Name: Studium der neuronalen Basis Adaptive Fortbewegung bei Insekten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Lernen Sie die Aufzeichnung motorischer Aktivität bei fixierten Stabschrecken zur Analyse neuronaler Mechanismen adaptiver Fortbewegung. Diese Methode erfasst Muskelaktivität und Tarsuskontakt gleichzeitig.

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Wir danken Michael Dubbert, Oliver Hoffmann, Hans Scharstein, Jan Sydow und Anne Wosnitza für hervorragende technische Unterstützung. Diese Studie wurde vom DFG Bu 857 / 8,10 zum AB unterstützt

1. Die Lauffläche Der schwarze Lauffläche besteht aus zwei vernickelten Messingplatten dauerhaft verbunden nebeneinander und voneinander elektrisch durch einen 2 mm breiten Streifen von 2-Komponenten-Epoxid-Kleber (UHU plus, UHU GmbH, Deutschland) isoliert direkt unterhalb der Längsachse des das Tier. Sie produzieren eine Fläche von insgesamt 13.5x15.5cm (Abbildung 1). Die Trennung der Halbebenen für linke und rechte Beine erlaubt unabhängige tarsal Kontakt Überwachung für ein einzelnes Bein auf jeder Seite. <ol><li> Die Platte ist mit einem Glycerin / Wasser-Mischung im Verhältnis von 95 Teilen Glycerin bis 5 Teilen gesättigter NaCl-Lösung für Glätte und die elektrische Leitfähigkeit zu vermitteln geschmiert; die Viskosität beträgt ca. 430cStokes (Shankar und Kumar, 1994). </li><li> Die Mischung wird direkt auf die Oberfläche aufgetragen und mit einem Stück weichem Gewebe zu einer Gesamtdicke von 0,1-0.2mm versichern verteilt. </li></ol> 2. Optische Stimulation Setup- <ol><li> Wandern Episoden sind hervorgerufen durch zwei Projektoren wie Scharstein (1989) beschrieben, um ein Streifenmuster auf zwei runden, Mattscheiben (Durchmesser 130mm, Marata Bildschirme, Linos Photonics, Göttingen, Deutschland), die in einem Abstand von ca. positioniert sind Projekts. 70mm aus den Augen, und in einem Winkel von 45 ° auf der linken und rechten vorderen Ende der Platte (Abb. 1). Die Wellenlänge des Streifenmuster wird konstant bei λ = 21 °. Der Kontrast Frequenz des bewegten Reizen kann zwischen 0,35, 0,72, 1,07 und 1.49Hz variiert werden. Da die Reaktion der Tiere hängt nur von der Frequenz ω Gegensatz / λ (ω = Winkelgeschwindigkeit, λ = Muster Wellenlänge), wenn das Muster Kontrast ist hoch genug (Fermi und Reichhardt, 1963), haben wir nicht variieren λ während der Experimente . Die Leuchtdichte der hellen Streifen an der Seite des Tieres ist ca. 15cd/m2 und der Kontrast 0,8. Das Facettenauge der Stabheuschrecke (Carausius morosus) hat 24 Ommatidien in der dorso-ventralen Achse (Friza, 1928) und ein paar mehr in der rostro-caudalen Achse. Wie der Divergenzwinkel der Stabheuschrecke Auge ist im Durchschnitt 6,2 ° (Jander und Volk-Henrichs, 1970) unser Muster Wellenlänge lag bei ca. 4-mal den Winkel der Facettenaugen. Die Experimente werden in einem abgedunkelten Faraday-Käfig gesetzt und durchgeführt in einem abgedunkelten Raum bei 20-22 ° C. </li><li> Vorwärts zu Fuß durch eine progressive Muster auf beiden Bildschirmen induziert, wo der Streifen auf jedem Bildschirm nach außen bewegen, oder eine einzelne schwarze Balken auf weißem Hintergrund zwischen den Bildschirmen platziert </li><li> Drehen wird durch Streifen Umzug in die gleiche Richtung auf beiden Bildschirmen induziert. Wir haben nicht einen Zusammenhang zwischen der Geschwindigkeit des sich bewegenden Streifen und der Winkel des Zuges gefunden. Sobald Leuchtdichte des Streifenmuster wird sich bewegen zu Fuß, es erfordert normalerweise keine weitere Einstellung, aber es kann für verschiedene Tiere nach der Spannung der Halogenlampen in den Projektoren müssen angepasst werden. </li></ol> 3. Vorbereitung der Versuchstiere <ol><li> Weibliche Erwachsene Stabschrecken (Carausius morosus) geklebt (Zahnzement, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Deutschland) Bauchseite nach unten auf eine dünne Balsa-Stick (3x5x100mm, BxHxT), die in einem Messingrohr, die mehrere Anschlüsse hat eingesetzt wird. Das Tier ist nach etwa einer Minute gehalten, bis der Leim ist zumindest teilweise gehärtet. </li><li> Der Kopf und die Beine von vorne und der Seite des Dübels ragen, um ihren freien Verkehr zu ermöglichen. Der Bereich der coxae aller Beine sowie der größte Teil des Bauches ist nach links frei von Kleber sein. </li><li> Insect Kopf, Thorax, und die distalen Enden der einzelnen Ober-und Unterschenkels sind mit fluoreszierenden Pigmenten (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Deutschland) mit Zahnzement für spätere Video Tracking gemischt markiert. </li></ol> 4. Platzierung der EMG-Elektroden Muscle Aktivität verschiedener Beinmuskeln wie in diesem Beispiel ist der Winkelmesser und Retraktor coxae Muskeln, die in den Brustkorb und verursachen protraction (Vorwärtsbewegung) und Abfahren (Rückwärtsbewegung) des