Assoziierte Chromosome-Trap zur Identifizierung weiträumige DNA-Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, langreichweitig assoziierte DNA-Partner zu entdecken und zu identifizieren. Dies wird erreicht durch Fixierung, Zelllyse und Verdau der DNA mit dem ersten Restriktionsenzym, gefolgt von einer Ligierung, um eine chimäre DNA zu erzeugen, die aus Segmenten der beiden assoziierten Gene besteht. Anschließend werden nach dem zweiten Restriktionsverdau Linker an die chimäre DNA angefügt, um deren Amplifikation zu erleichtern. Danach erfolgt die PCR-Amplifikation unter Verwendung von Linker- und gezielt auf die „bait“-DNA spezifischen Primern, um ausreichende Mengen der assoziierten DNA-Fragmente zu erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die langreichweitig assoziierten DNA-Partner der „bait“-DNA auf Grundlage der Sequenzanalyse der amplifizierten DNA-Fragmente.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Chromosomenkonformations-Aufnahme oder Three-C besteht darin, dass A-C-T-S-A verwendet werden kann, um einen unbekannten, langreichweitig assoziierten DNA-Partner effektiv zu identifizieren, während Three-C zur Überprüfung ausschließlich zuvor vermuteter Interaktionen diente. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie humane Zellen in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C kultivieren, bis sie 80 bis 90 % konfluent sind.

Menschliche promyelozytäre Leukämiezellen werden für diese Demonstration verwendet. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie in ein 50-Milliliter-NOC-Gefäß gießen, und zentrifugieren Sie sie 15 Minuten bei 1200 U/min. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Medium durch Absaugen.

Geben Sie fünf Milliliter Kulturmedium hinzu, um die Zellpellets aufzuschwemmen. Nach der Bestimmung der Zellzahl mit einem Hämozytometer überführen Sie etwa eine mal 10 hoch sieben Zellen in ein Volumen von 40 Milliliter RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS. Fügen Sie anschließend 1,7 Milliliter 37 % Formaldehyd hinzu, um das verdünnte Chromatin zu fixieren.

Die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation die Reaktion mit 2,4 Milliliter zwei molarer Glycinlösung abbrechen. Anschließend die Probe 15 Minuten bei 1200 U/min und vier Grad Celsius zentrifugieren.

Nachdem Sie das Überstand entfernt haben, waschen Sie das Pellet einmal mit 40 Milliliter eiskaltem PBS, zentrifugieren Sie die Probe, um das gewaschene Zellpellet zu gewinnen, und resuspendieren Sie das resultierende Pellet in 40 Milliliter eiskaltem Lysepuffer mit frisch zugesetzten Proteaseinhibitoren und 0,1 Millimolar PMSF. Inkubieren Sie die Probe 90 Minuten lang bei 4 °C unter Rühren. Zentrifugieren Sie abschließend die Probe bei 2.500 U/min für 15 Minuten, entfernen Sie den Überstand und gewinnen Sie die isolierten Kerne. Resuspendieren Sie die Kerne in 0,5 Milliliter 1× NEB-Puffer 3 und geben Sie 15 Mikroliter 10 %iges SDS hinzu.

Die Probe für eine Stunde bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Anschließend 45 Mikroliter 20 % Triton X-100 hinzufügen, um das SDS abzufangen, und erneut für eine Stunde bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren sowie einen Aliquot von ein mal 10 hoch 6 verwenden. Die Kerne oder etwa 15 Mikrogramm werden für die Restriktionsenzymverdauung in 55 Mikroliter Kernlösung verwendet.

Fügen Sie 433 µL eines XNEB-Puffers drei und 12 µL BGL zwei hinzu, um ein Gesamtvolumen der Verdauungsreaktion von 500 µL zu erhalten. Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 37 °C. Inaktivieren Sie am nächsten Tag das Restriktionsenzym durch Zugabe von 95 µL 10 %iger SDS-Lösung und denaturieren Sie das Enzym durch 20-minütiges Erhitzen auf 65 °C.

In einem Wasserbad sieben Milliliter 1x Ligationspuffer und 360 Mikroliter 20 % Triton X-100 hinzufügen. Die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Temperatur auf 16 Grad Celsius senken und 50 Mikroliter 400 Einheiten pro Mikroliter hinzufügen.

T vier DNA-Ligase. Lassen Sie die Ligationsreaktion vier Stunden bei 16 Grad Celsius inkubieren und anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Abschluss der Ligation 300 Mikrogramm Proteinase K hinzufügen und über Nacht bei 65 Grad Celsius inkubieren.

