Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Wir beschreiben eine Methode, die die Kinetik von Ionen-Transport von Membranproteinen Maßnahmen neben site-spezifische Analyse von Konformationsänderungen mittels Fluoreszenz an einzelnen Zellen. Diese Technik ist anpassungsfähig an Ionenkanälen, Transportern und Ionenpumpen und kann genutzt werden, um Einschränkungen bei den Protein-Untereinheiten zu bestimmen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bestätigungsdynamik von Membranproteinen durch ortsgerichtete Fluoreszenzmarkierung auf der Oberfläche einzelner Zellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst einzeln mutierte Reste an der Grenzfläche der extrazellulären und Transmembrandomäne zu Cystin (siehe rot) C.It dann notwendig ist, um zu bestimmen, ob dieser Rest mit einem Cystin reagierenden Fluorvier markiert werden kann. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, zu untersuchen, ob Cystin, Mutagenese und/oder Fluor-Vier-Markierung die Kinetik und/oder den Bestätigungszustand des Proteins beeinflussen.

Dies wird mit dem gezeigten Setup durchgeführt. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Änderungen der Fluoreszenzintensität mit den kinetischen Parametern des Zielproteins zu vergleichen und gegenüberzustellen. Hier ist eine typische Fluoreszenzspur dargestellt.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, mutierte Cysteinpaare entweder mit Donor-Fluor-Vierern oder Donorakzeptor-Fluor-Vieren zu markieren, um die Photozerstörungsraten in Verbindung mit Spannungsklemmenmessungen zu messen und Abstandsbeschränkungen zu bestimmen. Diese Abbildung zeigt die Photozerstörungsraten von Spendern in Abwesenheit eines Akzeptors in Schwarz, die Photozerstörung von Spendern in Gegenwart von Akzeptor ist in Rot dargestellt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Änderungen der Fluoreszenzintensität, die das Ergebnis von Änderungen der Proteinbestätigung sind, durch Voltage-Clamp-Fluorometrie mit der Funktion des Membranproteins korreliert werden können.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Membranionentransports zu beantworten, z. B. wie die Änderungen des Bestätigungszustands des Proteins den Transport kleiner Moleküle und Ionen durch die Plasmamembran erleichtern. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Natrium-Kalium-Pumpe in einen Vektor klonen, der für die Expression von Xop-Posten, Lavis-Oozyten, geeignet ist. Der nächste Schritt besteht darin, Cystein-Mutationen an Resten vorzunehmen, die sich an der Grenzfläche zwischen der Transmembran und den extrazellulären Domänen befinden, wie im begleitenden Artikel beschrieben.

Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie die Insertion der Mutation durch DNA-Sequenzierung nach der Transkription der Plasma-DNA in mRNA, wie im begleitenden Artikel beschrieben, und quantifizieren Sie die mRNA-Ausbeute mit einem Spektralphotometer vor der Operation. Der Strahl sollte 12 Stunden lang nüchtern werden, um Erbrechen während der Operation zu vermeiden. Um die Operation am nächsten Tag zu beginnen, tauchen Sie den Strahl in die Narkoselösung, bis der Strahl nicht mehr auf ein Zehenklemmen reagiert.

Nehmen Sie den Frosch aus der Anästhesielösung und legen Sie ihn mit der Rückenseite nach unten auf die saugfähige Seite einer Windelunterlage. Lege ein feuchtes Papiertuch auf den Frosch, um ihn feucht zu halten. Auch wenn die Augen des Frosches offen sind, halten Sie sie mit Kochsalzlösung feucht.

Mache einen kleinen Schnitt auf einer Seite der Mittellinie des Frosches. Lokalisiere den Eierstock und bringe ihn an die Außenseite des Frosches. Vermeiden Sie es, den Eierstock mit der Haut zu berühren.

Entfernen Sie den Eierstock und legen Sie ihn in eine Petrischale, die Ringerlösung enthält. Überprüfen Sie das verbleibende Gewebe auf Blutungen, bevor Sie es wieder in die Smic-Höhle legen. Wenn Blutungen auftreten, üben Sie mit einem sterilen Wattestäbchen Druck aus, bis sie aufhören.

Beenden Sie die Operation, indem Sie den Schnitt mit einem unterbrochenen Nahtmuster vernähen. Bringen Sie den Strahl mit einer Schere in sein Gehäuse zurück, um sich von der Narkose zu erholen. Teilen Sie den isolierten Eierstocklappen in kleinere Teile.

