, zu untersuchen, wie peripheren Nerven eine räumliche Vorlage liefern für die Differenzierung und Strukturierung von Arterien. Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache und robuste Protokoll zu intakten Blutgefäßen mit vaskulären spezifische Antikörper und fluoreszierende Sekundärantikörper werden, die für vaskularisierte embryonale Organe, wo wir in der Lage sind, den Prozess der vaskulären Entwicklung folgen Fleck.

Wir stellen Ihnen eine ganze-mount Immunhistochemie und konfokaler mit mehreren Kennzeichnung für die Analyse von komplizierten Gefäßnetz Bildung in embryonalen Maus Gliedmaßen Haut.

Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Die immunhistochemische Whole-Mount-Analyse zur Bildgebung der gesamten Gefäßarchitektur ist entscheidend für das Verständnis der zellulären Mechanismen der verzweigenden Morphogenese. Wir haben das Modell der Gliedmaßenhaut-Vaskulatur entwickelt, um die Gefäßentwicklung zu untersuchen, bei der ein präexistenter, primitiver Kapillarplexus in ein hierarchisch verzweigtes Gefäßnetzwerk reorganisiert wird. Die Whole-Mount-Konfokalmikroskopie mit Mehrfachmarkierung ermöglicht eine robuste Bildgebung intakter Blutgefäße sowie ihrer zellulären Komponenten, einschließlich Endothelzellen, Perizyten und glatten Muskelzellen, unter Verwendung spezifischer Fluoreszenzmarker. Fortschritte in diesem Modell der Gliedmaßenhaut-Vaskulatur in Verbindung mit genetischen Studien haben das Verständnis der molekularen Mechanismen der Gefäßentwicklung und -musterung verbessert. Das Modell der Gliedmaßenhaut-Vaskulatur wurde verwendet, um zu untersuchen, wie periphere Nerven eine räumliche Vorlage für die Differenzierung und Musterung von Arterien liefern. Dieser Video-Artikel beschreibt ein einfaches und robustes Protokoll zur Färbung intakter Blutgefäße mit gefäßspezifischen Antikörpern und fluoreszierenden Sekundärantikörpern, welches auf vaskularisierte embryonale Organe anwendbar ist, bei denen wir den Prozess der Gefäßentwicklung verfolgen können.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Ganzpräparat-Immunhistochemie zur Abbildung der gesamten Gefäßstruktur in der sich entwickelnden Extremitätenhaut durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst vier Extremitäten vom Embryo abgeschnitten, die vier Extremitäten in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und anschließend in 100 % Methanol dehydriert werden. Der zweite Schritt besteht darin, mit feiner Pinzette die Haut an der Basis der Extremität abzulösen.Folgen Sie den blauen gestrichelten Linien und lösen Sie die Haut in einer Schale mit 100 % Methanol ab. Entfernen Sie die Haut vom Gliedmaßenabschnitt. Anschließend wird eine immunhistochemische Färbung mit vaskulär-spezifischen primären Antikörpern und fluoreszierenden sekundären Antikörpern am Hautpräparat der Gliedmaße durchgeführt.Schließlich ermöglicht die konfokale Mikroskopie von Ganzpräparaten mit Mehrfachmarkierung eine robuste Abbildung der gesamten Gefäßversorgung der Haut des Gliedes, was diesen Ansatz gegenüber bestehenden Methoden wie der histologischen Analyse durch Querzählung vorteilhaft macht. Im Gegensatz zur Embryonalschnitttechnik erlaubt die immunhistochemische Analyse von Ganzpräparaten der Gefäßversorgung der Gliedmaßenhaut nicht nur die Abbildung des gesamten vaskulären Netzwerks einschließlich seiner zellulären Bestandteile, sondern auch die Untersuchung von Differenzierungsprozessen sowie der Musterbildung von Blutgefäßen und der Verzweigung lymphatischer Gefäße. Wir demonstrieren das Verfahren gemeinsam mit DA, Postdoktorandin aus meinem Labor. Embryonale Gliedmaßenhautproben werden von trächtigen weiblichen Mäusen gewonnen.Nachdem Sie die Gebärmutter entfernt und gewaschen haben, arbeiten Sie unter einem Stereomikroskop, um die Embryonen zu isolieren und zu präparieren. Sobald die Embryonen präpariert sind, entfernen Sie als Nächstes die vier Gliedmaßen mit feinen Pinzetten. Schneiden Sie die vier Gliedmaßen an der Schulter ab und verwenden Sie dann eine Ringzange, um die vier Gliedmaßen in eine 24-Well-Platte mit Eis zu überführen.Kaltes, frisches 4 % Paraformaldehyd in PBS: Geben Sie zwei vier LIMS pro Brunnen in zwei Milliliter 4 % PFA. Fixieren Sie die vier Gliedmaßen unter sanftem Mischen auf einem Schüttelmixer bei vier Grad Celsius über Nacht. Am folgenden Tag entfernen Sie das PFA aus jedem Brunnen und geben zwei Milliliter PBS hinzu.Spülen Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf dem Mutator-Mischer. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang zweimal, insgesamt drei Spülgänge. Danach überführen Sie die vier Gliedmaßen in eine 5-Milliliter-Polypropylen-Rundbodentube, die 100 % Methanol enthält, und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius in einem Enzymtiefkühler mit kritischer Temperaturkontrolle und ohne automatische Abtauung. Nach der Übernachtlagerung bei minus 20 Grad Celsius kann die Haut vom darunterliegenden Gewebe abgezogen werden.Dies ist einer der kritischsten Aspekte dieses Verfahrens, da der Erfolg der anschließenden Färbung und Bildgebung davon abhängt, dass die Hautproben nicht beschädigt werden. Die Extremitätenhaut löst sich leicht von der Extremität, wenn sie auf diese Weise dehydriert wird, um die Haut von den vier Gliedmaßen abzuziehen. Legen Sie zuerst die Extremität mit der ventralen Seite nach oben.Danach mit feinen Pinzetten entlang einer geraden Linie durch die Haut nahe der Basis der Extremität in Richtung Pfote schneiden. Anschließend die gesamte Extremität umschneiden und die Haut ablösen, während man die Extremität dreht. Sobald die Haut abgezogen wurde.Die vier Gliedmaßen beginnen die Ganzpräparat-Immunhistochemie der Bein-Haut. Bereiten Sie im Voraus drei 50-Milliliter-Stammlösungen mit 75 %, 50 % und 25 % Methanol in PBT zum Rehydrieren vor. Die Haut, die Bein-Haut, wird durch Inkubation in einer abgestuften Reihe von Methanol von der höchsten zur niedrigsten Methanol-Konzentration jeweils fünf Minuten lang rehydriert.