Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die konformationellen Dynamiken von Membranproteinen mithilfe einer gezielten Fluoreszenzmarkierung an der Oberfläche einzelner Zellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst einzelne Reste an der Grenzfläche zwischen extrazellulärer und transmembranärer Domäne zu Cystein mutiert werden, wie durch das rote C dargestellt. Anschließend muss bestimmt werden, ob dieser Rest mit einem cysteinreaktiven Fluorophor markiert werden kann. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin zu prüfen, ob die Cystein-Mutagenese und/oder die Markierung mit dem Fluorophor die Kinetik und/oder den konformationellen Zustand des Proteins beeinflusst.

Dies erfolgt mithilfe des dargestellten Aufbaus. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Änderungen der Fluoreszenzintensität mit den kinetischen Parametern des Zielproteins zu vergleichen und gegenüberzustellen. Hier ist ein typischer Fluoreszenzverlauf dargestellt.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, mutierte Cysteinpaare entweder mit Donor-Fluor vier oder Donor-Akzeptor-Fluor vier zu markieren, um Photodestruktionsraten in Kombination mit Spannungsklemmmessungen zu messen und so Abstandsvorgaben zu bestimmen. Diese Abbildung zeigt Donor-Photodestruktionsraten in Abwesenheit des Akzeptors in Schwarz; Donor-Photodestruktionsraten in Gegenwart des Akzeptors sind in Rot dargestellt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Änderungen der Fluoreszenzintensität, die auf konformationelle Proteinänderungen zurückzuführen sind, über die Spannungsklemmfluorimetrie mit der Funktion von Membranproteinen korreliert werden können.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet des membranvermittelten Ionen­transports beantworten, beispielsweise wie Änderungen im konformationellen Zustand des Proteins den Transport kleiner Moleküle und Ionen über die Plasmamembran erleichtern. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Natrium-Kalium-Pumpe in einen für die Expression in Xenopus-Oozyten geeigneten Vektor klonen. Der nächste Schritt besteht darin, Cystein-Mutationen an Aminosäureresten vorzunehmen, die an der Grenzfläche zwischen den transmembranen und den extrazellulären Domänen liegen, wie im begleitenden Artikel beschrieben.

Überprüfen Sie nach Abschluss die Einfügung der Mutation durch DNA-Sequenzierung, nachdem die Plasmid-DNA wie im begleitenden Artikel beschrieben in mRNA transkribiert wurde, und quantifizieren Sie die Ausbeute an mRNA mithilfe eines Spektrophotometers vor der Operation. Der Frosch sollte 12 Stunden lang nüchtern gehalten werden, um Erbrechen während des Eingriffs zu verhindern. Um die Operation am folgenden Tag zu beginnen, tauchen Sie den Frosch in die Anästhetikalösung, bis er nicht mehr auf einen Zehenquetschreiz reagiert.

Nehmen Sie den Frosch aus der Anästhesielösung und legen Sie ihn mit der dorsalen Seite nach unten auf die saugfähige Seite eines Windelauflagen. Legen Sie ein feuchtes Papiertuch auf den Frosch, um diesen feucht zu halten. Falls die Augen des Frosches geöffnet sind, halten Sie sie zusätzlich mit Kochsalzlösung feucht.

Führen Sie einen kleinen Schnitt entlang der Bauchmitte auf einer Seite des Frosches durch. Lokalisieren Sie den Eierstock und bringen Sie ihn nach außen. Vermeiden Sie es, den Eierstock mit der Haut in Berührung zu bringen.

Entfernen Sie den Eierstock und legen Sie ihn in eine Petrischale, die Ringer-Lösung enthält. Überprüfen Sie das verbleibende Gewebe auf Blutungen, bevor Sie es wieder in die Bauchhöhle zurücklegen. Wenn eine Blutung auftritt, üben Sie mit einem sterilen Wattestäbchen Druck aus, bis die Blutung gestoppt ist.

Schließen Sie die Operation durch Vernähen des Schnitts mit einem unterbrochenen Nahtmuster ab. Bringen Sie den Frosch zurück in seine Unterbringung, um sich von der Anästhesie zu erholen, und verwenden Sie dazu eine Schere. Teilen Sie den isolierten Ovariallappen in kleinere Teile auf.

Überführen Sie die Klumpen in Ringer-Lösung mit Calcium und Kollagenase. Anschließend schütteln Sie die Verdauungslösung zwei Stunden lang vorsichtig bei 18 Grad Celsius. Wenn sich die meisten Zellen gelöst haben, waschen Sie die Oozyten mit Ringer-Lösung ohne Calcium.

