In Vivo Canine Muscle Function Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die mechanischen Eigenschaften der Hinterbeinmuskulatur beim lebenden Hund mithilfe nichtinvasiver Methoden zu messen und zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem der Hund zunächst korrekt in der Physiologievorrichtung positioniert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die isometrische Zuckungsdrehkraft und die titanische Tibia-tarsale Flexionsdrehkraft zu messen und aufzuzeichnen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, exzentrische Kontraktionen durchzuführen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Messung und Aufzeichnung von isometrischem Zuckungs-, Dreh- und tetanischem Drehmoment während der Tibia-Tarsus-Extension. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Hintergliedmaßen-Muskelkraft und die Reaktion auf wiederholte exzentrische Kontraktionen mittels einer nichtinvasiven physiologischen Methode zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie ex-vivo-Isoliert-Muskelassays, die terminale Studien darstellen, liegt darin, dass die hier verwendete Methode, da sie nichtinvasiv ist und gut vertragen wird, über die Zeit wiederholt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Muskelphysiologie zu beantworten, beispielsweise die Reaktion der Muskulatur auf kontraktionsinduzierte Verletzungen oder Ermüdung. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie oder Diagnose von Muskeldystrophien, da die Methode die Muskelaktivität bei Hunden oder anderen großen Säugetieren misst.

Derart große Tiere werden in präklinischen Studien vieler neuer Therapien vor klinischen Versuchen und Patientenanwendungen benötigt. Obwohl diese Methode Einblicke in hundebasierte Modelle ermöglichen kann, ist sie auch auf andere tierexperimentelle Systeme wie nichtmenschliche Primaten anwendbar. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund des sorgfältigen Umgangs bei der Platzierung der Stimulations-Elektroden und des Wissens darüber, was von den Drehmomentkurven zu erwarten ist, Schwierigkeiten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Elektrodenpositionierung aufgrund der erforderlichen Präzision, um die maximale Drehmomentantwort der Muskeln hervorzurufen, nur schwer zu erlernen sind.

Im Rahmen der Untersuchung werden zwei Protokolle, die in der Dynamic Muscle Control- oder DMC-Software verfasst sind, verwendet, um die Stimulations- und Datenaufzeichnungsparameter festzulegen. Das erste Protokoll, das isometrische Kontraktionsprotokoll, wird sowohl für Zuckungen als auch für tetanische Kontraktionen verwendet. Das zweite Protokoll, das exzentrische Dehnverletzungsprotokoll genannt wird, dient für exzentrische Kontraktionen. Die Stimulatoreinstellungen und die für jedes Protokoll verwendeten Softwaresequenzen sind in der hier gezeigten Tabelle angegeben. Zuckungskontraktionen werden durch eine Stimulation mit einem Hertz ausgelöst.

Die tetanischen und exzentrischen Kontraktionen werden durch eine Stimulation mit 50 Hertz hervorgerufen. Im Fall der exzentrischen Kontraktion wird eine Dehnung auf den kontrahierenden Muskel überlagert. Diese Experimente beinhalten das Hervorrufen verschiedener Arten von Muskelkontraktionen, wobei der Nervus peroneus stimuliert wird, um Zuckungen, tetanische oder exzentrische Kontraktionen eines Flexormuskels auszulösen, und der Nervus tibialis stimuliert wird, um Zuckungen oder tetanische Kontraktionen eines Extensormuskels auszulösen.

Nach der Anästhesie des Hundes den Lidschlagreflex überprüfen, um sicherzustellen, dass das Tier tief anästhesiert ist. Kohlendioxid, Pulsoxymetrie und Temperatur sorgfältig überwachen. Während des Eingriffs die Haare an der lateralen Stifle-Stelle rasieren, an der die Stimulations-Elektroden platziert werden.

Als Nächstes positionieren Sie den Hund auf dem Physiologietisch. Bringen Sie das Beckenglied in Rückenlage so in Position, dass Femur und Tibia einen rechten Winkel bilden und die Tibia parallel zur Tischoberfläche liegt. Prüfen Sie, ob das Kraftpedal sicher rotieren kann. Es sollte sich steif anfühlen, wenn es manuell bewegt wird.

Als Nächstes schalten Sie die Physiologievorrichtung ein und aktivieren das Pedal. Die Bewegung des Pedals wird durch den Servomotor gesteuert, der wiederum vom Computer gesteuert wird. Legen Sie nun die Pfote des Hundes vorsichtig in die Pedalmessvorrichtung und messen Sie die Länge der Pfote des Hundes von der Drehachse bis zur Spitze des seitlichen Zehs auf.

Befestigen Sie dann die Pfote des Hundes mit einem elastischen, selbsthaftenden Verband am Fußpedal. Der Sensor im Pedal zeichnet die Kraft der Muskelkontraktionen der Beine auf. Richten Sie die Stimulations-Elektroden ein, indem Sie die geschirmten monopolaren Elektroden mit 24 Gauge an die Stimulationsisolations-Einheit anschließen.

Reinigen Sie mit Handschuhen die Haut des Hundes mit Alkohol und ertasten Sie den Nervus peronaeus communis knapp distal zur lateralen proximalen Fibula, wobei Sie den Bereich des Nervs mit einem Finger markieren. Führen Sie vorsichtig die schwarze Kathodenelektrode unter die Haut ein und platzieren Sie die rote Anodenelektrode unter der Haut parallel und leicht distal zur Kathodenelektrode direkt außerhalb des Periosts. Beide Elektroden sollten sich nun innerhalb des Nervus peronaeus communis knapp distal zum Fibulaköpfchen befinden. Aktivieren Sie anschließend den Stimulator mit einem Hertz und beobachten Sie die Zuckungsantwort auf dem Monitor.

