Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Wir stellen Ihnen eine ganze-mount Immunhistochemie und konfokaler mit mehreren Kennzeichnung für die Analyse von komplizierten Gefäßnetz Bildung in embryonalen Maus Gliedmaßen Haut.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung einer immunhistochemischen Analyse des gesamten Mount zur Darstellung des gesamten Gefäßsystems in der sich entwickelnden Gliedmaßenhaut. Dies wird erreicht, indem zuerst vier Gliedmaßen aus dem Embryo geschnitten, die vier Gliedmaßen in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und dann in 100 % Methanol dehydriert werden. Der zweite Schritt besteht darin, mit einer feinen Pinzette die Haut an der Basis der Gliedmaße abzuziehen.

Folgen Sie den blauen gestrichelten Linien und schälen Sie die Haut in einer Schale mit 100 % Methanol ab. Entferne die Haut von der Gliedmaße. Anschließend erfolgt eine immunhistochemische Färbung mit gefäßspezifischen Primärantikörpern und fluoreszierenden Sekundärantikörpern auf der Haut der Gliedmaßen.

Schließlich ermöglicht die konfokale Ganzkörpermikroskopie mit Mehrfachmarkierung eine robuste Bildgebung des gesamten Gefäßsystems der Gliedmaßenhaut, was gegenüber bestehenden Methoden wie der Histologieanalyse mit Kreuzzählung von Vorteil sein kann. Die Verwendung der Embryonensektion ist die immunhistochemische Analyse der Gefäße der Gliedmaßen ermöglicht es uns nicht nur, das gesamte Gefäßsystem, einschließlich der Zellkomponenten, abzubilden, sondern auch die Prozesse der Differenzierung und der Musterbildung von Blutgefäßzellen und der Verzweigung der Lymphgefäße zu untersuchen. Demonstrieren wir das Verfahren zusammen mit dem gewundenen DA-Postdoc aus meinem Labor, werden embryonale Gliedmaßenhäute von trächtigen weiblichen Mäusen gesammelt.

Nachdem Sie die Gebärmutter entnommen und gewaschen haben, arbeiten Sie unter einem Präpariermikroskop, um die Embryonen zu trennen und zu präparieren. Nachdem die Embryonen präpariert wurden, besteht der nächste Schritt darin, die vier LIMS mit einer feinen Pinzette aus den Embryonen zu entfernen. Schneiden Sie die vier Lims an der Schulter ab und übertragen Sie sie dann mit einer Ringzange auf eine 24-Well-Platte mit Eis.

Kaltes, frisches 4%Paraform Hyde in PBS geben zwei vier LIMS pro Vertiefung in zwei Milliliter 4%PFA. Fixieren Sie die vier Gliedmaßen mit leichtem Mischen auf einem Mutatormischer bei vier Grad Celsius über Nacht am Folgetag. Entfernen Sie das PFA aus jeder Vertiefung und fügen Sie zwei Milliliter PBS hinzu.

Waschen Sie die Proben fünf Minuten lang unter sanftem Mischen auf dem Mutatormischer bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diese Wäsche zweimal für insgesamt drei Wäschen. Als nächstes werden die vier Gliedmaßen in ein fünf Milliliter Polypropylen-Rundbodenröhrchen mit 100 % Methanol umgefüllt und bei minus 20 Grad Celsius in einem Enzymgefrierschrank mit kritischer Temperaturkontrolle und ohne automatische Auftaufunktion gelagert. Nach der Lagerung über Nacht und den minus 20 Grad Celsius kann die Haut vom Fallen abgezogen werden.

Dies ist einer der kritischsten Aspekte dieses Verfahrens, da der Erfolg der anschließenden Färbung und Bildgebung davon abhängt, dass die Haut nicht beschädigt wird. Die Haut der Gliedmaßen löst sich leicht von der Gliedmaße, wenn sie auf diese Weise dehydriert wird, um die Haut von den vier Gliedmaßen abzulösen. Platzieren Sie zuerst die Gliedmaße mit der Bauchseite nach oben.

Schneiden Sie dann mit einer feinen Pinzette in einer geraden Linie durch die Haut in der Nähe der Basis des Gliedes in Richtung Pfote. Präpariere als Nächstes das gesamte Glied und schäle die Haut ab, während du das Glied drehst. Sobald die Häute abgezogen sind.

Die vier Gliedmaßen beginnen mit der immunhistochemischen Färbung der Gliedmaßenhäute und bereiten sich vorher vor. Drei vorrätige 50-Milliliter-Tuben mit 75%50%und 25%Methanol in PBT zur Rehydrierung. Die Häute, die Häute der Gliedmaßen, werden rehydriert, indem eine geriebene Reihe von Methanol von der höchsten bis zur niedrigsten Methanolkonzentration jeweils fünf Minuten lang inkubiert wird.

Zu Beginn wird die Haut der Gliedmaßen in ein Fünf-Milliliter-Polypropylen-Rundbodenröhrchen mit 75 % PBT übertragen. Nach fünf Minuten auf dem Mutatormischer wird das 75%ige Methanol vorsichtig abgesaugt und mit 50%Methanol und PBT nachgefüllt. Fünf Minuten später.

Ersetzen Sie 50 % Methanol durch 25 % Methanol und PBT. Am Ende der letzten Inkubation. Aspirieren Sie vorsichtig das 25%ige Methanol PBT und füllen Sie es mit PBT auf.

Waschen Sie die Gliedmaßenhäute fünf Minuten lang unter leichtem Mischen auf dem Mutatormischer bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal. Achten Sie darauf, die Haut der Gliedmaßen während des Lösungswechsels nicht zu beschädigen.

