Assoziierte Chromosome-Trap zur Identifizierung weiträumige DNA-Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, mit großer Reichweite assoziierte DNA-Partner zu entdecken und zu identifizieren. Dies wird durch Fixierung, Zelllyse und Verdauung der DNA durch das erste Restriktionsenzym erreicht, gefolgt von einer Ligation, um eine chimäre DNA zu erzeugen, die aus Segmenten der beiden assoziierten Gene besteht. Als nächstes werden Linker nach dem zweiten Restriktionsverdau zur chimären DNA hinzugefügt. Um die Amplifikation zu erleichtern, wird dann die PCR-Amplifikation unter Verwendung von Linker- und Köder-DNA-spezifischen Primern durchgeführt, um ausreichende Mengen der assoziierten DNA-Fragmente zu erhalten. Es werden Ergebnisse erhalten, die die mit großer Reichweite assoziierten DNA-Partner mit der Köder-DNA auf der Grundlage der Sequenzanalyse der amplifizierten DNA-Fragmente zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Chromosomenbestätigungserfassung oder drei C besteht darin, dass A-C-T-S-A verwendet werden kann, um einen unbekannten DNA-Partner mit großer Reichweite effektiv zu identifizieren. Während drei C für die Verifizierung nur bisher vermuteter Wechselwirkungen auftraten. Um dieses Protokoll zu kultivieren, werden menschliche Zellen in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius versorgt, bis sie zu 80 bis 90 % konfluent sind.

Für diese Demonstration werden humane Zellen der sauren Leukämie verwendet. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie in ein 50-Milliliter-NOC-Röhrchen gießen und 15 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren wird das Medium durch Aspiration entfernt.

Fügen Sie fünf Milliliter Kulturmedium hinzu, um die Zellpellets wieder zu suspendieren. Nach der Zählung der Zellen mit einem Hämozytometer nehmen Sie etwa einmal 10 zu den siebten Zellen auf ein Volumen von 40 Millilitern mit RPMI 1640, Medium mit 10%FBS. Fügen Sie dann 1,7 Milliliter 37%iges Formaldehyd hinzu, um das verdünnte Chromatin zu fixieren.

Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Nach der Inkubation wird die Reaktion mit 2,4 Millilitern Glycin mit zwei molaren Glycinen abgeschreckt. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend 15 Minuten lang bei 1200 U/min und vier Grad Celsius.

Nach dem Entfernen des Supernatins waschen Sie das Pellet einmal mit 40 Millilitern eiskaltem PBS, zentrifugieren Sie dann die Probe, um das gewaschene Zellpellet zu gewinnen, resuspendieren Sie das resultierende Pellet in 40 Millilitern eiskaltem Lysepuffer mit frisch zugesetzten Proteaseinhibitoren und 0,1 Millimolar PMSF, inkubieren Sie die Probe in einem Kühlraum mit Rotation für 90 Minuten. Zum Schluss zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 2.500 U/min, entfernen das Super-Natin und erhalten die isolierten Zellkerne. Suspendieren Sie die Kerne in 0,5 Millilitern eines XNEB-Puffers drei und fügen Sie 15 Mikroliter 10% SDS hinzu.

Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Fügen Sie dann 45 Mikroliter 20%Triton X 100 hinzu, um das SDS zu sequestrieren, und inkubieren Sie erneut bei 37 Grad Celsius für eine Stunde unter Schütteln und Aliquot von eins mal 10 bis zum sechsten. Die Zellkerne oder etwa 15 Mikrogramm werden für den Verdau des Restriktionsenzyms auf 55 Mikroliter Kernlösung verwendet.

Fügen Sie 433 Mikroliter eines XNEB-Puffers drei und 12 Mikroliter BGL zwei hinzu. Um ein Gesamtvolumen der Aufschlussreaktion von 500 Litern zu erhalten, wird die Reaktion über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Am nächsten Tag inaktivieren Sie das Restriktionsenzym durch Zugabe von 95 Mikrolitern 10%SDS und denaturieren das Enzym durch Erhitzen auf 65 Grad Celsius für 20 Minuten.

In einem Wasserbad sieben Milliliter eines x Ligationspuffers und 360 Mikroliter 20% Triton X 100 hinzufügen. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Senken Sie die Temperatur auf 16 Grad Celsius und fügen Sie 50 Mikroliter zu 400 Einheiten pro Mikroliter hinzu.