Anschließend inkubieren Sie die Oozyten 10 Minuten lang in Ringer-Lösung ohne Calcium bei Raumtemperatur. Danach waschen Sie die Zellen gründlich in Ringer-Lösung mit Calcium. Überführen Sie die Oozyten anschließend zur Lagerung vor der Injektion in Ringer-Lösung mit Calcium.

Für den nächsten Schritt holen Sie die synthetisierte mRNA aus dem minus 20 Grad Celsius kalten Gefrierschrank. Geben Sie 25 Nanogramm der mRNA auf ein Endvolumen von 50 Nanolitern. Injizieren Sie anschließend die mRNA in die Zellen nach der Injektion.

Legen Sie die Oozyten in Ringer-Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter Gentamicin und inkubieren Sie sie drei bis sieben Tage bei 18 Grad Celsius im Dunkeln. Dadurch wird die Expression der Natrium-Kalium-Pumpe in der Plasmamembran der Oozyten ermöglicht. Am Tag des Experiments nehmen Sie die Oozyten aus dem Inkubator und geben sie 45 Minuten lang in Pufferlösung zum Beladen und anschließend 45 Minuten lang in Pufferlösung nach dem Beladen.

Dadurch steigt die intrazelluläre Natriumkonzentration, was die Messung der Natrium-Kalium-Pumpe erleichtert. Für Fluoreszenzmessungen inkubieren Sie die Zellen in einem Nachlade-Puffer, der fünf Mikromolar des gewünschten Fluorophors, wie TMRM oder FM, enthält, für fünf bis 10 Minuten im Dunkeln. Nach der Flora-Vier-Markierung waschen Sie die Oozyten gründlich mit farbstofffreiem Nachpuffer.

Bewahren Sie die Oozyten im Dunkeln auf, um eine Photobleiche zu verhindern. Um die Messungen mit der Zwei-Elektroden-Spannungs-Klamme vorzubereiten, füllen Sie zunächst die Mikroelektroden mit dreimolarer Kaliumchloridlösung und prüfen Sie den Widerstand. Der Widerstand sollte zwischen 0,5 und 1,5 Megaohm liegen.

Für Cystein-Scanning-Experimente rüsten Sie das Fluoreszenzmikroskop mit einem 535 DF 50 Anregungsfilter, einem 565 EFLP Emissionsfilter und einem 570 DRLP Dichroikspiegel aus. Platzieren Sie anschließend das Oozyt in einer RC-10-Kammer auf dem Objekttisch des Fluoreszenzmikroskops. Führen Sie dann vorsichtig beide Mikroelektroden in das Oozyt ein, wobei Sie mithilfe des Verstärkers das Membranpotenzial auf einem konstanten Wert halten.

Messen Sie den Ionenfluss über die Membran, indem Sie das Protein mithilfe einer geeigneten Technik wie Lösungsaustausch oder Änderung des Membranpotentials aktivieren. Verwenden Sie für gleichzeitige Fluoreszenzmessungen eine 100-Watt-Wolframlichtquelle, um den Donorfluorophor zu excitieren, und eine pin 0 2 2, A photo DDE, um Änderungen der Fluoreszenzintensität bei fluoreszenzmarkierten Proben nach Cystein-Scanning zu detektieren.

Messen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität bei konstantem Strom unter Verwendung von Spannungsschritten, die über die P-Clamp-10-Software gesteuert werden. Ein zweiter Teil des Protokolls beinhaltet die Aufnahme von Atropiemessungen in Kombination mit Abstandsmessungen. Um den Bereich der Kappa-Quadrat-Werte zu berechnen, misst eine Atropie die relative Beweglichkeit des Fluoro-Vier aufgrund einer Rotation.

Siehe den begleitenden Artikel für Details zu den Berechnungen. Verwenden Sie zur Messung von Abstandseinschränkungen ein Holoenzym, das zwei zugängliche extrazelluläre Cysteinreste aufweist, die mit Fluoroforen markiert werden können. Geben Sie einen Puffer nach dem Beladen hinzu, der ein Mikromolar FM und vier Mikromolar TMRM enthält.

Das ist der Spender und der Akzeptor. Geben Sie Fluoro im Verhältnis vier zu einer Charge von Oozyten hinzu, jeweils ein Mikromolar FM. Das ist lediglich das fluoro des Spenders.

Vier bis zu einer weiteren Charge von Oozyten, inkubieren Sie beide Chargen von Oozyten 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Dies ermöglicht Messungen von mit einem Akzeptor-Fluorophor markierten und nicht markierten Holoenzymen. Anschließend rüsten Sie das Mikroskop mit einem 475 DF 40-Anregungsfilter, einem 530 DF 30-Emissionsfilter und einem 505 DRLP-Dichroikspiegel aus.

