Name: Assoziierte Chromosome-Trap zur Identifizierung weiträumige DNA-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Erfahren Sie die ACT-Methode zur Identifizierung weiträumiger DNA-Wechselwirkungen in humanen Promyelozyten-Leukämiezellen. Diese Technik ermöglicht die Entdeckung unbekannter genomischer Assoziationen für die Genregulationsforschung.

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Wir bedanken uns Adelle Murell und Wolf Reik sehr viel für die gemeinsame Nutzung ihrer 3C-Protokoll. Diese Arbeit wurde vom Department of Defense und dem Research Service des Department of Veterans Affairs unterstützt.

1. Formaldehydfixierung von Langstrecken-Chromatin-Wechselwirkungen <ol><li> Kultur humanen Zelllinie HL-60 in RPMI1640 Medium mit 15% FBS und 1 x Penicillin / Streptomycin auf 80-90% Konfluenz in einem Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C geliefert </li><li> Sammeln Sie die Zellen in einem 50-ml Nunc Röhrchen, Zentrifuge bei 1.200 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten, und entfernen Sie dann das Medium durch Absaugen </li><li> 5 ml Kulturmedium auf die Zellpellets resuspendiert, und zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Nehmen Sie ca. 1 x 10 7 Zellen auf ein Volumen von 40 ml mit RPMI1640 / 10% FBS, dann fügen Sie 1,7 ml 37% Formaldehyd zu der verdünnten Chromatin zu beheben. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten unter leichtem Schütteln und dann löschen mit 2,4 ml 2 M Glycin. Zentrifuge für 15 Minuten bei 1.200 rpm bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. Waschen des Pellets einmal mit 40 ml eiskaltem PBS, dann drehen Sie den Pellets und entfernen Sie die PBS. </li></ol> 2. Zelllyse zu Kernen isolieren <ol><li> Die Zellen in 40 ml eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) mit frisch hinzu Protease-Inhibitoren (1:500 Verdünnung) und 0,1 mM PMSF. Inkubieren in einem kalten Raum mit Rotation für 90 Minuten, Zentrifuge bei 2.500 rpm für 15 Minuten, und entfernen Sie den Überstand. </li></ol> 3. Restriktionsenzymverdau mit Bgl II <ol><li> Resuspendieren der Kerne in 0,5 ml 1 x NEB Puffer 3 und fügen Sie 15 μlof 10% SDS. Bei 37 ° C für 1 Stunde unter Schütteln, dann fügen Sie 45 ul von 20% Triton X-100 auf die SDS zu binden. Bei 37 ° C für 1 Stunde unter Schütteln. </li><li> Verwenden Sie ein Aliquot von 1 x 10 6 Kerne (ca. 15 pg, ein Zehntel der ursprünglichen Zellen) für Restriktionsenzymverdau. Nehmen Sie 55 ul der Kerne Lösung aus Schritt 3.1 und machen bis zu 500 ul mit 433 ul 1 x NEB Puffer 3 und 12 ul der Bgl II (50U/ul). Bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 4. Ligation von interagierenden DNA-Segmenten <ol><li> Inaktivierung des Restriktionsenzyms, indem 95 ul 10% SDS und denaturieren durch Erhitzen bei 65 ° C für 20 Minuten in einem Wasserbad. </li><li> 7 ml 1 x Ligation Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) und 360 ul 20% Triton X-100 und bei 37 ° C für 1 Stunde . </li><li> Senken Sie die Temperatur auf 16 ° C und 50 ul von 400 U / ul T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Probe bei 16 ° C für 4 Stunden und dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li></ol> 5. DNA Purification <ol><li> Add 300 ug Proteinase K, und inkubieren Sie bei 65 ° C über Nacht. </li><li> Add 5 ug RNase A und Inkubation bei 37 ° C für 30 Minuten </li><li> Purify DNA durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Fällung DNA in Isopropanol. Lösen DNA in 150 ul sterilem destilliertem Wasser. </li></ol> 6. Aufschluss mit Msp I und Ligation mit Oligonukleotid-Linker <ol><li> Inkubieren 2μg der gereinigten DNA mit 5 Einheiten Msp I bei 37 ° C für 4-6 Stunden. Inactivate Msp I bei 65 ° C für 10 Minuten, dann fallen die DNA in Ethanol mit 1 ul von 5 mg / ml Glykogen. Lösen Sie die DNA-Pellet in 50 ul sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Mix 50 ul Msp I-behandelter DNA mit 2 ul einer 20 uM Linker-Oligonukleotid L (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 ul einer 20 uM Oligonukleotid S (5'-cggtgaatc-3'), 1 ul sterilem destilliertem Wasser und 6 ul 10 x T4 