Beins befinden, mit Hilfe von EMG-Elektroden aufgezeichnet implantiert in den Brustkorb. Alle EMG-Aufnahmen sind differentiell verstärkt. Das Signal wurde 100x in einem Vorverstärker (Elektronik-Workshop, Zoologisches Institut, Köln), Bandpass-gefiltert (100Hz-2000Hz) verstärkt, weiter verstärkt (10x) und importiert über einen AD-Wandler in Spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK). <ol><li> Die Elektroden sind aus beschichtetem Kupferdrähten (Elektrisola, Eckernhagen, Deutschland; 47μm Außendurchmesser). Für eine Elektrode, zwei Drähte werden zunächst mit Leim bestrichen, dann sind die beiden klebrigen Drähte miteinander verdrillt </li><li> An einem Ende der verdrillten Drahtenden sind mit einem Mini-Stecker gelötet. Am anderen Ende der Drähte geschnitten zu reinigen endet ohne Isolierung für die Insertion in das Tier geben. </li><li> Die EMG-Elektroden sind Plugged in den kleinen Stecker am Ende des Messingrohr. </li><li> Ein minuten Pin wird verwendet, um kleine Löcher in die Kutikula punch </li><li> Die abgeschnittenen Enden der Elektrode werden dann getrennt und in einen Muskel bei ca. 1mm Abstand zueinander, die in unserer Erfahrung, gibt ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Elektroden zu tief in den Muskel einzulegen, um seine Schäden zu vermeiden. Abbildung 2 zeigt die Lage der Elektroden in den Brustkorb des Tieres. Abbildung 3 zeigt ein Tier mit dem Elektrodendrähte statt. </li><li> Wir verwenden einen kleinen Tropfen histoacrylic Kleber (3M Vetbond, St.Paul, MN, USA), um die Drähte in Position zu halten. </li><li> Ein Erdungskabel ist in den Bauchraum eingeführt. </li></ol> 5. Die Aufzeichnung der Fußwurzel Kontakt Tarsal Kontakt wird immer zusammen mit EMG Spuren aufgezeichnet. Da die rutschige Oberfläche in zwei Hälften geteilt ist, können maximal zwei kontralaterale tarsal Kontakte gleichzeitig registriert werden. Zu diesem Zweck wird das Bein als "Schalter" an einen Stromkreis zwischen der Platte und der Verstärker in der Nähe verwendet. Der Strom kann auf die Platten aufgebracht werden separat durch zwei Buchsen an der Basis jeder Platte. Wir können erzeugen zwei Rechtecksignale mit 2-4mV Amplituden mit einem Impulsgeber (Model MS501-, Elektronik-Werkstatt, Zoologisches Institut, Köln), die um 90 ° phasenverschoben sind. Die Signale werden von 60dB (/ 1000) und auf die beiden Hälften der rutschigen Oberfläche. In diesem Experiment verwenden wir nur eines der beiden Signale. Es ist gleichzeitig in einen Lock-in-Verstärker als Referenzsignal zugeführt. Die 2-Phasen Lock-in-Verstärker (Elektronik-Workshop, Zoologisches Institut, Köln) selektiv verstärkt nur die Signale der gleichen Frequenz und Phase wie die bereitgestellten Referenzsignal. Ein zweiter Kanal erkennt nur die 90 °-Phase verzögerte Signal. Störsignale auf anderen Frequenzen als die Referenzfrequenz werden zurückgewiesen und haben keinen Einfluss auf die Messung. Der Verstärker-Ausgangssignal wird in einem AD-Wandler (Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK) und digitalisiert mit Spike2 zugeführt. Zwischen Touch-down-und Lift-off des Tarsus auf und von der glatten Oberfläche, fließt ein Strom von der Platte durch Tarsus und Tibia in den Kupferdraht (siehe unten: 5,3-5,8). Der gewählte Verstärker hat einen hohen Eingangswiderstand (1MΩ) und die Signalspannung ist sehr klein, um zu vermeiden, die den Fuß Verhalten des Tieres. Der Strom durch Tarsus und Tibia liegt zwischen 2 und 4NA. Das Signal Vorlaufzeit beim Touch-down zwischen dem Eintritt in die Schmier-und das Berühren der Oberfläche ist weniger als 1 ms. Der Kontakt Signalwechsel während lift-off ist weniger steil und mehr verzögert. Dies ist wegen der verspäteten Abreißen des Schmiermittels aus dem Tarsus durch eine kapillare Aufstieg Wirkung und durch die Bewegung des Beines ohne vollständige lift-off in der Schwungphase. <ol><li> Die Messing-Rohr mit dem Balsa-Stick, auf die das Tier geklebt wird in einem Mikromanipulator eingefügt, um Höhenverstellung des Tieres zwischen 7 und 12 mm oberhalb der glatten Oberfläche, die der Höhe entspricht beim freien Gehen zu ermöglichen. </li><li> Um den Stromfluss zu messen, wenn das Insekt Tarsus der überwachten Bein auf den Boden wird ein Draht (47μm Durchmesser) in etwa 15cm lange Stücke geschnitten. </li><li> Die Isolierung eines Kupfer wird durch die Verbrennung es weg mit Alkohol entfernt. </li><li> Eine Schleife wird mit einem Ende des Drahtes gebildet und rutschte über den Tarsus des Tieres </li><li> Die Schleife wird am distalen Ende der Tibia verbunden um einen guten Kontakt zwischen Tier und Draht bieten. </li><li> Der Draht wird dann auf den Brustkorb des Tieres mit einem Minus von Zwei-Komponenten-Kleber (ProTempII, siehe oben) fest, und mit dem Differenzverstärker durch eine Krokodilklemme. </li><li> Zur