Sobald die Haut der Gliedmaßen rehydriert wurde, blockieren Sie sie mit dem entsprechenden Blockierungspuffer. Zwei Stunden unter schonendem Mischen auf dem Nussmischer bei Raumtemperatur inkubieren Nach zwei Stunden legen Sie die Gliedmaßenhäute auf eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale. Dann werden die Häute mit einer Ringzange in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit 800 Mikrolitern Primärantikörpern überführt, die in dem entsprechenden Blockierungspuffer verdünnt sind.

Dabei können mehrere Primärantikörper aus verschiedenen Spezies gleichzeitig verwendet werden. Inkubieren Sie die Häute der Gliedmaßen durch sanftes Mischen auf dem Mutatormischer bei vier Grad Celsius über Nacht über Nacht, legen Sie die Häute der Gliedmaßen auf eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale. Füllen Sie die Häute in ein fünf Milliliter Polypropylen-Rundbodenröhrchen mit vier Litern des entsprechenden Waschpuffers.

Waschen Sie fünfmal für jeweils 15 Minuten unter sanftem Mischen auf dem Mutatormischer bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie den verbrauchten Puffer bei jeder Wäsche während der Wäschen vorsichtig durch einen neuen. Bereiten Sie die Sekundärantikörper vor, um aggregierte Partikel der Sekundärantikörper zu entfernen.

Verwenden Sie einen 0,22-Mikron-PVDF-Membranspritzenfilter, um die sekundäre Antikörperlösung in ein 1,5-Milliliter-Fuge-Röhrchen zu filtrieren. Zentrifugieren Sie dann die gefilterte Probe 10 Minuten lang bei 15.000 U/min bei vier Grad Celsius, um Partikel und Luftblasen zu entfernen. Sammeln Sie die filtrierte Antikörperlösung in einem zwei Milliliter Mikrofuge-Röhrchen.

Wenn die fünf Wäschen abgeschlossen sind, legen Sie die Häute der Gliedmaßen auf eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale und geben Sie sie in ein Zwei-Liter-Mikrofuge-Röhrchen, das 800 Mikroliter Sekundärantikörper im Blockierungspuffer enthält. In diesem Schritt können verschiedene fluoreszierende konjugierte Sekundärantikörper, die von verschiedenen Spezies stammen, gleichzeitig verwendet werden. Inkubieren Sie die Gliedmaßen und Häute eine Stunde lang im Dunkeln mit sanftem Mischen auf dem Mutatormischer bei Raumtemperatur.

Nach der einstündigen Inkubation legen Sie die Häute der Gliedmaßen auf eine 35 mal 10 Millimeter große Petrischale und geben sie in ein fünf Milliliter Polypropylen-Rundbodenröhrchen, das vier Milliliter des entsprechenden Waschpuffers enthält. Waschen Sie fünfmal für jeweils 15 Minuten im Dunkeln mit sanftem Mischen auf dem Tator-Mischer bei Raumtemperatur für die Bildgebung durch konfokale Mikroskopie. Die Häute der Gliedmaßen müssen nach der immunhistochemischen Färbung auf einen Objektträger montiert werden.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, legen Sie die gefärbten Gliedmaßenhäute auf eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale und arbeiten Sie unter einem Stereomikroskop bei schwacher Beleuchtung. Um ein großflächiges Ausbleichen zu vermeiden, entfernen Sie mit einer feinen Pinzette Staubkristalle und Fasern von der inneren Schicht der Häute. Übertragen Sie die Häute der Gliedmaßen auf einen selbstklebenden Objektträger.

Legen Sie die Felle mit der inneren Schicht nach oben liegend auf die Rutsche mit Blick auf den Deckglas. Anschließend die Häute mit einer feinen Pinzette vorsichtig flach drücken. Entfernen Sie den Übertrags-Waschpuffer mit dem Kim-Tuch.

Geben Sie Antifa-Eindeckmittel auf die Häute und legen Sie einen 25 x 25 großen Deckzettel auf die Proben. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingebracht werden, härten Sie auf einer ebenen Fläche im Dunkeln bei Raumtemperatur aus, um die Proben langfristig zu lagern. Verschließen Sie den Deckglas mit Nagellack auf dem Objektträger und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius.

Die Musterung von Nerven und Blutgefäßen in der Maus für die Haut der Gliedmaßen bei E 15,5 wird durch diese repräsentativen Ergebnisse der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie des gesamten Mounts mit drei Markierungen gezeigt: Immunfluoreszenz des Pan-Endothelzellmarkers pcam eins ist blau. Der Neurofilament-Marker zwei H drei ist grün und der Marker der glatten Muskelzelle alpha SMA ist rot. Diese Bilder zeigten ein charakteristisches Verzweigungsmuster von Alpha-SMA-positiven Arterien, die durch eine weiße Pfeilspitze gekennzeichnet sind, die mit zwei peripheren H-Nerven ausgerichtet ist, die durch offene Pfeile gekennzeichnet sind, zusätzlich zu den Blutgefäßverzweigungen.

Dieses Gefäßmodell der Gliedmaßenhaut kann auch die Musterung der Verzweigung von Lymphgefäßen unter Verwendung des lymphatischen Endothelzellmarkers LYVE zeigen, der in rot und die Neuropille in zwei grün dargestellten Lymphgefäße werden sowohl durch LYV eins als auch durch NRP zwei visualisiert, während LYV eins auch durch eine Untergruppe von Makrophagen exprimiert wird, die durch die offenen Pfeilspitzen angezeigt werden. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Gefäßbiologie den Weg, um die komplexe Musterbildung und die Differenzierungsprozesse des Gefäßsystems während der Gewebeentwicklung, der Gewebereparatur und bei Krankheitszuständen zu erforschen.