Fügen Sie dann fünf Mikrogramm RNAA hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Reinigen Sie die DNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion und präzipitieren Sie die DNA in Isopropanol; lösen Sie die präzipitierte DNA in 150 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser auf. Um Linker an die chimäre DNA anzufügen, verdauen Sie zunächst die DNA, indem Sie zwei Mikrogramm gereinigte DNA mit fünf Einheiten Msp1 bei 37 Grad Celsius vier bis sechs Stunden lang inkubieren. Nach dem Verdau inaktivieren Sie Msp1 bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten.

Anschießend präzipitieren Sie die DNA in Ethanol mit einem Mikroliter einer Lösung mit fünf Milligramm pro Milliliter. Glykogen lösen Sie das resultierende DNA-Pellet in 50 Mikrolitern sterilisiertem destilliertem Wasser auf. Mischen Sie danach 50 Mikroliter MSP1-behandelter DNA mit zwei Mikrolitern eines 20-Mikromolar-Linker-Oligonukleotids L und einem Mikroliter eines 20-Mikromolar-Oligonukleotids S, geben Sie dann einen Mikroliter sterilisiertes destilliertes Wasser und sechs Mikroliter 10×T4-DNA-Ligase-Puffer hinzu.

Bedecken Sie die Mischung mit flüssigem Wachs. Denaturieren Sie die Oligonukleotide bei 50 Grad Celsius für eine Minute und lassen Sie sie allmählich in einem Gefälle von 0,5 Grad Celsius pro Minute auf 10 Grad Celsius abkühlen. Geben Sie mithilfe eines Thermocyclers ein Mikroliter einer 400 Einheiten pro Mikroliter T4-DNA-Ligase hinzu und inkubieren Sie die Reaktion bei 15 Grad Celsius über Nacht.

Am nächsten Tag reinigen Sie die mit dem Linker ligierte DNA unter Verwendung eines Kaya-Schnell-PCR-Reinigungskits und eluieren in 50 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser. Anschließend wählen Sie ein Primer für den spezifischen DNA-Bereich aus, der auf langreichweitige Wechselwirkungen untersucht werden soll. In diesem Beispiel wird Abel als Primer oder als Köder verwendet.

Bereiten Sie die gereinigte DNA für die erste PCR-Runde vor, indem Sie ein Mikroliter der gereinigten DNA mit einem Mikroliter eines 20-Mikromolar-Able-One-spezifischen Primers, 46 56, und einem Mikroliter eines 20-Mikromolar-Linker-spezifischen Primers, 29 63, mischen. Fügen Sie anschließend drei Mikroliter einer dreifachen ClinTech-DNA-Polymerase-Cocktailmischung hinzu, die zuvor gemäß dem schriftlichen Protokoll mit 32 P-D-C-T-P versetzt wurde, gefolgt von drei Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser. Führen Sie die PCR-Amplifikation unter Verwendung des im schriftlichen Protokoll beschriebenen Hot-Start-PCR-Thermocycling-Programms durch, nachdem der PCR-Zyklus abgeschlossen ist.

Reinigen Sie die PCR-Produkte der ersten Runde mithilfe eines Kaya-Quick-PCR-Reinigungskits. Eluieren Sie in 30 Mikroliter sterilem destilliertem Wasser. Verwenden Sie ein Mikroliter des ersten PCR-Produkts, 100-fach verdünnt, um eine zweite PCR-Runde mit nested Primern durchzuführen, indem Sie ein Mikroliter 20-Mikromolar-löslichen spezifischen Primer Able One 46 26 und ein Mikroliter 20-Mikromolar-löslichen linkerspezifischen Primer 29 61 hinzufügen.

Fügen Sie erneut drei Mikroliter dreifach konzentriertes ClinTech, DNA-Polymerase, einen Cocktail und drei Mikroliter sterilem destilliertem Wasser hinzu. Führen Sie die zweite Runde der PCR unter Verwendung eines thermischen Zyklenprogramms mit 25 Zyklen von 95 °C für 20 Sekunden, 67 °C für 40 Sekunden und 72 °C für eine Minute durch, gefolgt von einer Verlängerung bei 72 °C für fünf Minuten.

Visualisieren Sie die PCR-Produkte, indem Sie ein 5 %igen Harnstoff-Page-Gel laufen lassen und anschließend den belichteten Screen in einem Phospho-Imager scannen. Jedes PCR-Band kann aus dem Gel zurückgewonnen werden, indem die Gel-Streifen in einem Eppendorf-Röhrchen mit 60 µL sterilem destilliertem Wasser aufgelöst und fünf Minuten bei 95 °C inkubiert werden. Zentrifugieren Sie die aufgelösten Gel-Produkte kurz bei 10.000 U/min für 10 Sekunden.