Verbesserung der Leitfähigkeit des Drahtes an den Enden, was einem Rückgang von Elektroden-Creme angewendet wird (Marquette Hellige, Freiburg, Deutschland) auf die Bereiche zu kontaktieren. </li><li> Die Signalstärke wird dann auf dem Monitor getestet. Aufgrund der Low-Pass-Filter-Eigenschaften des Lock-in-Verstärker (10ms Zeitkonstante) und die schrittweise lift-off/touch-down des Tarsus, wird das Signal nicht ein exaktes Quadrat-Signal. Man muss sich daher auf geeignete Schwellenwerte zu schließen, um den Übergang Punkt gesetzt, um den genauen Zeitpunkt der Fußwurzel Kontakt zu bestimmen und manuell überprüfen jedes Ereignis durch die Digitalisierung Software bestimmt. Basierend auf der Fußwurzel Kontakt, definierten wir die Zeit, als der Tarsus eines bestimmten Bein auf den Boden, als Haltung und die Zeit, wenn es in die Luft, als Schwungphase war. </li><li> Die Trigger-Signal für die Kamera ist gleichzeitig mit dem EMG-Trace und der Fußwurzel Kontakt Signal aufgezeichnet, und ermöglicht eine präzise Frame für Frame Korrelation des Verhaltens und der aufgezeichneten Spuren. </li></ol> 6. Optische Erfassung der Beinbewegungen für Digital Analysis Die Schrittfrequenz von Stabheuschrecken auf rutschigem Untergrund erreichen 3-4Hz (Graham und Cruse, 1981). <ol><li>Vor der Aufnahme Walking-Sequenzen, ist ein Spiegel in einem Winkel von 45 ° hinter dem Tier in der Lage, eine zusätzliche visuelle Überwachung für Touch-down haben. Die Kamera ist extern ausgelöst und Bilder werden in einem PC über eine FireWire-Schnittstelle eingespeist. </li><li> Wir erfassen Walking-Sequenzen von oben mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera (Marlin F-033c, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Deutschland) bei 100fps auf die Beinbewegungen digital zu analysieren und zu korrelieren sie mit EMG-Aktivität und tarsal kontaktieren. </li><li> Während der Aufnahmen zu Fuß Sequenzen, wird das Tier mit blauen LED-Arrays (30-50V DC, Leuchtdichte 24cd, Electronics Workshop, Zoologisches Institut, Universität zu Köln), die in ihrer Intensität angepasst werden, um das fluoreszierende Marker beleuchten beleuchtet. Nach Angaben der Literatur (Schlegtendal, 1934), zu tun Stabheuschrecken nicht über Farbwahrnehmung und wir haben keine negativen Auswirkungen der UV-Beleuchtung auf der Dreh-Antwort beobachtet. Ein gelber Filter vor das Objektiv der Kamera unterdrückt die kurze Wellenlänge der Aktivierung Licht und gibt einen höheren Kontrast zu den Videoaufnahmen. </li><li> Die Videodateien können analysiert mit Motion-Tracking-Software (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak Service, Berlin, Deutschland). </li></ol> 7. Aufnahme von Walking-Sequenzen <ol><li> Als Kontrolle wird zunächst ein Fuß-Sequenz mit einer intakten Tier wird aufgezeichnet. </li><li> Die Geschwindigkeit der Streifenmuster gesetzt ist, und das Muster und die Video-Aufzeichnung sind etwa zur gleichen Zeit gestartet. </li><li> Wenn das Tier nicht startet Fortbewegung spontan, kann es an den Bauch mit einem Pinsel (Bässler und Wegener, 1983), oder durch einen Luftstoß auf die Antennen stimuliert werden. In diesem Fall berührt Tiere auf der linken Seite des Bauches neigen dazu, nach links und umgekehrt. Das Streifenmuster ist in Bewegung gehalten, bis das Tier bleibt stehen oder erst nach 3 Minuten der kontinuierlichen Aufnahmen. </li><li> Um zu testen, wie weit die muskuläre Aktivität in einem Bein ist abhängig von sensorischen Input aus dem benachbarten Beinen, ist das Tier veranlasst, seine Beine autotomize. Die Website der Autotomie schließt sich natürlich innerhalb von Sekunden. Ein Beispiel für ein Tier mit autotomized Vorder-und Hinterbeinen ist in Abbildung 3 dargestellt. </li><li> Zum Beispiel für Experimente mit Tieren, die nur eine mittlere Bein, bewegen wir Autotomie der Pro-und metathoracic Beine durch Kneifen des proximalen Femurs mit einer Pinzette (Schmidt und Grund, 2003) oder schneiden Sie die Beine auf der Ebene der coxae nach der Aufnahme aus dem intakten Tier. Danach mindestens 30 Minuten für die Wiederherstellung der Zeit ist, das Tier gegeben. </li><li> Dann erfassen wir neue Walking-Sequenzen wie zuvor. In reduzierter Vorbereitungen, müssen wir oft zu induzieren Gehen mit Pinsel Striche. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Versuchsaufbau; A:. Fotografie einer Stabheuschrecke über die rutschige Oberfläche angebunden, mit fluoreszierenden Pigmenten für Bein-Tracking markiert und verdrahtet für EMG-Aufzeichnung und Fußwurzel berührungslose Messung. B: Schaltplan für Dual Bein tarsal Kontakt Aufnahme während des Gehens auf der rutschigen Oberfläche. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Positionen für die Platzierung der EMG-Elektroden in den Winkelmesser und Rückziehmuskeln in den Brustkorb des Stabheuschrecke Mitte Bein. ML: Mitte Bein; FL: Vorderbein <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> . Abbildung 3 Stabheuschrecke mit EMG Drähte in der Pro-und Rückziehmuskeln des mittleren Bein statt; Vorder-und Hinterbeine wurden entfernt, um die Wirkung der Anwesenheit von benachbarten Beine auf die Kinematik und die Muskelaktivität des mittleren Beine Studie in der reduzierten Vorbereitung. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Beispiel Spur Retraktor EMG-Aktivität mit Referenzsignal von Tarsus Kontakt in eine innere Mitte Bein während des Drehens. Zu Beginn der Spur (erste blaue Box) die Aufrolleinrichtung während der Standphase aktiv, während das Bein Bodenkontakt hat ("closed circuit"), was darauf hinweist, dass das Bein nach vorne Schritte macht, nach einer kurzen Schaltzeiten (zweiter blauer Kasten), die Retraktor ist in der Schwungphase aktiv, während sich das Bein in die Luft ("open circuit", die dritte Blue-Box), zeigt das Auftreten von rückwärts gerichteten Schritte. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Screenshot einer Aufzeichnung aus dem Winkelmesser (obere Kurve) und Haken (Mitte trace) Muskeln und die gleichzeitig aufgenommen tarsal Kontakt trace (untere Kurve). Beachten Sie die alternierende Aktivität im EMG Spuren, die die Aktivität der beiden Muskeln in den Schritt-Zyklus entspricht, ist, dass Winkelmesser Aktivität nur vor und während derSchaukel, wenn die Fußwurzel Kontakt Trace-Signale Verlust von Bodenkontakt und Retraktor Tätigkeit nach und während der Touch-down des Tarsus, wenn Bein in Position ist. Der Einschub zeigt die passenden Video-Datei entsprechend dieser Aufnahme, die verwendet werden, um das Verhalten des Tieres zu überprüfen ist.

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<li>Shankar, P. N., Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Determination+of+the+Kinematic+Viscosity+of+Glycerol-Water+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Mathematical+and+Physical+Sci%22%5BJournal%5D)">Experimental Determination of the Kinematic Viscosity of Glycerol-Water Mixtures.</a> Proc. Mathematical and Physical Sci. 444, 573-581 (1994).</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach+I.+Kinematics+and+electromyograms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach I. Kinematics and electromyograms.</a> J Neurophysiol. 83, 3323-3336 Forthcoming.</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach.+II.+Extensor+motor+neuron+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach. II. Extensor motor neuron pattern.</a> J Neurophysiol. 83, 3337-3350 Forthcoming.</li>
<li>Tsuchida, Y., Hama, N., Takahata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+telemetry+system+for+underwater+recording+of+electromyogram+and+neuronal+activity+from+non-tethered+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optical telemetry system for underwater recording of electromyogram and neuronal activity from non-tethered crayfish.</a> J Neurosci Methods. 137, 103-109 (2004).</li>
<li>Wang, H., Ando, N., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+control+of+free+flight+maneuvers+in+a+hawkmoth%2C+Agrius+convolvuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Active control of free flight maneuvers in a hawkmoth, Agrius convolvuli.</a> J Exp Biol. 211, 423-432 (2008).</li>
</ol>

Wir haben ein Setup, das ermöglicht beschrieb die optisch induzierte Generation von Drehverhalten und Genehmigungen zu einem großen Teil der Entkopplung von neuronal erzeugten Gangaktivität aus dem passiven Effekte durch die mechanische Verschiebung der andere Fuß Gliedmaßen auf dem Boden verursacht. Potenzielle Informationsfluss zwischen den Beinen durch das Nervensystem zu Bodenreaktionskräfte oder tarsal Kontakt auf der anderen Seite ist noch möglich und erlaubt es dem Forscher, den Einfluss solcher Informationen in die verkürzte Vorbereitungszeit zu studieren. Wesentliche Vorteile der rutschigen Oberfläche Setup gehören, dass die Tiere eine sehr hohe Tendenz zu gehen, und im Gegensatz zu Fuss oder Treten auf einen Tretrad, kann das Tier Schwung-und Standphase Bewegungen in alle Richtungen der natürliche Gehen durchführen zu zeigen. Darüber hinaus ermöglichen die Freiheitsgrade für alle die Beine des Tieres zu Kurve gehen, ob es eine intakte oder semi-intakten Präparat durchzuführen. Weil die Beine können nicht passiv bewegt einfach durch die Vorwärtsbewegung des Tieres oder die Bewegung des Substrats unter spiegelt jede Bewegung der Motorleistung des Beines (Cruse, 1976; Graham und Wendler, 1981). Das Setup ist sehr gut geeignet, um die neuronalen Grundlagen von adaptiven Verhaltensweisen wie Drehen oder vorwärts vs rückwärts gehen zu untersuchen, weil man elektrophysiologischen Ableitungen der motorischen Aktivität mit der Analyse der Bewegung des Körpers