Überführen Sie zunächst die Extremitätenhaut in ein fünf Milliliter fassendes Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden, das 75 % Methanol in PBT enthält. Nach fünf Minuten auf dem Mischgerät saugen Sie vorsichtig das 75 %ige Methanol ab und füllen erneut mit 50 % Methanol in PBT auf. Fünf Minuten später.Ersetzen Sie das 50%ige Methanol durch 25%iges Methanol und PBT. Am Ende der letzten Inkubation vorsichtig das 25%ige Methanol in PBT abziehen und mit PBT auffüllen.Waschen Sie die Extremitätenhaut jeweils fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf dem Mutator-Mischer. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal. Achten Sie darauf, die Extremitätenhaut beim Austauschen der Lösungen nicht zu beschädigen.Nachdem die Hautproben der Gliedmaßen rehydriert wurden, blockieren Sie sie mit dem geeigneten Blockierpuffer. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei leichtem Mischen auf dem Nutschüttler bei Raumtemperatur. Nach zwei Stunden legen Sie die Hautproben der Gliedmaßen in eine 35 mal 10 Millimeter große Petrischale. Anschließend überführen Sie die Proben mit Ringzangen in ein 2-Milliliter-Falztube, das 800 Mikroliter primäre Antikörper in geeignetem Blockierpuffer enthalten. Hier können mehrere primäre Antikörper, die aus verschiedenen Arten stammen, gleichzeitig verwendet werden. Inkubieren Sie die Hautproben der Gliedmaßen unter leichtem Rühren im Mutator-Mischer bei vier Grad Celsius über Nacht. Am folgenden Tag legen Sie die Hautproben der Gliedmaßen in eine 35 mal 10 Millimeter große Petrischale. Überführen Sie die Proben anschließend in ein fünf Milliliter fassendes Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden, das vier Liter des geeigneten Waschpuffers enthält.Fünfmal jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf dem Mutator-Mischer waschen. Bei jeder Waschung vorsichtig den verwendeten Puffer durch frischen Puffer ersetzen. Die Sekundärantikörper vorbereiten, um aggregierte Partikel der Sekundärantikörper zu entfernen.Verwenden Sie einen Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,22-Mikron-PVDF-Membran, um die Sekundärantikörperlösung in ein 1,5-Milliliter-Fugegefäß zu filtrieren. Zentrifugieren Sie anschließend die filtrierte Probe bei 15.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Partikel und Luftblasen zu entfernen. Sammeln Sie die filtrierte Antikörperlösung in einem 2-Milliliter-Mikrofugegefäß.Nach den fünf Waschschritten legen Sie die Hautproben der Gliedmaßen auf eine 35 × 10 mm große Petrischale und überführen sie in ein 2-Liter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 800 µL sekundäre Antikörper in Blockierpuffer enthält. Unterschiedliche fluoreszenzmarkierte sekundäre Antikörper, die von verschiedenen Spezies stammen, können in diesem Schritt gleichzeitig verwendet werden. Inkubieren Sie die Gliedmaßenhautproben eine Stunde lang im Dunkeln bei sanfter Rotation auf dem Mutator-Mischer bei Raumtemperatur.Nach der einstündigen Inkubation legen Sie die Extremitätenhautproben auf eine 35 × 10 mm große Petrischale und überführen Sie sie in ein 5-ml-Polypropylen-Rundbodengefäß, das 4 ml des geeigneten Waschpuffers enthält. Waschen Sie die Proben fünfmal je 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf dem Tator-Mischer, um sie anschließend mittels konfokaler Mikroskopie abzubilden. Nach der immunhistochemischen Färbung müssen die Extremitätenhautproben auf einem Objektträger montiert werden.Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie die gefärbten Extremitätenhautproben auf eine 35 mal 10 Millimeter große Petrischale und arbeiten dabei unter einem Stereomikroskop mit schwacher Beleuchtung. Um eine starke Photoausbleichung zu vermeiden, verwenden Sie feine Pinzette, um Staubkristalle und Fasern von der inneren Schicht der Hautproben zu entfernen. Überführen Sie die Extremitätenhautproben auf einen haftenden Objektträger.Legen Sie die Hautproben mit der inneren Schicht nach oben auf den Objektträger, sodass sie der Deckglasseite zugewandt ist. Glätten Sie die Hautproben anschließend vorsichtig mit feinen Pinzetten. Entfernen Sie überschüssige Waschpufferlösung mit Kim-Wipes.Geben Sie Antifade-Mounting-Medium auf die Hautproben und legen Sie einen 25 mal 25 mm großen Deckgläser darauf. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuschließen, und lagern Sie die Proben zur Langzeitkonservierung in der Dunkelheit bei Raumtemperatur flach. Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack und lagern Sie es bei vier Grad Celsius.Die Musterbildung von Nerven und Blutgefäßen in der Mausbein-Haut bei E 15,5 wird anhand dieser repräsentativen Ergebnisse der dreifach markierten konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt: Der allgemeine endotheliale Zellmarker Pcam1 ist blau dargestellt. Der Neurofilament-Marker 2H3 ist grün, und der glatte Muskelzellen-Marker alpha-SMA ist rot. Diese Bilder zeigen ein charakteristisches Verzweigungsmuster von alpha-SMA-positiven Arterien, die durch weiße Pfeilspitzen gekennzeichnet sind und entlang der 2H3-positiven peripheren Nerven verlaufen, die durch offene Pfeile angezeigt werden, zusätzlich zur Verzweigung der Blutgefäße.Dieses Modell der Extremitätenhautgefäße kann auch die Musterbildung der Verzweigung lymphatischer Gefäße aufzeigen, wobei der Marker für lymphatische Endothelzellen, LYVE-1, in Rot und Neuropilin-2 in Grün dargestellt ist. Lymphatische Gefäße werden durch LYVE-1 und NRP-2 sichtbar gemacht, wobei LYVE-1 außerdem von einer Teilmenge der Makrophagen exprimiert wird, die durch die offenen Pfeilspitzen gekennzeichnet sind. Diese Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Gefäßbiologie neue Möglichkeiten, die komplexen Musterbildungs- und Differenzierungsprozesse der Gefäßbildung während der Gewebeentwicklung, der Gewebereparatur und bei Krankheitszuständen zu untersuchen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo.