Um alle Proben zu sammeln. Entnehmen Sie einen Mikroliter, um ihn als DNA-Vorlage für die Durchführung der PCR mit dem Prime Repair 29 61 46 26 zu verwenden.

Unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie oben beschrieben können nach der Reinigung und Sequenzanalyse mit einem Online-Tool die chromosomale Lokalisation bestimmt werden. Sobald Sie sich auf der bioinformatischen Genomwebsite befinden, klicken Sie auf blatt, um ein neues Fenster zu öffnen, und fügen Sie die DNA-Sequenz ein. Nachdem die DNA-Sequenz übermittelt wurde, werden die BLATT-Suchergebnisse angezeigt.

Klicken Sie im Browser auf den Treffer mit 100 % Identität, um die Position der DNA-Sequenz aufzudecken. Der auffindbare Bereich wurde als Köder verwendet, um seine langreichweitigen DNA-Interaktionen zu bestimmen. Zwei BGL2-Stellen und eine BAMH1-Stelle wurden für den A CT-Assay in der zweiten Runde des PCR-Primer-Sets ausgewählt; 46 26 29 61 wurde verwendet, um able M1 zu amplifizieren; 46 30 29 61 wurde für able M2 verwendet und 46 36 29 61 für able M3.

Ein typisches Gelelektrophoresemuster zeigt ein bis mehrere Banden, wie hier für able M1, able M2 und able M3 dargestellt. Die DNA-Sequenz des Klon able M1 wird gezeigt, um zu demonstrieren, dass jedes Fragment aus einem A CT-Assay aus zwei kombinierten DNA-Abschnitten besteht. Ein Abschnitt stammt aus der Bait-DNA-Region, während der zweite Abschnitt vom assoziierten Partner stammt.

Die Segmente werden über die erste Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme miteinander verbunden. Die Erkennungssequenz für das zweite Enzym erscheint am Ende der zugehörigen Partnersequenz. Das klonierbare M1-Fragment enthält DNA aus dem Bereich von ABLE eins, das auf Chromosom neun Q 32,4 lokalisiert ist, und der zugehörige Partner befindet sich auf Chromosom drei P drei, der als proc zwei identifiziert wurde.

Ebenso wurde der assoziierte Partner Able M zwei auf Chromosom fünf Q 21.1 lokalisiert, während das Klon Able M drei als intrachromosomale Assoziation in der Nähe des Able-eins-Lokus im Gegensatz zu den 3C-Assays identifiziert wurde. Die in diesem Video beschriebene Methodik ermöglicht die Selektion der am häufigsten vorkommenden langreichweitigen Interaktionen. Durch Erhöhung der Anzahl der PCR-Zyklen ist es jedoch ebenfalls möglich, zusätzliche, seltener auftretende Assoziationen nachzuweisen. Hierzu wurde als Köder-DNA im Maus-Fibroblasten-Zellmodell die Imprinting- und Kontrollregion oder ICR am IGF2-H19-Lokus verwendet, wobei unterschiedliche Zyklenprogramme in der ersten und zweiten Runde der PCR im ACT-Assay angewandt wurden.

Mit dem A-CT-Assay können auch Unterschiede in der nukleären Architektur und in langreichweitigen Wechselwirkungen zwischen normalen Zellen und Krebszellen nachgewiesen werden. Normales Kolon-Gewebe und Kolon-Krebs-Gewebe wurden homogenisiert, und der A-CT-Assay wurde gemäß den hier beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dargestellt ist hier die DNA-Struktur der ICR-Region am IGF2-H19-Lokus und des IGF2-Gens dpn.

Zwei Stellen für den A-CT-Assay, an denen die Primer verwendet werden, die in der zweiten PCR-Runde eingesetzt werden, sind durch Pfeile und Zahlen in verschiedenen Farben markiert. Das Gelelektrophoresemuster des A-CT-Assays zeigt die PCR-Ergebnisse unter Verwendung des Primers 29 61 in Kombination mit den Primer-Paaren 41/61, 41/63, 51/45 und 51/51. Einzigartige Banden, die ausschließlich in normalem Kolon-Gewebe auftreten, sind mit gelben Pfeilen gekennzeichnet, während Banden, die nur in kolorektalem Krebsgewebe auftreten, mit roten Pfeilen markiert sind, nachdem der Assay etabliert wurde.

Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Marktbiologie den Weg, um die nukleäre Architektur und die Genregulation auf dreidimensionale Weise zu untersuchen.