Kinematik kombiniert werden können. Wir nutzten die Stabheuschrecke ist optomotorischen Reaktion auf Fuß zu entlocken. Die Antworten der Tiere auf die rotierende Streifenmuster zeigen ihre Bereitschaft zur Kurve zu Fuß, während über die rutschige Oberfläche angebunden durchzuführen. Die meisten überraschend für uns, einzelne Beine in einbeinige Präparate zeigen qualitativ das gleiche Bewegungsmuster wie im intakten Tier. Wir haben also Grund zu der Annahme, dass die Kontrolle der Kurve gehen kann weitgehend ohne Funktion koordiniert sensorischen Input aus dem benachbarten Beine. Es wird wichtig sein, in weiteren Experimenten, ob die Aktivität der Motoneuronen des entfernten Beinen wird auch durch die optomotorischen Muster beeinflusst zu testen. Das Setup kann leicht modifiziert werden, um die Untersuchung von anderen Aufgaben, wie gerade vorwärts und rückwärts gehen, indem Sie einen einzigen Streifen vor dem Tier oder leichtes Ziehen der Antennen zu ermöglichen. Die präzise Messung der Bodenkontakt ermöglicht es uns, Muskelaktivität und Beinstellung zu korrelieren. Die hohe zeitliche Auflösung dieses elektrischen Kontakts Signal ist besser als 1 ms und führt uns zu einer neuen Einsicht in das Timing der Umstellung von Swing bis Standphase. Die Auflösung ist schlimmer für die Haltung, den Übergang durch die Verzögerung in Scherung der Durchführung Schmiermittel Schaukel und ein Mangel an Notwendigkeit einer vollständigen Abheben während protraction auf der rutschigen Oberfläche. Dennoch ist das Wissen über die präzisen Schwung zu Haltung Übergang ein besonders nützlicher erster Schritt, wenn wir die Mechanismen verstehen wollen, dass die Kontrolle Muskel Timing und die koordinierten Aktivitäten der Beinmuskulatur in verschiedenen Verhaltens-Zusammenhängen (siehe auch: Büschges et al, 2008;. Büschges &amp; Gruhn 2008). Als Beispiel haben wir den Haken und Winkelmesser coxae Muskeln des mittleren Bein und präzise korreliert seine Tätigkeit mit dem Wechsel von Swing bis Standphase während wir gleichzeitig überwacht die Verhaltens-Kontext, in dem das Bein verwendet wurde. Zu diesem Zweck induzierte wir zu Fuß und nahm die Muskelaktivität kontinuierlich. Ein bestimmtes Bein kann eine innere oder eine externe Bein, je nach Drehrichtung. In die Vertiefung mittleren Schenkel, als eine innere Bein im funktionellen Sinne, ist festzustellen, dass Retraktor und Winkelmesser Muskeln arbeiten beide als funktionelle Haltung Muskeln, weil das Bein zeitweise produziert Rückschritte zusätzlich nach vorne gerichtet Schritte werden (siehe Abb. 4 ). Die Elektromyogramme (EMG) von beiden Muskeln waren gleichgerichtet und normiert auf die Zeit der Touch-down und die Latenz des ersten Muskel Spikes berechnet wurde. Interessanterweise um die Latenzen der beiden Muskeln in Bezug Lift-off-und Touch-down auf die Funktion des Muskels als jeweilige Schaukel oder Haltung Muskeln (siehe Abb. 4) und nicht auf den Muskel selbst ab, und zeigen nur geringfügige Änderungen in der Timing der Aktivität Beginn. Die meisten Erklärungen für die Veränderung des Zustandes von Swing bis Haltung annehmen, dass sensorische Signale von Tarsus Kontakt auslösen Beginn der Haltung. Die interessante Frage, wie die kurzen Latenzzeiten zwischen Touch-down-und Muskelaktivität in der Stabheuschrecke sind über und unter welchen sensorischen Informationen, die sie verlassen hat kann nun mit den geänderten Setup angesprochen werden. Zusammenfassend zeigen wir eine rutschige Oberfläche Setup, die uns zuverlässig auslösen Geraden und Kurven zu Fuß in stationären Stabheuschrecken können. Kinematik, Muskelaktivität und das Timing der Fußwurzel Touch-down-und-off Aufzug überwacht werden können und korreliert in den beiden unterschiedlichen Verhaltens-contexts zur gleichen Zeit. Dies gibt uns ein hervorragendes Werkzeug, um die detaillierten Zusammenhang zwischen Muskelaktivität und Verhaltensstörungen Rahmen für ein einzelnes Bein sowie in der intakten Tier-und die zugrunde liegenden Mechanismen zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Zweikomponenten-Epoxidharzkleber</td><td>UHU plus, UHU GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasscheiben (Durchmesser 130 mm)</td><td>Linos Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zement für zahnmedizinische Provisorien</td><td>ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Deutschland</td><td>3M Id: 70-2011-0358-0 Artikelnummer: 46430</td><td>Erhältlich über 3M (&lt;a href=&quot;http://www.3m.com/">http://www.3m.com/&lt;/a&gt;) oder zahnmedizinische Händler</td></tr><tr><td>fluoreszierende Pigmente</td><td>Dr. Kremer Farbm&amp;uuml;hle, Aichstetten, Deutschland</td><td>Kat.-Nr.: z. B. 56200 Fluoreszierendes Pigment Goldgelb, 56350 Fluoreszierendes Pigment Flammenrot</td><td>&lt;a href=&quot;http://kremer-pigmente.de/en">http://kremer-pigmente.de/en&lt;/a&gt; oder &lt;a href=&quot;http://www.kremerpigments.com/">http://www.kremerpigments.