Nehmen Sie bei Bedarf kleine Anpassungen an den Elektrodenpositionen vor, um die größtmögliche Zuckungsamplitude zu erzielen. Sobald die Elektroden gut positioniert sind, aktivieren Sie die DMC-Software, um eine Zuckungsantwort aufzuzeichnen. Der nächste Schritt besteht darin, eine tetanische Kontraktion auszulösen, ohne die Elektroden zu bewegen.

Stellen Sie den Stimulator gemäß der Angaben in der Tabelle für eine tetanische Kontraktion ein. Aktivieren Sie dann im Softwareprotokoll die isometrische Kontraktion, um eine isometrische tetanische Kontraktion des Muskels zu erzeugen. Das nächste Experiment, das exzentrische Dehnverletzungsprotokoll, wird ebenfalls durchgeführt, ohne die Elektroden zu bewegen.

Stellen Sie den Stimulator auf eine exzentrische Kontraktion ein und beginnen Sie die Stimulation. In diesem Protokoll wird der Nerv zehnmal mit 50 Hertz für eine Sekunde stimuliert. Während dieser einen Sekunde kontrahieren sich die Flexormuskeln isometrisch für die ersten 800 Millisekunden, und anschließend wird der Muskel für die letzten 200 Millisekunden gedehnt.

Nach einem Satz von 10 exzentrischen Kontraktionen lässt man den Muskel vier Minuten ruhen. Anschließend wiederholt man das exzentrische Dehnverletzungsprotokoll noch zweimal, wobei zwischen jedem Satz eine Pause von vier Minuten eingelegt wird, um den Extensormuskel zu stimulieren. Danach verlegt man die Elektroden auf den Nervus tibialis, indem man die Elektroden senkrecht zur Haut und proximal zu der ursprünglichen Elektrodenposition für die Flexion einführt. Der ungefähre Platzierungspunkt liegt entlang einer Linie, die den 90-Grad-Winkel am Knie halbiert.

Der Nervus tibialis liegt tiefer und medial zum Nervus peronaeus communis. Bewegen Sie die Elektroden nach Bedarf, um optimale Zuckungspotentiale hervorzurufen. Sobald die Elektroden positioniert sind, erzeugen Sie mittels des isometrischen Protokolls eine maximale Zuckung, ohne die Elektroden zu bewegen.

Ändern Sie die Stimulatoreinstellungen gemäß den Vorgaben für tetanische Kontraktionen. Aktivieren Sie anschließend und zeichnen Sie eine tetanische Kontraktion des Musculus extensor tibiotarsi auf. Zur Analyse von Drehmoment und zeitlichen Informationen der Muskelkontraktionen wird das Programm für dynamische Muskelanalyse (DMA) verwendet.

In dieser Abbildung wurde durch eine Stimulation des Nervus tibialis mit einem Hertz jeweils ein einzelner Muskelzuckung der Tibia-tarsalen Strecker erzeugt, um die Daten analysieren zu können. Die Positionen der drei Cursor werden wie folgt festgelegt: Der blaue Cursor wird an dem Punkt gesetzt, an dem das Drehmoment vom Ruhe-Drehmoment ansteigt. Der gelbe Cursor wird dort platziert, wo das Drehmoment zum Ruhe-Drehmoment zurückkehrt.

Das bedeutet, dass nach der Relaxationsphase der weiße Cursor nicht mehr benötigt wird und daher rechts neben dem gelben Cursor positioniert wird. Diese Abbildung zeigt eine isometrische Titanic-Torsionsstimulation des Nervus tibialis mit einer 1,5 Sekunden langen Serie von 50 Hertz-Impulsen, die zu einer tetanischen Kontraktion des Musculus extensor tibiotarsi führte. Zur Datenanalyse werden der blaue und der gelbe Cursor platziert.

Bei der Zuckungsanalyse in dieser Abbildung wurden exzentrische Kontraktionen in den Flexoren des Tibia-Tarsal-Gelenks induziert. Eine perkutane Stimulation des Nervus peroneus löste eine anfängliche isometrische Kontraktion über 800 Millisekunden aus, woraufhin eine erzwungene Dehnung am Bein durchgeführt wurde. Für diese Datenanalyse wird der blaue Cursor an dem Punkt positioniert, an dem das isometrische Drehmoment beginnt, sich vom Ruhe-Drehmoment zu erhöhen.

Der gelbe Cursor wird an dem Punkt platziert, an dem das exzentrische Dehnungsdrehmoment beginnt, vom isometrischen Plateau anzusteigen. Der weiße Cursor wird dort platziert, wo das Drehmoment zum Ruhe-Drehmoment zurückkehrt. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in etwa einer Stunde durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, einen ausgedruckten Protokollablauf mit schrittweisen Kontrollpunkten zur Hand zu haben, dem man folgen kann.

Andere Methoden wie Muskelbiopsien können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich des Muskelfasertyps oder der Expression eines Transgens nach dessen Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Muskelphysiologie den Weg, um die Reaktionen auf körperliche Belastung bei Hunden mit Muskeldystrophie zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen nicht-invasiven Muskelphysiologie-Test bei Hunden durchführt.