T vier DNA Ligase. Lassen Sie die Ligationsreaktion vier Stunden lang bei 16 Grad Celsius und dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem die Ligation abgeschlossen ist, fügen Sie 300 Mikrogramm Proteinase K hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 65 Grad Celsius.

Fügen Sie dann fünf Mikrogramm RNAA hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Reinigen Sie die DNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion und fällen Sie die DNA in Isopropanol auf, lösen Sie die gefällte DNA in 150 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser auf. Um der chimären DNA Linker hinzuzufügen, verdauen Sie zuerst die DNA, indem Sie zwei Mikrogramm gereinigter DNA mit fünf Einheiten msp inkubieren, eine bei 37 Grad Celsius für vier bis sechs Stunden nach dem Verdau, inaktivieren Sie MSP eins bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten.

Dann fällt man die DNA in Ethanol mit einem Mikroliter von fünf Milligramm pro Milliliter aus. Glykogen löst den resultierenden DNA-Gaumen in 50 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser auf. Mischen Sie als nächstes 50 Mikroliter MSP, eine behandelte DNA, mit zwei Mikrolitern eines 20-mikromolaren Linker-Oligonukleotids L und einem Mikroliter eines 20-mikromolaren Oligonukleotids S, fügen Sie dann einen Mikroliter steriles destilliertes Wasser und sechs Mikroliter 10 XT-Vier-DNA-Ligase-Puffer hinzu.

Bedecke die Mischung mit flüssigem Wachs. Denaturieren Sie die Oligonukleotide bei 50 Grad Celsius für eine Minute und lassen Sie sie in einem Gradienten von 0,5 Grad Celsius pro Minute allmählich auf 10 Grad Celsius abkühlen. Fügen Sie mit einem Thermocycler einen Mikroliter mit 400 Einheiten pro Mikroliter T-Vier-DNA-Ligase hinzu und inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 15 Grad Celsius.

Am nächsten Tag reinigen Sie die Linker-ligierte DNA mit einem Kaya-Schnell-PCR-Aufreinigungskit und eluieren Sie sie in 50 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser. Sie wählen einen Primer für die spezifische Region der DNA aus, die auf weitreichende Wechselwirkungen untersucht werden soll. In diesem Beispiel wird Abel als Primer oder Köder verwendet.

Die gereinigte DNA wird für die PCR-Runde der ersten Runde vorbereitet, indem ein Mikroliter der gereinigten DNA mit einem Mikroliter mit 20 mikromolaren Primern, einem spezifischen Primer, 46 56, und einem Mikroliter mit einem 20 mikromolaren Linker-spezifischen Primer 29 63 kombiniert wird. Fügen Sie dann drei Mikroliter von drei x ClinTech, DNA-Polymerase, einen Cocktail hinzu, der zuvor gemäß dem schriftlichen Protokoll mit 32 P-D-C-T-P gemischt wurde, gefolgt von drei Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser. Führen Sie die PCR-Amplifikation mit dem im schriftlichen Protokoll beschriebenen Heißstart-PCR-Thermozyklus durch, nachdem der PCR-Zyklus abgeschlossen ist.

Reinigen Sie die PCR-Produkte der ersten Runde mit einem Kaya Quick PCR Aufreinigungskit Elue in 30 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser. Verwenden Sie einen Mikroliter des ersten PCR-Produkts, das 100-mal verdünnt ist, um eine zweite PCR-Runde mit verschachtelten Primern durchzuführen, indem Sie einen Mikroliter mit 20 mikromolaren Primern, einen spezifischen Primer, 46, 26, und einen Mikroliter mit einem 20-mikromolaren Linker-spezifischen Primer hinzufügen. 29 61.

Fügen Sie erneut drei Mikroliter von drei x ClinTech, DNA-Polymerase, einen Cocktail und drei Mikroliter steriles destilliertes Wasser hinzu. Führen Sie die zweite PCR-Runde mit einem Temperaturzyklusplan von 25 Zyklen bei 95 Grad Celsius für 20 Sekunden durch. 67 Grad Celsius für 40 Sekunden und 72 Grad Celsius für eine Minute, gefolgt von einer Verlängerung auf 72 Grad Celsius für fünf Minuten.

Visualisieren Sie die PCR-Produkte, indem Sie ein 5%-Harnstoff-Seitengel ausführen lassen und dann den belichteten Bildschirm in einem Phospho-Imager scannen. Jede PCR-Bande kann aus dem Gel recycelt werden, indem die Gelstreifen in einem Einor-Röhrchen mit 60 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser aufgelöst und fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius inkubiert werden. Zentrifuge. Die gelösten Gelprodukte werden 10 Sekunden lang kurz bei 10.000 U/min abgeführt.