DNA-Ligase-Puffer. Decken Sie die Mischung mit flüssigem Wachs. </li><li> Denaturieren Oligonukleotide bei 50 ° C für 1 Minute und abkühlen lassen schrittweise auf 10 ° C in einer 0,5 ° C / Minute Gradienten in einem Thermocycler. </li><li> Add 1 ul 400 U / ul T4 DNA-Ligase und Inkubieren bei 15 ° C über Nacht. Purify der Linker-DNA ligiert mit einem QIAquick PCR Purification Kit und eluieren in 50 ul sterilem destilliertem Wasser. </li></ol> 7. PCR-Amplifikation und Sequenzanalyse <ol><li> Wählen Sie ein Primer für die spezifische DNA-Region, die Sie für langreichweitige Wechselwirkungen (dh der "Köder") untersuchen möchten. In diesem Beispiel verwenden wir ABL-1. </li><li> Nehmen Sie 1 ul der gereinigten DNA in die erste Runde PCR mit 1 ul 20 uM ABL -1 spezifischen Primer # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 ul 20 uM Linker spezifischen Primer # 2963 (durchführen 5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3μl von 3 x Klen Taq DNA Polymerase I Cocktail und 3 ul sterilem destilliertem Wasser. Zwei ul von 32 P-dCTP ist zu 100 ul 3 x Klen Taq DNA Polymerase I Cocktail vor dem PCR-Amplifikation aufgenommen. Die thermischen Zyklus für einen heißen Start-PCR liegt bei 72 ° C für 2 min, 95 ° Cfor 2 Minuten, 18 Zyklen von 95 ° C für 20 Sekunden, 65 ° C für 40 Sekunden und 72 ° C für 1 Minute, die letzte Verlängerung ist bei 72 ° Cfür 5 Minuten. </li><li> Purify der ersten Runde PCR-Produkten mit einem QIAquick PCR Purification Kit, und eluieren DNA in 30 ul sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Nehmen Sie 1 ul 100 x verdünnt erste PCR-Produkt zu einem zweiten PCR-Runde mit verschachtelten Primer durch Zugabe von 1 ul 20 uM ABL-1-spezifischen Primer # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (Abbildung 1a), 1 ul durchführen von 20 pM des Linkers spezifischen Primer # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 ul 3 x Klen Taq DNA Polymerase I Cocktail und 3 ul sterilem destilliertem Wasser. Der Temperaturwechsel Zeitplan ist 25 Zyklen von 95 ° C für 20 Sekunden, 67 ° C für 40 Sekunden und 72 ° C für 1 Minute, nach Verlängerung bei 72 ° C, gefolgt von 5 Minuten. </li><li> Visualisieren Sie die PCR-Produkte, indem Sie einen 5% Urea-PAGE-Gel und das Scannen der exponierten Bildschirm in einem Phosphoimager (Abb. 1b). Jeder PCR-Bande aus dem Gel durch Auflösen des Gels Streifen in ein Eppendorf-Röhrchen mit 60 ul sterilem destilliertem Wasser und Inkubation bei 95 ° C für 5 Minuten recycelt werden. Kurz zentrifugieren bei 10.000 rpm für 10 sec, um alle Proben zu sammeln. Nehmen Sie 1 ul als die DNA-Vorlage verwenden, um PCR mit dem Primerpaar 2961/4626 unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durchführen. Die Sequenzanalyse können nach der Reinigung mit einem QIAquick PCR Purification Kit durchgeführt werden. </li><li> DNA-Sequenzen werden mit Hilfe eines Online-Tools, um ihre chromosomale Lage auf der Website zu ermitteln: http://genome.ucsc.edu (Abbildung 1c). Klicken Sie auf "BLAT 'ein neues Fenster, das eine DNA-Sequenz einfügen können eingegeben haben, erscheint ein neues Fenster nach dem Klicken auf' Senden 'und zeigt die" BLAT Search Results'. Klicken Sie auf "Browser" der Hit mit 100% Identität zu einer nächsten Fenster geben Sie den Speicherort der DNA-Sequenz zu zeigen. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse 1. ACT-Assay mit ABL-1 Region als Köder, um seiner großen Reichweite DNA Wechselwirkungen bestimmen Wie in Abbildung 1a, zwei Bgl II-und einer BamHI site dargestellt wurden für die ACT-Test ausgewählt. In der zweiten Runde der PCR, Primer-Set 4626/2961 verwendet wurde, um ABL-M1 zu verstärken, wurde 4630/2961 für ABL-M2 verwendet, und 4636/2961 war für die ABL-M3 verwendet. Ein typisches Gel Muster zeigt eine bis mehrere Banden (Abb. 1b). Jedes Fragment aus einem ACT-Test besteht aus zwei kombinierten DNA-Abschnitte: ein Segment aus dem Köder DNA-Region stammen, während das zweite Segment kommt aus den assoziierten Partner, der den Köder Region Segment durch die erste Restriktionsenzym-Erkennungssequenz verbunden war. Das zweite Enzym Erkennungssequenz wird am Ende