Übertragen Sie die Klumpen in Ringerlösung plus Kalzium mit Kollagenase. Schütteln Sie anschließend die Aufschlusslösung zwei Stunden lang vorsichtig bei 18 Grad Celsius. Wenn die meisten Zyten getrennt sind, waschen Sie die Eizellen mit Ringerlösung minus Kalzium.

Dann inkubieren Sie die Eizellen 10 Minuten lang in Ringerlösung minus Kalzium bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zyten zu diesem Zeitpunkt gründlich in Ringern plus Kalziumlösung. Übertragen Sie dann die Eizellen in Ringerlösung plus Kalzium zur Lagerung vor der Injektion.

Für den nächsten Schritt holen Sie die synthetisierte mRNA aus dem minus 20 Grad Celsius warmen Gefrierschrank. Fügen Sie 25 Nanogramm der mRNA zu einem Endvolumen von 50 Nanolitern hinzu. Injizieren Sie dann nach der Injektion die mRNA in die Zyten.

Legen Sie die Eizellen in Ringerlösung und ein Milligramm Gentamicin pro Milliliter und inkubieren Sie sie bei 18 Grad Celsius im Dunkeln für drei bis sieben Tage. Dadurch kann die Natrium-Kalium-Pumpe in der Plasmamembran der Eizelle exprimiert werden. Am Tag des Experiments werden die Eizellen aus dem Inkubator entnommen und für 45 Minuten in den Ladepuffer und dann für 45 Minuten in den Nachladepuffer gelegt.

Dadurch wird die intrazelluläre Natriumkonzentration erhöht, um die Messung der Natrium-Kalium-Pumpe zu erleichtern. Für Fluoreszenzmessungen inkubieren Sie die Zyten in einem Post-Loading-Puffer, der fünf Mikromolare des gewünschten Fluorophors, wie TMRM oder FM, enthält, für fünf bis 10 Minuten im Dunkeln. Waschen Sie die Eizellen nach der Etikettierung von Flora vier gründlich mit farbstofffreiem Postpuffer

Bewahren Sie die Eizellen im Dunkeln auf, um ein Ausbleichen des Lichts zu verhindern. Zur Vorbereitung auf die Messungen der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme beginnen Sie damit, die Mikroelektroden mit drei molaren Kaliumchlorid zu füllen und den Widerstand zu testen. Der Widerstand sollte zwischen 0,5 und 1,5 Megaohm liegen.

Für Cystein-Scanning-Experimente ist das Fluoreszenzmikroskop mit einem 5 35 DF 50 Anregungsfilter, einem 5 65 EFLP Emissionsfilter und einem fünf 70 DRLP diic Spiegel ausgestattet. Legen Sie dann das Oktu in eine RC 10-Kammer auf dem Fluoreszenzmikroskoptisch. Führen Sie dann beide Mikroelektroden vorsichtig in das Oktet ein, indem Sie den Verstärker verwenden, um das Membranpotential auf einem konstanten Wert zu halten.

Messen Sie den Ionenfluss durch die Membran, indem Sie das Protein mit einer geeigneten Technik aktivieren, z. B. durch Lösungsaustausch oder Änderung des Membranpotentials. Verwenden Sie für gleichzeitige Fluoreszenzmessungen eine 100-Watt-Wolframlichtquelle, um das Donorfluorophor anzuregen und den Pin 0 2 2, A Photo-DDE zu setzen, um Änderungen der Fluoreszenzintensität für die Fluoreszenzmarkierung zu erkennen. Nach dem Cystein-Scan.

Messen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität bei stationärem Strom mithilfe von Spannungsschritten, die von der P clamp 10-Software gesteuert werden. Ein zweiter Teil des Protokolls umfasst neben den Entfernungsmessungen auch Messungen der Anesatropie. Um den Bereich der Kappa-Quadrat-Werte zu berechnen, misst eine Atropie die relative Beweglichkeit der Fluoro-Vier aufgrund der Rotation.

Einzelheiten zu den Berechnungen finden Sie im begleitenden Artikel. Um Abstandsbeschränkungen zu messen, verwenden Sie ein Holo-Enzym, das zwei zugängliche extrazelluläre Cysteinreste aufweist, die mit Fluor-Vieren markiert werden können. Fügen Sie einen Post-Loading-Puffer hinzu, der ein mikromolares FM und vier mikromolare TMRM enthält.

Das ist der Spender und der Akzeptor. Fluor viert zu einer Charge Eizellen fügen nur eine mikromolare FM hinzu. Das ist nur das Spenderfluor.