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Histokryl-Kleber</td><td>3M</td><td></td><td>Lieferant: WPI</td></tr><tr><td>isolierte Kupferdrähte</td><td>Elektrisola Eckernhagen</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.elektrisola.com/">http://www.elektrisola.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Elektrodencreme</td><td>Marquette Hellige, Freiburg, Deutschland</td><td></td><td>Produkt ist nicht mehr erhältlich; wir schlagen beispielsweise vor: &lt;a href=&quot;http://www.grasstechnologies.com">www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Pulsgeber</td><td>Modell MS501, Elektronikwerkstatt, Zoologisches Institut, Köln, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lock-in-Verstärker</td><td>Zoologisches Institut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AD-Wandler</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorverstärker</td><td>Zoologisches Institut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Videokamera</td><td>Allied Vision Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-LED-Arrays</td><td>Zoologisches Institut</td><td></td><td>30–50 V DC, Elektronikwerkstatt&lt;br/&gt;
&amp;#955;390–395 nm&lt;br/&gt;Leuchtdichte 24 cd</td></tr><tr><td>Digitalisierungssoftware Spike2</td><td>Vers. 5.05, CED, Cambridge, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bewegungsverfolgungssoftware</td><td>Mikromak service, Berlin, Deutschland</td><td>WINanalyze, Vers. 1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

studium der neuronalen basis adaptive fortbewegung bei insekten

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studium der neuronalen Basis Laufverhalten man oft vor dem Problem, dass es schwer ist, die neuronal erzeugte Verstärkung Ausgang von den Beinbewegungen, die sich aus passiven Kräfte und Wechselwirkungen mit anderen Beinen durch den gemeinsamen Kontakt mit dem Substrat zu trennen. Wenn wir verstehen wollen, die Teil eines bestimmten Bewegung wird durch Nervensystems Motorleistung, kinematische Analyse der Step-Bewegungen erzeugt möchten, muss daher mit elektrophysiologischen Ableitungen der motorischen Aktivität ergänzt werden. Die Erfassung der neuronalen oder muskulären Aktivität in einem verhalten Tier ist oft durch die elektrophysiologischen Geräte, die das Tier in seiner Fähigkeit, mit so vielen Freiheitsgraden wie möglich bewegen können schränken begrenzt. Dies kann entweder durch Verwendung von implantierbaren Elektroden und dann mit dem Tier bewegen sich auf einer langen Leine vermieden werden (. Dh Clarac et al, 1987; Duch &amp; Pflüger, 1995; Böhm et al, 1997;. Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) oder durch die Übertragung die Daten mit telemetrischen Geräten (Kutsch et al, 1993; Fischer et al, 1996;. Tsuchida et al 2004;. Hama et al, 2007;.. Wang et al, 2008). Beide elegante Methoden, die erfolgreich in größeren Arthropoden verwendet werden, erweisen sich oft als schwierig, in kleineren Fuß Insekten, die entweder leicht verheddern in der langen Leine an oder werden durch das Gewicht der telemetrischen Gerät und seine Batterien behindert. Darüber hinaus in all diesen Fällen ist es immer noch unmöglich, zwischen der rein neuronale Grundlage der Fortbewegung und die Auswirkungen durch eine mechanische Kopplung zwischen den Laufbeinen durch das Substrat ausgeübt zu unterscheiden. Eine Lösung für dieses Problem ist es, die Experimente in Anbindung an eine Tier, das frei, um im Platz zu Fuß ist, und das ist vor Ort ausgesetzt, zum Beispiel über eine rutschige Oberfläche, die entfernt effektiv die meisten Bodenkontakt Mechanik befragen. Dies wurde genutzt, um zu entkommen Antworten (Camhi und Nolen, 1981; Camhi und Levy, 1988) Studie, Drehen (Tryba und Ritzman, 2000a, b;. Gruhn et al, 2009a), rückwärts gehen (Graham und Epstein, 1985) oder Änderungen der Geschwindigkeit (Gruhn et al., 2009b) und ermöglicht es dem Experimentator leicht an intra-und extrazellulären Physiologie mit kinematischen Analysen (Gruhn et al., 2006) zu kombinieren. Wir verwenden eine rutschige Oberfläche Setup, um das Timing der Beinmuskulatur im Verhalten Stabheuschrecke untersuchen in Bezug auf Touch-down-und Lift-off unter verschiedenen Verhaltens-Paradigmen wie geradlinig und gebogenen Fuß in intakten und reduziert die Vorbereitungen.

Wir beschreiben eine Methode, um die motorische Aktivität, zeitlich auf die elektrisch aufgezeichnet tarsal Kontakt-Signal in ein angebundenes Insekten aufnehmen, zu Fuß auf rutschigem Untergrund. Dies wird verwendet, um die neuronalen Grundlagen des adaptiven Verhaltens unter reduziertem Einfluss der mechanischen Wechselwirkungen zwischen den Beinen durch das Substrat zu studieren.