der zugehörigen Partner-Sequenz (Abbildung 1c) erscheinen. Das geklonte ABL-M1-Fragment enthält DNA aus der Region auf Chromosom 9q32.4 ABL1 aus +133,592,306-133,592,399 befindet, und die damit verbundenen Partner ist auf Chromosom 3p13 aus +71,869,882-71,870,107 entfernt. Die Identitäten der beteiligten Partner sind durch Strahlen ihre Sequenzen mit der UCSC Genom-Browser (GRCh7/hg19 im Februar veröffentlicht, 2009) entdeckt. PROK2 als assoziierter Partner an der chr3p13 Locus identifiziert wurde. Ebenso wurde das ABL-M2 assoziierter Partner zu chr5q21.1 lokalisiert, während Klon ABL-M3 als intra-chromosomale Verein in der Nähe des ABL-1-Locus identifiziert wurde. 2. Bestimmen weniger verbreitet langreichweitige Wechselwirkungen mit ACT-Test Andere Tests auf Basis 3C haben viele weitere Interaktionspartner als dass wir in Abbildung 1 und in der Igf2 / H19-Locus 12 gezeigt gemeldet. Die Methode, die wir skizziert haben wählt die am weitesten verbreitete langreichweitige Wechselwirkungen. Doch durch die Erhöhung der Anzahl der PCR-Zyklen, ist es möglich, zusätzliche, weniger häufige Assoziationen zu identifizieren sowie (Abbildung 2). 3. Unterschiede in langreichweitige Wechselwirkungen in Krebszellen zu normalen Geweben verglichen. Der ACT-Test kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der nuklearen Architektur und langreichweitige Wechselwirkungen zwischen normalen und Krebszellen (Abbildung 3) zu identifizieren. Diese Unterschiede können reflektieren nuklearen Architektur Änderungen, die während Zelltransformation auftreten, und somit diesen Test kann letztlich gelten für diagnostische Zwecke. Die ähnliche Gel Muster, die in normalen und Krebsgewebe auftreten angedeutet, dass die ACT-Test zuverlässig und wiederholbar ist. Während die ACT-Assay identifizieren können Long Range DNA-Partner, weitere Analysen, wie zB Fisch-und Chip-Assays sind erforderlich, um die Anwesenheit der identifizierten Verbindungen zwischen entfernten Loci zu überprüfen. Genetische, physiologische und biochemische Untersuchungen können dann durchgeführt werden, um die biologischen Auswirkungen dieser langen Strecke DNA Verbänden aufzuklären. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 ACT-Assay mit ABL-1 Region als Köder DNA in HL-60 Zellen. a. DNA-Strukturure in ABL-1 Region. Die erste Restriktionsenzym in ACT-Assay verwendet wurde Bgl II. Die Primer für die zweite Runde der PCR werden auch durch die Pfeile und die entsprechenden Primer-Nummern gekennzeichnet. b. Gel Muster der ACT-Test in 5% Harnstoff-PAGE. Primerpaar 4626/2961 zur Verstärkung Klon ABL-M1 in der nested PCR verwendet wurde, wurde 4630/2961 für Klon ABL-M2 verwendet, und 4636/2961 war für Klon ABL-M3 verwendet. c. DNA-Sequenz von Klon ABL-M1. DNA-Fragment aus ABL-1 Köder DNA ist rot markiert, und die damit verbundene DNA-Partner ist in den Farben Cyan bezeichnet. Bgl II-Stelle (AGACTC) wurde in grün markiert, und Msp I-Stelle (CCGG) ist in lila markiert. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 PCR-Zyklen beeinflussen ACT Testergebnisse. Mit dem Imprinting Kontrollregion (ICR) in der Igf2/H19 locus als Köder DNA in Maus-Fibroblasten-Zellen wurden verschiedene Rad-Programme in der ersten und zweiten Runde der PCR in der ACT-Test angewendet. 18-20 Zyklen in der ersten Runde der PCR nicht verstärken genug Signal visualisiert werden. Fünfundzwanzig Zyklen in der zweiten PCR-Ergebnisse in deutliche Banden, bei gleichzeitiger Erhöhung der Anzahl der Zyklen für die zweite Runde der PCR induzierte ein Abstrich Muster neben mehr Bands. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Nachweis von Unterschieden in der nuklearen Architektur zwischen normalen Kolon-und Darmkrebs Gewebe in ACT-Test. A. DNA-Struktur des ICR Region IGF2/H19 Locus und IGF2 Gen. Dpn II Standorte für ACT-Assay sind beschriftet. Primer in der zweiten Runde der PCR verwendet werden durch Pfeile und Zahlen in verschiedenen Farben, die auf jeder Bahn in Panel b der Figur entsprechen gekennzeichnet. b. Gel Muster der ACT-Test in 5% Harnstoff-PAGE. Normale Dickdarmgewebe MAD03-1423-und Darmkrebs Gewebe MAD04-149 wurde von Cooperative Human Tissue Network (CHTN) Western Division erhalten. Nach jedem Doppelpunkt Gewebe wurde homogenisiert, war ACT-Test nach dem hier beschriebenen Verfahren durchgeführt. Spur 1 stellt die PCR-Ergebnisse mit Primerpaar # 2961and # 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') in pink in Panel ein markiertes, Spur 2 stellt die PCR-Ergebnisse mit Primerpaar # 2961 und # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') in orange in Panel ein markiertes, Spur 3 zeigt die PCR-Ergebnisse mit Primerpaar # 2961 und # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') in blau in Panel ein markiertes, Spur 4 ist die PCR-Ergebnisse mit Primerpaar # 2961 und # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') in grün in Panel a. beschriftet Einzigartige Bands, die nur in normalen Kolon sind durch gelbe Pfeile gekennzeichnet sind, und jenen Bands, die nur in Darmkrebsgewebe erschienen sind in roten Pfeilen gekennzeichnet. ICR, Imprinting Kontrollregion; DMR, verschiedene methylierte Region.

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li>
<li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li>
<li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li>
<li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li>
<li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li>
<li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li>
<li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Berkum, N. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2%2FH19+and+Wsb1%2FNf1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%27C%27s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li>
</ol>

Dekker et al. Entwickelte das Chromosom Konformation erfassen Ansatzes (3C), um die Häufigkeit der Interaktion zwischen zwei genomischen Loci 1 zu erfassen, und 3C wurde ausgiebig auf intra-chromosomale und inter-chromosomal Assoziationen zwischen zwei bekannten DNA-Regionen in Säugetier-Zellen 2 zu untersuchen verwendet -9. Obwohl neu entwickelten Hallo-C Methodik zur Untersuchung der genomweiten DNA Verein aufgebracht werden können, ist ACT-Test noch eine effektive Technik zur Untersuchung von Locus-spezifischen DNA-Interaktion 10-11. Wir haben diesen Ansatz modifiziert werden, um unbekannte DNA Regionen, die mit einer bekannten DNA-Region in kultivierten Maus und humanen Zellen (Abbildung 1) verbunden sind, zu identifizieren. Wir nannten diese Methode der damit verbundenen Chromosom Trap (ACT)-Assay, da es uns eine verlässliche und reproduzierbare Methode, um neue unbekannte DNA-Partnern, die mit einem bekannten Ziel-DNA Bereich 12 Mitarbeiter zu identifizieren. Eine erfolgreiche 3C-Assay mit geeigneten Kontrollen wird vor der Ausführung der neuartigen Aspekte der ACT-Test 13 durchgeführt. Um möglichst viele zugehörige DNA-Regionen wie möglich tofind, ist es notwendig, verschiedene Kombinationen der ersten und zweiten Restriktionsenzyme verwenden. Es ist besonders wichtig, Restriktionsenzyme, die unempfindlich gegen CpG-Methylierung auf den ersten 3C Ligationsschritt durchführen verwenden. Protein-Bindung und DNA-Methylierung können auch Einfluss Restriktionsenzymverdau Effizienz und kann zum Ausfall der Ligation der damit verbundenen DNA-Bereiche für bestimmte Restriktionsenzym Aufschlüsse führen. Das Auftreten von intra-oder inter-chromosomal Ligation ist abhängig von Protein-DNA-Vernetzung und entsprechende physische Karten von beiden der zugehörigen DNA-Regionen. So sind einige Vorversuche notwendig, um eine praktikable wirksame Formaldehyd-Konzentration und Behandlungsdauer in der ACT-Tests erstellen. Eine Reihe von Endkonzentrationen von Formaldehyd (from1.5% bis 2%) wurden in mehreren Labors wurde während der 3C Teil des Tests 7,9 verwendet. Alternativ können die Oligonukleotide als Linker verwendet entworfen, um den Zusammenhalt Ende durch den zweiten Restriktionsenzym geschnitten angepasst werden. Obwohl wir festgestellt, dass 18-20 Zyklen in der ersten Runde der PCR und 20-25 Zyklen in der zweiten Runde der PCR konnten deutliche Banden liefern, ist es notwendig, die beste PCR-Bedingungen für jedes Experiment (Abbildung 2) zu etablieren. Intra-Molekül Glühen zwischen 5&#39;-Ende und 3&#39;-Ende komplementär Adapter Sequenz eines DNA-Stranges kann in PCR auftreten, hemmt es Adapter-spezifischen Primer mit den DNA-Molekül, und führte zu viel niedrigeren Amplifikationseffizienz in der ersten mehreren Zyklen. Nachdem die Ziel-DNA für die Zyklen amplifiziert wurde, kann ihre Höhe sehr viel größer sein als diese unspezifischen Reaktionen und kann der Konkurrenz der Primer an die Target-DNA-Moleküle zu erleichtern. Dies gilt auch, warum wir Hintergrundamplifikation sehen kann, und warum die erste Runde PCR-Produkt muss verdünnt Hintergrund amplification.It zu verringern ist wichtig, um überschüssige Primer aus der PCR-Reaktion zu entfernen, um den Hintergrund in die zweite Runde der PCR verringern. Wie in allen PCR-Experimenten, ist es wichtig, Primer, die nicht in Repeat-Sequenz Regionen, die die Mehrheit der Menschen und der Maus DNA bilden befinden Design. Obwohl neu entwickelten Hallo-C Methodik zur Untersuchung der genomweiten DNA Verein aufgebracht werden können, ist ACT-Test noch eine effektive Technik zur Untersuchung von Locus-spezifischen DNA-Interaktion.

<table><tbody><tr><td>RPMI1640-Medium</td><td>Invitrogen</td><td>22400-105</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Invitrogen</td><td>15512-023</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Lösung, 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>fetales Kälberserum</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091-039</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Invitrogen</td><td>15505-035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;BamH&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bgl&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Dpn&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Msp&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8102S</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>37 % Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche Group</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>KlenTaq1</td><td>Ab peptides</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>dCTP alpha P32</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU513H250UC</td><td></td></tr><tr><td>PTC-100 Thermocycler</td><td>MJ Research</td><td>mjptc100</td><td></td></tr><tr><td>Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td></td></tr><tr><td>OmniPAGE Maxi</td><td>Aurogene Life Science</td><td>VS20D</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr></tbody></table>

assoziierte chromosome-trap zur identifizierung weiträumige dna-wechselwirkungen

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Genetische Informationen, die von DNA codiert wird, in einer komplexen und stark regulierten Chromatin-Struktur organisiert. Jedes Chromosom befindet sich in einem bestimmten Gebiet, die nach Stadium der Entwicklung oder Zellzyklus ändern kann. Genexpression kann in spezialisierten transkriptionelle Fabriken dort auftreten, wo Chromatin Segmente Schleife aus verschiedenen Chromosomen Territorien, die zu Co-Lokalisation von DNA-Segmenten, die auf unterschiedlichen Chromosomen oder weit voneinander entfernt auf demselben Chromosom vorhanden sein können. The Associated Chromosome Trap (ACT)-Assay bietet eine effektive Methode, um diese Langstrecken-DNA Verbände in einem unvoreingenommenen Weise durch die Erweiterung und Änderung des Chromosoms Konformation Capture-Technik zu identifizieren. Der ACT-Test macht es uns möglich, Mechanismen der Regulation der Transkription in trans zu untersuchen, und können bei der Erläuterung der Beziehung der nuklearen Architektur, die Genexpression in der normalen Physiologie und während Krankheitszuständen.

Die damit verbundenen Chromosom Trap (ACT)-Assay ist ein neuartiges unvoreingenommene Verfahren zur Identifizierung von Langstrecken-DNA-Wechselwirkungen. Die Charakterisierung der Long Range DNA-Wechselwirkungen wird es uns ermöglichen, die Beziehung der nuklearen Architektur, um die Genexpression zu bestimmen, sowohl die normale Physiologie und in krankhaften Zuständen.