Vier bis eine weitere Charge Eizellen inkubieren beide Eizellchargen 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Dies ermöglicht Messungen von Hollo-Enzymen, die mit und ohne Akzeptor Fluoro Four markiert sind. Rüsten Sie das Mikroskop anschließend mit einem 4 75 DF 40 Anregungsfilter, einem fünf 30 DF 30 Emissionsfilter und einem 5 0 5 DRLP dichroitischen Spiegel aus.

Legen Sie dann die Eizelle in die Kammer auf den Tisch des Fluoreszenzmikroskops. Die Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Lösungsflusses misst die Zeitabhängigkeit des Donorbleichens in Gegenwart und Abwesenheit der Akzeptorflora. Vier. Diese Ergebnisse können verwendet werden, um den Abstand zwischen den beiden Rückständen auf der Natrium-Kalium-Pumpe mit Hilfe von Forester's zu berechnen.

Die Messungen der Elektrodenspannungsklemme in Gleichung zwei sollten gleichzeitig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Protein funktionsfähig ist. Mit der Clamp X-Funktion in P clamp 10 wird der Durchschnitt der Ergebnisse der Photozerstörung des Spenderfluoros mit vier für mindestens vier oh-Site-Aufnahmen erreicht. Um die relative Bewegung von Proteinuntereinheiten zu messen, verwenden Sie Doppelcystein-Konstrukte, die Akzeptor- und Donor-Fluor-Vierer enthalten.

Die Fluoreszenzintensität an diesen Resten ist unempfindlich gegenüber dem Bestätigungszustand des Proteins und hängt vom Abstand zwischen den beiden Vieren ab. Tauschen Sie anschließend den Filtersatz im Mikroskop gegen einen 4 75 a F 40 Anregungsfilter, einen 5 95 a F 60 Emissionsfilter und einen 5 0 5 DRLP dichroitischen Spiegel aus. Platzieren Sie dann den OI in der Kammer auf dem Fluoreszenzmikroskoptisch.

Als nächstes wird der Donor mit einer 100 Watt Wolfram-Lichtquelle und der Fluoreszenzintensität des Akzeptors angeregt. Fluor vier wird mit einer geeigneten Methode, wie z. B. Spannungsliganden- oder Lösungsaustausch, gemessen, aktiviert das Membranprotein und misst gleichzeitig die Änderung der Fluoreszenzintensität. Diese Abbildung zeigt die Korrelation zwischen dem Ionentransport durch die Zellmembran und Änderungen der Fluoreszenzintensität

Die obere Kurve zeigt die Messungen der Stromzange in Gegenwart von Natrium-Testlösung und Kalium-Testlösung in Gegenwart von 10 Mikromolar und 10 Millimolar. Die untere Kurve zeigt Änderungen der Fluoreszenzintensität, die zusammen mit den Messungen der Stromzange gemessen wurden. Diese Abbildung zeigt zwei mit TMRM markierte Eizellen, den Akzeptor fluoro vier.

Die Eizelle auf der linken Seite exprimiert Wildtyp-Natrium-Kalium-ATPA, während die Eizelle auf der rechten Seite Natrium-Kalium-APAs mit einem zugänglichen Cysteinrest exprimiert. Die oberen Kurven dieser Abbildung zeigen transiente Stromdaten bei Spannungsimpuls. Die unteren Kurven zeigen Echtzeitaufzeichnungen von Änderungen der Fluoreszenzintensität bei einem Spannungsimpuls.

Diese Abbildung zeigt, dass die Zeitabhängigkeit der Photobleichung von Spenderfotos gemessen wird, wenn kein Akzeptor Fluor vier vorhanden ist. Die Photobleiche erfolgt schneller ohne einen Akzeptor Fluor vier. Jede Ablaufverfolgung ist der Durchschnitt von vier oh-Websiteaufzeichnungen. Diese Abbildung zeigt die relative Bewegung der Untereinheiten bei bestätigenden Änderungen.

Fluoreszenzänderungen sind in den roten Kurven und der Stromfluss in den schwarzen Kurven dargestellt. Eine Zunahme der Fluoreszenzintensität auf der linken Seite deutet darauf hin, dass die Floraböden näher zusammenrücken. Keine Änderung der Fluoreszenzintensität in der Mitte, die angezeigt wird, deutet darauf hin, dass der Abstand zwischen den Fluor-Vierern statisch bleibt.

Eine Abnahme der Fluoreszenzintensität auf der rechten Seite deutet darauf hin, dass sich die Fluor-Vierer beim Versuch dieses Verfahrens weiter auseinander bewegen. Es ist wichtig, daran zu denken, Änderungen der kinetischen und stationären Fluoreszenzintensität mit den bestätigenden Änderungen im Protein zu korrelieren.