Studium der neuronalen Basis Adaptive Fortbewegung bei Insekten

Bei der Untersuchung der neuralen Grundlagen des Gehverhaltens sieht man sich oft mit dem Problem konfrontiert, dass es schwierig ist, den neuronal erzeugten Schrittausgang von jenen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Physiologie der Beinmuskulatur und deren zeitliche Abfolge sowie Kinematik bei einem am Faden gehaltenen Insekt während unterschiedlicher Gehsituationen zu analysieren. Das Stabheuschreckenartige Insekt *Carausius morosus* wird für diese Untersuchung verwendet, da es im Vergleich zu anderen Insekten relativ groß ist und deutlich voneinander getrennte segmentale Ganglien aufweist.Zunächst wird das Tier fixiert und zur fluoreszenzbasierenden Videoverfolgung markiert. Danach werden EMG-Elektroden in die Protractor- und Retraktormuskulatur eingeführt. Anschließend erfolgt die Vorbereitung des fixierten Insekts zur Aufzeichnung des Tarsalkontakts auf einer rutschigen Oberfläche.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht in der simultanen Aufzeichnung der Muskelaktivität der Beine und des Tarsalkontakts während unterschiedlicher Gehsituationen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in der Muskelaktivierungszeit zeigen. Abhängig vom Verhaltenskontext wird ein Bein verwendet im Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie der Untersuchung.Beim Gehen auf Trek-Bällen entfällt die mechanische Kopplung über den Boden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der motorischen Kontrolle zu beantworten, beispielsweise welchen Beitrag ein einzelnes Bein beim Gehen eines mehrbeinigen Tieres leistet. Die Implikationen dieser Technik eröffnen das Forschungsfeld des adaptiven lokomotorischen Verhaltens, da wir nun Veränderungen der Gehgeschwindigkeit und der Gehrichtung auf Ebene des einzelnen Beins untersuchen können, wobei die Einrichtung der Versuchsanordnung im Vordergrund stehen wird.Peter Boha, ein Techniker in meinem Labor, zwei fest miteinander verbundene, nickelschichtige Messingplatten, die durch einen zwei Millimeter breiten Streifen aus zweikomponentigem Epoxidharz gegeneinander isoliert sind. Das Epoxidharz wird verwendet, um die rutschige Lauffläche für das Tier herzustellen; jede Hälfte der Platte wird separat mit einer elektrisch leitfähigen Glycerin-Salz-Lösung unter Verwendung eines weichen Tuchs eingefettet. Bei korrekter Anwendung sollte die Lösung zwischen 0,1 und 0,2 Millimeter dick sein und eine kinematische Viskosität der Oberfläche von etwa 430 Zentistokes erzeugen.Zwei runde Mattscheiben aus Glas sind vor der Platte so positioniert, dass sie während eines Experiments 70 Millimeter von den Augen des Tieres entfernt sind. Wenn ein sich bewegendes gestreiftes Muster auf diese Scheiben projiziert wird, beginnt das Tier, nach vorne zu laufen. Das Laufen wird durch ein fortschreitendes Muster auf beiden Scheiben ausgelöst, bei dem sich die Streifen nach außen bewegen, oder durch einen einzelnen schwarzen Balken auf weißem Hintergrund, der zwischen den Scheiben platziert wird und längere geradlinige Laufsequenzen hervorrufen kann.Wenn beide progressiven Streifenmuster in dieselbe Richtung bewegt werden, wird eine Drehung ausgelöst. Sobald der experimentelle Aufbau zusammengestellt ist, kann das Tier für ein Experiment vorbereitet werden, indem ein erwachsenes weibliches Stabheuschreckenweibchen mit Zahnzement am ventralen Ende nach unten auf einen dünnen Holzstab fixiert wird, der an einem Messingrohr mit einer Hülse befestigt ist. Kopf und Beine ragen dabei nach vorne und an den Seiten heraus, um ihre freie Bewegung zu ermöglichen.Anschließend werden fluoreszierende Pigmente, die mit Zement gemischt sind, verwendet, um den Kopf, das Thorax sowie das distale Femur und Tibia jedes Beins zur späteren Videoverfolgung zu markieren. Die Muskelaktivität des Tieres wird mithilfe implantierten EMG-Elektroden im Thorax aufgezeichnet.Das Signal wird im Vorverstärker 100-fach verstärkt und anschließend 10-fach verstärkt sowie zwischen 100 Hertz und 2000 Hertz gefiltert, bevor es in ein digitales Signal umgewandelt wird. Die Elektroden bestehen aus zwei beschichteten Kupferdrähten, die mit Klebstoff bestrichen, dann umeinander verdrillt werden. Ein Ende des verdrillten Drahts wird an einen Ministecker gelötet, das andere Ende wird abgeschnitten, und mit einer feinen Nadelpunze werden kleine Löcher in die Cuticula gestanzt, durch die die Elektrode geführt wird. Um Kontakt mit den Muskeln herzustellen, wird der Ministecker an einem Ende des Drahts in die Buchse gesteckt, die an dem Messingrohr befestigt ist, an dem das Tier fixiert ist.Führen Sie das abgeschnittene Ende einer Elektrode durch das Loch direkt unterhalb der Kutikula in einen Muskel ein, sodass die beiden Drähte jeder Elektrode in getrennten Löchern etwa einen Millimeter voneinander entfernt platziert werden. Um die Drähte an Ort und Stelle zu halten, verwenden wir einen kleinen Tropfen histologischen Acrylkleber. Ein weiterer Draht wird in den Hinterleib eingeführt, der als Referenzelektrode dient, um die Beziehung zwischen der Kinematik des Insektenlaufens und der Muskelphysiologie zu verstehen.Der tarsale Kontakt beim Gehen wird während der