Assoziierte Chromosome-Trap zur Identifizierung weiträumige DNA-Wechselwirkungen

Die in der DNA kodierten genetischen Informationen sind in einer komplexen und hochregulierten Chromatinstruktur organisiert. Jedes Chromosom nimmt ein spezifisches Territorium ein, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, langreichweitig assoziierte DNA-Partner zu entdecken und zu identifizieren. Dies wird erreicht durch Fixierung, Zelllyse und Verdau der DNA mit dem ersten Restriktionsenzym, gefolgt von einer Ligierung, um eine chimäre DNA zu erzeugen, die aus Segmenten der beiden assoziierten Gene besteht. Anschließend werden nach dem zweiten Restriktionsverdau Linker an die chimäre DNA angefügt, um deren Amplifikation zu erleichtern. Danach erfolgt die PCR-Amplifikation unter Verwendung von Linker- und gezielt auf die „bait“-DNA spezifischen Primern, um ausreichende Mengen der assoziierten DNA-Fragmente zu erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die langreichweitig assoziierten DNA-Partner der „bait“-DNA auf Grundlage der Sequenzanalyse der amplifizierten DNA-Fragmente.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Chromosomenkonformations-Aufnahme oder Three-C besteht darin, dass A-C-T-S-A verwendet werden kann, um einen unbekannten, langreichweitig assoziierten DNA-Partner effektiv zu identifizieren, während Three-C zur Überprüfung ausschließlich zuvor vermuteter Interaktionen diente. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie humane Zellen in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C kultivieren, bis sie 80 bis 90 % konfluent sind.Menschliche promyelozytäre Leukämiezellen werden für diese Demonstration verwendet. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie in ein 50-Milliliter-NOC-Gefäß gießen, und zentrifugieren Sie sie 15 Minuten bei 1200 U/min. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Medium durch Absaugen.Geben Sie fünf Milliliter Kulturmedium hinzu, um die Zellpellets aufzuschwemmen. Nach der Bestimmung der Zellzahl mit einem Hämozytometer überführen Sie etwa eine mal 10 hoch sieben Zellen in ein Volumen von 40 Milliliter RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS. Fügen Sie anschließend 1,7 Milliliter 37 % Formaldehyd hinzu, um das verdünnte Chromatin zu fixieren.Die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation die Reaktion mit 2,4 Milliliter zwei molarer Glycinlösung abbrechen. Anschließend die Probe 15 Minuten bei 1200 U/min und vier Grad Celsius zentrifugieren.Nachdem Sie das Überstand entfernt haben, waschen Sie das Pellet einmal mit 40 Milliliter eiskaltem PBS, zentrifugieren Sie die Probe, um das gewaschene Zellpellet zu gewinnen, und resuspendieren Sie das resultierende Pellet in 40 Milliliter eiskaltem Lysepuffer mit frisch zugesetzten Proteaseinhibitoren und 0,1 Millimolar PMSF. Inkubieren Sie die Probe 90 Minuten lang bei 4 °C unter Rühren. Zentrifugieren Sie abschließend die Probe bei 2.500 U/min für 15 Minuten, entfernen Sie den Überstand und gewinnen Sie die isolierten Kerne. Resuspendieren Sie die Kerne in 0,5 Milliliter 1× NEB-Puffer 3 und geben Sie 15 Mikroliter 10 %iges SDS hinzu.Die Probe für eine Stunde bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Anschließend 45 Mikroliter 20 % Triton X-100 hinzufügen, um das SDS abzufangen, und erneut für eine Stunde bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren sowie einen Aliquot von ein mal 10 hoch 6 verwenden. Die Kerne oder etwa 15 Mikrogramm werden für die Restriktionsenzymverdauung in 55 Mikroliter Kernlösung verwendet.Fügen Sie 433 µL eines XNEB-Puffers drei und 12 µL BGL zwei hinzu, um ein Gesamtvolumen der Verdauungsreaktion von 500 µL zu erhalten. Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 37 °C. Inaktivieren Sie am nächsten Tag das Restriktionsenzym durch Zugabe von 95 µL 10 %iger SDS-Lösung und denaturieren Sie das Enzym durch 20-minütiges Erhitzen auf 65 °C.In einem Wasserbad sieben Milliliter 1x Ligationspuffer und 360 Mikroliter 20 % Triton X-100 hinzufügen. Die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Temperatur auf 16 Grad Celsius senken und 50 Mikroliter 400 Einheiten pro Mikroliter hinzufügen.T vier DNA-Ligase. Lassen Sie die Ligationsreaktion vier Stunden bei 16 Grad Celsius inkubieren und anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Abschluss der Ligation 300 Mikrogramm Proteinase K hinzufügen und über Nacht bei 65 Grad Celsius inkubieren.Fügen Sie dann fünf Mikrogramm RNAA hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Reinigen Sie die DNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion und präzipitieren Sie die DNA in Isopropanol; lösen Sie die präzipitierte DNA in 150 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser auf. Um Linker an die chimäre DNA anzufügen, verdauen Sie zunächst die DNA, indem Sie zwei Mikrogramm gereinigte DNA mit fünf Einheiten Msp1 bei 37 Grad Celsius vier bis sechs Stunden lang inkubieren. Nach dem Verdau inaktivieren Sie Msp1 bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten.Anschießend präzipitieren Sie die DNA in Ethanol mit einem Mikroliter einer Lösung mit fünf Milligramm pro Milliliter. Glykogen lösen Sie das resultierende DNA-Pellet in 50 Mikrolitern sterilisiertem destilliertem Wasser auf. Mischen Sie danach 50 Mikroliter MSP1-behandelter DNA mit zwei Mikrolitern eines 20-Mikromolar-Linker-Oligonukleotids L und einem Mikroliter eines 20-Mikromolar-Oligonukleotids S, geben Sie dann einen Mikroliter sterilisiertes destilliertes Wasser und sechs Mikroliter 10×T4-DNA-Ligase-Puffer hinzu.Bedecken Sie die Mischung mit flüssigem Wachs. Denaturieren Sie die Oligonukleotide bei 50 Grad Celsius für eine Minute und lassen Sie sie allmählich in einem Gefälle von 0,5 Grad Celsius pro Minute auf 10 Grad Celsius abkühlen. Geben Sie mithilfe eines Thermocyclers ein Mikroliter einer 400 Einheiten pro Mikroliter T4-DNA-Ligase hinzu und inkubieren Sie die Reaktion bei 15 Grad Celsius über Nacht.Am nächsten Tag reinigen Sie die mit dem Linker ligierte DNA unter Verwendung eines Kaya-Schnell-PCR-Reinigungskits und eluieren in 50 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser. Anschließend wählen Sie ein Primer für den spezifischen DNA-Bereich aus, der auf langreichweitige Wechselwirkungen untersucht werden soll. In diesem Beispiel wird Abel als Primer oder als Köder verwendet.Bereiten Sie die gereinigte DNA für die erste PCR-Runde vor, indem Sie ein Mikroliter der gereinigten DNA mit einem Mikroliter eines 20-Mikromolar-Able-One-spezifischen Primers, 46 56, und einem Mikroliter eines 20-Mikromolar-Linker-spezifischen Primers, 29 63, mischen. Fügen Sie anschließend drei Mikroliter einer dreifachen ClinTech-DNA-Polymerase-Cocktailmischung hinzu, die zuvor gemäß dem schriftlichen Protokoll mit 32 P-D-C-T-P versetzt wurde, gefolgt von drei Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser. Führen Sie die PCR-Amplifikation unter Verwendung des im schriftlichen Protokoll beschriebenen Hot-Start-PCR-Thermocycling-Programms durch, nachdem der PCR-Zyklus abgeschlossen ist.Reinigen Sie die PCR-Produkte der ersten Runde mithilfe eines Kaya-Quick-PCR-Reinigungskits. Eluieren Sie in 30 Mikroliter sterilem destilliertem Wasser. Verwenden Sie ein Mikroliter des ersten PCR-Produkts, 100-fach verdünnt, um eine zweite PCR-Runde mit nested Primern durchzuführen, indem Sie ein Mikroliter 20-Mikromolar-löslichen spezifischen Primer Able One 46 26 und ein Mikroliter 20-Mikromolar-löslichen linkerspezifischen Primer 29 61 hinzufügen.Fügen Sie erneut drei Mikroliter dreifach konzentriertes ClinTech, DNA-Polymerase, einen Cocktail und drei Mikroliter sterilem destilliertem Wasser hinzu. Führen Sie die zweite Runde der PCR unter Verwendung eines thermischen Zyklenprogramms mit 25 Zyklen von 95 °C für 20 Sekunden, 67 °C für 40 Sekunden und 72 °C für eine Minute durch, gefolgt von einer Verlängerung bei 72 °C für fünf Minuten.Visualisieren Sie die PCR-Produkte, indem Sie ein 5 %igen Harnstoff-Page-Gel laufen lassen und anschließend den belichteten Screen in einem Phospho-Imager scannen. Jedes PCR-Band kann aus dem Gel zurückgewonnen werden, indem die Gel-Streifen in einem