Danach die Oozyte in die Kammer auf dem Objekttisch des Fluoreszenzmikroskops platzieren. Unter Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Lösungsflusses die zeitliche Abhängigkeit der Spender-Bleiche in Gegenwart und Abwesenheit des Akzeptor-Farbstoffs messen. Diese Ergebnisse können verwendet werden, um den Abstand zwischen den beiden Resten der Natrium-Kalium-Pumpe unter Verwendung der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Methode zu berechnen.

Es sollten gleichzeitig Spannungsklammernmessungen mit zwei Elektroden durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Protein funktionsfähig ist. Verwenden Sie zur Mittelung der Ergebnisse der photodestruktiven Zerstörung des Donor-Fluoros vier mit der Klemm-X-Funktion in P-Klammer 10 mindestens vier OH-Standort-Aufnahmen. Um die relative Bewegung von Proteinsubeinheiten zu messen, verwenden Sie Doppel-Cystein-Konstrukte, die Akzeptor- und Donor-Fluoro-vier enthalten.

Die Fluoreszenzintensität an diesen Resten ist unempfindlich gegenüber dem Konformationszustand des Proteins und hängt nur von dem Abstand zwischen den beiden Vieren ab. Wechseln Sie als Nächstes den Filterblock im Mikroskop zu einem 4 75 a F 40 Anregungsfilter, einem 5 95 a F 60 Emissionsfilter und einem 5 0 5 DRLP Dichroischen Spiegel. Danach platzieren Sie die OI in der Kammer auf dem Objekttisch des Fluoreszenzmikroskops.

Anschließend wird der Donor mit einer 100-Watt-Wolframlichtquelle angeregt und die Fluoreszenzintensität des Akzeptors gemessen. Fluoro vier wird mithilfe einer geeigneten Methode, wie beispielsweise Spannungsbindung oder Lösungsaustausch, gemessen, wobei das Membranprotein aktiviert und gleichzeitig die Änderung der Fluoreszenzintensität erfasst wird. Diese Abbildung zeigt die Korrelation zwischen Ionentransport über die Zellmembran und Änderungen der Fluoreszenzintensität.

Die obere Spur zeigt Stromklemmmessungen in Gegenwart von Natrium-Testlösung und Kalium-Testlösung mit jeweils 10 Mikromolar und 10 Millimolar Ing. Die untere Spur zeigt die gleichzeitig mit den Stromklemmmessungen gemessenen Änderungen der Fluoreszenzintensität. Diese Abbildung zeigt zwei Oozyten, die mit TMRM, dem Akzeptorfluorophor, markiert sind.

Die Oozyte links exprimiert das Wildtyp-Natrium-Kalium-ATPase, während die Oozyte rechts Natrium-Kalium-ATPase mit einer zugänglichen Cysteinrest exprimiert. Die oberen Spuren dieser Abbildung zeigen transiente Stromdaten nach einem Spannungspuls. Die unteren Spuren zeigen Echtzeitaufnahmen von Fluoreszenzintensitätsänderungen nach einem Spannungspuls.

Diese Abbildung zeigt die Zeitabhängigkeit der Photobleiche; die photochemische Zerstörung des Donors wird in Abwesenheit und Gegenwart des Akzeptorfluorophors gemessen. Die Photobleiche erfolgt schneller ohne Akzeptorfluorophor. Jede Kurve stellt den Durchschnitt von vier Aufzeichnungen an verschiedenen Stellen dar. Diese Abbildung zeigt die relative Bewegung von Untereinheiten bei konformationellen Änderungen.

Die Änderungen der Fluoreszenz sind in den roten Spuren dargestellt und der Stromfluss in den schwarzen Spuren. Eine Zunahme der Fluoreszenzintensität, die links gezeigt wird, weist darauf hin, dass sich die Flora-Floors einander nähern. Keine Änderung der Fluoreszenzintensität, wie in der Mitte dargestellt, zeigt an, dass der Fluor-Vier-Abstand unverändert bleibt.

Ein Rückgang der Fluoreszenzintensität, der rechts dargestellt ist, weist darauf hin, dass sich die Fluor-Vierer weiter voneinander entfernen, während dieses Verfahren durchgeführt wird. Es ist wichtig, daran zu denken, Änderungen der kinetischen und stationären Fluoreszenzintensität mit den konformationellen Veränderungen des Proteins zu korrelieren.