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Wir präsentieren ein Protokoll für die Analyse der Herzkranzgefäße in ganzen embryonalen Maus-Herzen bis E15.5, durch optische Clearance und der konfokalen Mikroskopie, gefolgt von immunologischen Standard Färbemethoden verwendet wird. Diese Technik ermöglicht die Darstellung von Blutgefäßen während des gesamten Herzens ohne die Notwendigkeit für zeitaufwendige Analyse von Serienschnitten.

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Diese Arbeit zeigt einen neuartigen Ansatz zur Bewertung der Proliferations-, Differenzierungs- und Gefäßbildungspotenziale vaskulärer endothelialer Stammzellen (VESCs) durch Mamma-Fett-Pad-Transplantation, gefolgt von einer ganzheitlichen Gewebepräparation für die mikroskopische Beobachtung. Eine Abstammungsstrategie zur Untersuchung des Verhaltens von VESCs in vivo wird ebenfalls vorgestellt.

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Hier beschreiben wir ein hohe Auflösung vollständig-hängen bildgebende Verfahren in der gesamten erwachsenen Maus Ohr Haut, die was uns ermöglicht, verzweigte Morphogenese und Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie Immunzelle Verteilung zu visualisieren.

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Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

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Dieses Protokoll stellt eine schnelle Methode für die quantitative dreidimensionale Gefäßbildgebung mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Wirksamkeit der Methode wird anhand des pharyngealen Bogenarteriensystems des Hühnerembryomodells demonstriert, wobei die hämodynamischen Kräfte mittels Computational Fluid Dynamics quantifiziert werden.

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Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie (Video) | JoVE Journal

Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

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