Eppendorf-Röhrchen mit 60 µL sterilem destilliertem Wasser aufgelöst und fünf Minuten bei 95 °C inkubiert werden. Zentrifugieren Sie die aufgelösten Gel-Produkte kurz bei 10.000 U/min für 10 Sekunden.Um alle Proben zu sammeln. Entnehmen Sie einen Mikroliter, um ihn als DNA-Vorlage für die Durchführung der PCR mit dem Prime Repair 29 61 46 26 zu verwenden.Unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie oben beschrieben können nach der Reinigung und Sequenzanalyse mit einem Online-Tool die chromosomale Lokalisation bestimmt werden. Sobald Sie sich auf der bioinformatischen Genomwebsite befinden, klicken Sie auf blatt, um ein neues Fenster zu öffnen, und fügen Sie die DNA-Sequenz ein. Nachdem die DNA-Sequenz übermittelt wurde, werden die BLATT-Suchergebnisse angezeigt.Klicken Sie im Browser auf den Treffer mit 100 % Identität, um die Position der DNA-Sequenz aufzudecken. Der auffindbare Bereich wurde als Köder verwendet, um seine langreichweitigen DNA-Interaktionen zu bestimmen. Zwei BGL2-Stellen und eine BAMH1-Stelle wurden für den A CT-Assay in der zweiten Runde des PCR-Primer-Sets ausgewählt; 46 26 29 61 wurde verwendet, um able M1 zu amplifizieren; 46 30 29 61 wurde für able M2 verwendet und 46 36 29 61 für able M3.Ein typisches Gelelektrophoresemuster zeigt ein bis mehrere Banden, wie hier für able M1, able M2 und able M3 dargestellt. Die DNA-Sequenz des Klon able M1 wird gezeigt, um zu demonstrieren, dass jedes Fragment aus einem A CT-Assay aus zwei kombinierten DNA-Abschnitten besteht. Ein Abschnitt stammt aus der Bait-DNA-Region, während der zweite Abschnitt vom assoziierten Partner stammt.Die Segmente werden über die erste Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme miteinander verbunden. Die Erkennungssequenz für das zweite Enzym erscheint am Ende der zugehörigen Partnersequenz. Das klonierbare M1-Fragment enthält DNA aus dem Bereich von ABLE eins, das auf Chromosom neun Q 32,4 lokalisiert ist, und der zugehörige Partner befindet sich auf Chromosom drei P drei, der als proc zwei identifiziert wurde.Ebenso wurde der assoziierte Partner Able M zwei auf Chromosom fünf Q 21.1 lokalisiert, während das Klon Able M drei als intrachromosomale Assoziation in der Nähe des Able-eins-Lokus im Gegensatz zu den 3C-Assays identifiziert wurde. Die in diesem Video beschriebene Methodik ermöglicht die Selektion der am häufigsten vorkommenden langreichweitigen Interaktionen. Durch Erhöhung der Anzahl der PCR-Zyklen ist es jedoch ebenfalls möglich, zusätzliche, seltener auftretende Assoziationen nachzuweisen. Hierzu wurde als Köder-DNA im Maus-Fibroblasten-Zellmodell die Imprinting- und Kontrollregion oder ICR am IGF2-H19-Lokus verwendet, wobei unterschiedliche Zyklenprogramme in der ersten und zweiten Runde der PCR im ACT-Assay angewandt wurden.Mit dem A-CT-Assay können auch Unterschiede in der nukleären Architektur und in langreichweitigen Wechselwirkungen zwischen normalen Zellen und Krebszellen nachgewiesen werden. Normales Kolon-Gewebe und Kolon-Krebs-Gewebe wurden homogenisiert, und der A-CT-Assay wurde gemäß den hier beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dargestellt ist hier die DNA-Struktur der ICR-Region am IGF2-H19-Lokus und des IGF2-Gens dpn.Zwei Stellen für den A-CT-Assay, an denen die Primer verwendet werden, die in der zweiten PCR-Runde eingesetzt werden, sind durch Pfeile und Zahlen in verschiedenen Farben markiert. Das Gelelektrophoresemuster des A-CT-Assays zeigt die PCR-Ergebnisse unter Verwendung des Primers 29 61 in Kombination mit den Primer-Paaren 41/61, 41/63, 51/45 und 51/51. Einzigartige Banden, die ausschließlich in normalem Kolon-Gewebe auftreten, sind mit gelben Pfeilen gekennzeichnet, während Banden, die nur in kolorektalem Krebsgewebe auftreten, mit roten Pfeilen markiert sind, nachdem der Assay etabliert wurde.Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Marktbiologie den Weg, um die nukleäre Architektur und die Genregulation auf dreidimensionale Weise zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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