EMG-Aufzeichnung gemessen, wobei die Isolierung am Ende eines 15 Zentimeter langen Kupferdrahts mit Alkohol abgebrannt wird, um den Stromfluss durch den Tarsus messen zu können. Anschließend wird an einem Ende des Drahts eine Schlaufe gebildet, über den Tarsus des Tieres geschoben und am distalen Ende der Tibia festgezogen. Der Draht wird danach mit einem Tropfen Zahnzement am Thorax des Tieres befestigt, und der Bolzenschaft in dem Messingrohr, an dem das Tier festgeklebt ist, wird mit einem Mikromanipulator verbunden.Um eine Höhenverstellung des Tieres zwischen sieben und zwölf Millimetern über der rutschigen Oberfläche zu ermöglichen, was der Höhe des Insekts während des freien Laufens durch eine Alligatorzange entspricht, wird das andere Ende des Drahts anschließend mit dem differentiellen Lock-in-Verstärker verbunden. Auf die Kontaktstellen wird ein Tropfen Elektrodengel aufgetragen, um die Leitfähigkeit des Drahts zu verbessern. An seinen Enden wird der Stromkreis geschlossen, indem die Platte über Stecker an der Unterseite der Platte mit dem Verstärker verbunden wird.Ein Impulsgenerator erzeugt ein Signal, das über diese Stecker an beide Hälften der Platte angelegt wird. Eines der Kabel der Platte ist mit dem Verstärker verbunden und dient als Referenzsignal. Sobald das Tier positioniert ist und die Drähte angebracht sind, fungiert dessen Bein als Schalter, und ein Strom fließt durch den Tarsus, wodurch ein Stromkreis zwischen der Platte und dem Verstärker geschlossen wird.Dies erzeugt ein Signal mit einer Vorlaufzeit von weniger als einer Millisekunde beim Kontakt und ein verzögertes Signal beim Abheben. Die Signalstärke wird getestet, indem der Tarsus nach oben und unten bewegt wird. Anschließend werden die EMG-Drahtelektroden mit den Verstärkern verbunden.Das Auslösesignal für die Kamera wird gleichzeitig mit dem Tarsalkontakt und der EMG-Spur aufgezeichnet, um eine Bild-für-Bild-Korrelierung der Spuren zu ermöglichen. Nun kann eine Gehsequenz mit dem fixierten Tier und allem angebrachten Zubehör aufgezeichnet werden. Das visuelle Muster und die Videoaufnahme werden gleichzeitig gestartet, um eine visuelle Aufzeichnung der Bewegung als Kontrolle zu erstellen.Mit einer Hochgeschwindigkeitsvideokamera mit 100 Bildern pro Sekunde die Beinbewegung von oben und über einen hinter dem Tier in einem 45-Grad-Winkel angebrachten Spiegel aufzeichnen. Falls das Tier die Fortbewegung nicht spontan beginnt, kann es am Abdomen mit einem Pinsel oder an den Antennen mit einem Puffer stimuliert werden. Die Verfolgung der fluoreszierenden Markierungen am Tier kann verbessert werden, indem das Tier mit einer Anordnung blauer LED-Leuchten beleuchtet und ein gelber Filter vor das Objektiv der Kamera angebracht wird.Dies unterdrückt die kurze Wellenlänge des Aktivierungslichts und erhöht den Kontrast des Videos. Nehmen Sie zunächst die Laufsequenz des intakten Tieres als Kontrolle auf. Die Änderung der visuellen Reize verändert die Fortbewegungsrichtung. Falls gewünscht, amputieren Sie die Beine, indem Sie mit einer Pinzette den Femur abkneifen, und lassen Sie dem Tier 30 Minuten Zeit zur Erholung. Nun kann die physiologische Rolle der fehlenden Beine bewertet werden. Die Punkte auf diesem Bild zeigen die Positionen der Elektroden in den Protractor- und Retraktormuskeln des mittleren Beins an.Bei dieser EMG-Präparation wurden die Vorder- und Hinterbeine entfernt, um den Einfluss der benachbarten Beine auf die Kinematik und Muskelaktivität der mittleren Beine zu untersuchen. Die Daten dieser Spur eines sich drehenden Tieres zeigen oben die Tarsalkontaktspur, während unten die EMG-Aktivität des Retraktormuskels dargestellt ist.Während der Vorwärtsbewegungen zu Beginn der Spur ist der Retraktor in der Standphase aktiv, während der Kontakt des Beins mit dem Boden besteht. Nach einem kurzen Umschaltvorgang führt das Bein Rückwärtsbewegungen aus, und der Retraktor ist in der Schwungphase aktiv, während sich das Bein in der Luft befindet. Hier ist eine vollständige Ansicht aller gesammelten Daten, während das Tier läuft; oben ist die EMG-Aufzeichnung vom Protraktormuskel zu sehen.In der Mitte ist die EMG-Aufzeichnung der Retraktormuskulatur zu sehen, darunter das Signal des Tarsalkontakts. Im Ausschnitt sind die tatsächlichen Bewegungen des Tieres zu erkennen, die von der Hochgeschwindigkeitskamera aufgezeichnet wurden. Die wechselnde Aktivität in den EMG-Aufzeichnungen entspricht der Aktivität der beiden Muskeln im Schrittkreislauf.Der Protraktormuskel ist kurz vor und während der Schwungphase aktiv, und der Retraktor ist nach dem Aufsetzen und während der Standphase aktiv. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die Präparation in weniger als 90 Minuten durchgeführt werden, und Daten können im Anschluss über mehrere Stunden erfasst werden. Andere Methoden wie die kinematische Analyse oder Ableitungen einzelner Zellen können an einem nahezu intakten, verhaltensfähigen Tier nach der Entwicklung durchgeführt werden.Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Bewegungssteuerung geholfen, Fragen dazu zu beantworten, wie einzelne Gliedmaßen flexible und adaptive Fortbewegungsmuster erzeugen.

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