Um alle Proben zu sammeln. Entfernen Sie einen Mikroliter, um ihn als DNA-Template für die Durchführung der PCR mit der Prime-Reparatur zu verwenden. 29 61 46 26.

Unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben kann nach der Aufreinigung und Sequenzierung eine Analyse mit einem Online-Tool durchgeführt werden, um die Chromosomenposition zu bestimmen. Sobald Sie sich auf der Genom-Bioinformatik-Website befinden, klicken Sie auf blatt, um ein neues Fenster zu generieren, und fügen Sie die DNA-Sequenz ein. Nach dem Absenden der DNA-Sequenz erscheinen die BLATT-Suchergebnisse.

Klicken Sie im Browser auf den Treffer mit 100%identity, um den Standort der DNA-Sequenz anzuzeigen. Die able one Region wurde als Köder verwendet, um ihre weitreichenden DNA-Wechselwirkungen zu bestimmen. In der zweiten Runde des PCR-Primer-Sets wurden zwei BGL-Stellen mit zwei und eine BAM H-Stelle mit einer Stelle für den A-CT-Assay ausgewählt, 46, 26, 29, 61 wurde für die Amplifikation von fähigem M1 verwendet, 46,30, 29 61 wurde für able M zwei und 46, 36, 29, 61 wurde für able M drei verwendet.

Ein typisches Gelmuster zeigt eine bis mehrere Banden, wie hier für fähiges M1, fähiges M zwei und fähiges M drei gezeigt wird. Es wird gezeigt, dass die DNA-Sequenz des klonierfähigen M1 zeigt, dass jedes Fragment aus einem A-CT-Assay aus zwei kombinierten DNA-Segmenten besteht. Ein Segment stammt aus der DNA-Region des Köders, während das zweite Segment vom assoziierten Partner stammt.

Die Segmente sind durch die erste Restriktionsenzym-Erkennungssequenz miteinander verbunden. Die zweite Enzymerkennungssequenz erscheint am Ende der zugehörigen Partnersequenz. Das klonierte able M1-Fragment enthält DNA aus der Region von ABLE eins, die sich auf Chromosom neun Q 32.4 befindet, und der assoziierte Partner befindet sich auf Chromosom drei P drei, das als Proc zwei identifiziert wurde.

In ähnlicher Weise war der able M zwei assoziierte Partner auf Chromosom fünf Q 21.1 lokalisiert, während klonierbarer M drei als intrachromosomale Assoziation in der Nähe des ABLE one Locus im Gegensatz zu drei C-Assays identifiziert wurde. Die in diesem Video beschriebene Methodik wird für die am weitesten verbreiteten Interaktionen über große Entfernungen ausgewählt. Durch die Erhöhung der Anzahl der PCR-R-Zyklen ist es jedoch möglich, auch zusätzliche, weniger häufige Assoziationen zu identifizieren, indem die Imprinting- und Kontrollregion (ICR) am IGF zwei H 19-Locus als Köder-DNA in Maus-Fiberblastenzellen verwendet wird. In der ersten und zweiten PCR-Runde im A-CT-Assay wurden unterschiedliche Cycling-Programme angewendet.

Der A-CT-Assay kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der Kernarchitektur und weitreichende Wechselwirkungen zwischen normalen Zellen und Krebszellen zu identifizieren. Normales Dickdarmgewebe und Dickdarmkrebsgewebe wurden homogenisiert und der A-CT-Assay wurde gemäß den hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt. Hier ist die DNA-Struktur der ICR-Region am IGF zwei H 19 Locus und dem IGF zwei Gen dpn zu sehen.

Zwei Stellen für den A-CT-Assay sind markiert: Primer, die in der zweiten PCR-Runde verwendet werden, sind durch Pfeile und Zahlen in verschiedenen Farben gekennzeichnet. Das Gelmuster des A-CT-Assays stellt die PCR-Ergebnisse unter Verwendung des Primers 29, 61, 41, 41, 63, 51, 45 und 51 51 dar. Einzigartige Banden, die nur in normalem Dickdarmgewebe vorkommen, sind mit gelben Pfeilen gekennzeichnet, und die Banden, die nur in Darmkrebsgewebe auftraten, sind nach seiner Entwicklung mit roten Pfeilen gekennzeichnet.

Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Marktbiologie den Weg, die Kernarchitektur und die Genregulation auf dreidimensionale Weise zu erforschen.