Name: Elektrophysiologie des Scorpion Peg Sensillen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Elektrophysiologie von Skorpion-Peg-Sensillen zur Untersuchung der Chemosensorik. Diese Methode mit extrazellulären Spitzenableitungen isoliert Reize einzelner Sensillen präzise.

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Wir danken dem Leben finanzieren, University of Oklahoma Undergraduate Research Opportunities Program, und dem Department of Zoology für die Finanzierung dieser Arbeit. Wir danken auch Dr. Mariëlle Hoefnagels für redaktionelle Hilfe.

1. Pre-Recording, Live Animal Vorbereitung <ol><li> Entfernen Sie den Skorpion aus dem Hause Krug und legen Sie sie in einem vorgekühlten Glasbehälter; nächstes legen Sie die jar mit dem Skorpion in einen kalten Umgebung (-5 ° C) für mindestens zwei Minuten. Diese Zeit kann je nach Alter unterschiedlich, Größe, Art, etc. der spezifischen Skorpion untersuchten. Aber im Allgemeinen ist das Einfrieren Umwelt-Phase abgeschlossen, wenn das Tier regungslos. </li><li> Nach zwei Minuten wird das immobilisierte Skorpion aus dem kalten Glas-Container, und legen Sie sie Bauchseite bis auf einen Objektträger. Sichern Sie den Stachel, Schwanz, Beine und Pedipalpen mit formbaren Ton (auf Ölbasis, Van Aken Plastalina). </li><li> Machen Sie eine Plattform, auf der der Skorpion ist Pektine kannst. Stellen Sie die Plattform der Länge und Breite je nach Größe des pecten. In der Regel sind unsere Plattformen von Mikroskop Deckglas gebaut und sind ca. 10 (L) x 18 (W) mm. </li><li> Beachten doppelseitigen Klebeband auf die pecten Plattform, Trimmen des Bandes (falls notwendig) zu montieren. </li><li> Um eine pectinal Kammer, legte drei der Plattform vier Seiten in pre-geschmolzenes Wachs (wir verwenden 100% Bienenwachs-Chips) auf eine Tiefe von 3-4 mm. Wir schmelzen das Wachs, indem sie die Chips in einer Glas-Petrischale, auf einer heißen Platte entfernt. Wenn das Wachs an den Rändern der pectinal Kammer auf Raumtemperatur abgekühlt ist, sollte diese Wände aus Wachs ca. 1 mm hohen erstellen. </li><li> Auf das Tier, suchen Sie den Punkt pectinal Einfügen, und legen Sie die un-gewachst Rand der Plattform (Bandseite-up) direkt hinter sie. Danach Stabilisierung der Plattform (so dass es später nicht mehr bewegen) durch leichten Druck seiner rechten und linken peripheren Kanten gegen den Lehm verwendet, um die Beine des Tieres zu beschränken. </li><li> Verwenden Sie spitzen Pinzette vorsichtig die pecten oder Pektine in der Kammer. Genauer gesagt, mit einer Pinzette, halten Sie die pecten entlang der pectinal Wirbelsäule und sanft bringen pecten nicht unterhalb der Glasabdeckung und senken Sie es auf den Klebstoff-Plattform Boden. Stellen Sie eine pecten-to-Tape-Bindung durch eine sorgfältige Anwendung von Druck auf die pectinal Wirbelsäule. </li><li> Jetzt bewerben geschmolzenes Wachs (wir verwenden eine vorgewärmte Metallspatel), um die un-gewachst Rand der Plattform. Der Zweck ist zwei-fach, die pecten zu sichern und vollständig umschließen die Kammer für zukünftige Mineralöl Einführung. Vorsicht beim Auftragen des Wachses über das Tier pecten, wie es möglich ist, die pecten mit Wachs zu heiß ist beschädigt. </li><li> Die pecten Kammer-Konstruktion abgeschlossen ist. Als nächstes gründen eine indifferente Elektrode Zusammenhang mit dem Tier Hämolymphe durch Einfügen eines Silberdraht zwischen zwei Heck-Segmente. </li></ol> 2. Gleichzeitige Aufnahme und extrazelluläre chemische Stimulation <ol><li> Wir bereiten das Tier 24 h vor der Durchführung extrazellulären, tip-Aufnahmen, die unter anderen Gründen (zB Tier-Anpassung an die feste Position) ermöglicht Zeit, um individuell zu Stimulans Pipetten einer bestimmten (Sensillum-abhängig) Tip-Durchmesser. Wir verwenden eine Mikropipette Abzieher für die Erreichung dieser Vorgaben. Im Idealfall ist der Durchmesser der Pipetten ≈ 2 pm größer als die sensillar Porendurchmesser. Wir passen unsere Mikropipette Spezifikationen entsprechend für jedes Tier. </li><li> 1 h vor der Aufnahme, fügen wir 5 ul Mineralöl auf die pectinal Kammer, das Eintauchen des pecten unter Öl. Dann positionieren wir das Tier unter einem Hochleistungs-Mikroskop, das lange gearbeitet hat Objektive und Auflicht. </li><li> Um chemisch anzuregen peg Sensillen stellen wir wässrigen Geschmacksstoffe (zB Zitronensäure und Salz) durch das Öl Medium. Erstens verwenden wir eine Mikropipette Füllstoff zur Stimulans in die Stimulans Pipette injiziert. Hinweis: Alle Stimulans Lösungen sollten ein Elektrolyt für die elektrische Leitfähigkeit enthalten. </li><li> Als nächstes wird nach der Positionierung des Stimulans Pipette auf einem Mikromanipulator (in der Aufnahme rig), legen Sie die Aufnahme-Elektrode in die stumpfe, offene Ende des Stimulans Pipette. Es ist wichtig, den Kontakt zwischen der metallischen Elektrode und Elektrolyt-stimulierende Lösung zu gewährleisten. </li><li> Nach der Vorbereitung ist geerdet (über die indifferente Elektrode), einfach wieder senkt die Pipette durch das Öl mittel-und auf eine sensillar Pore. Die Dauer der chemischen Stimulation pro pectinal Sensillum kann von so viel wie 30 Minuten, um so wenig wie 1 Sekunde variieren. Im Allgemeinen können wir Probe mehrere Stifte (&gt; 30) pro Pipette. Für den Fall, dass die stimulierende Pipette verstopft mit winzigen Schmutz wird, ersetzen Sie einfach die verstopfte Pipette für eine neue, unbenutzte Pipette. </li></ol> 3. Vorbereitung eines Tier für mehrere Tage der Experimente <ol><li> Wenn das Tier über einen längeren Zeitraum verwendet werden, empfehlen wir die Wiederverwendung der pectinal Kammer und Austausch der Tropfen Mineralöl für jede Aufnahme-Session. Nach einem bestimmten Tag der Aufnahme-Session beendet ist, entfernen Sie das Tier von der Recording-, und führen Sie ein Mineralöl zu waschen. </li><li> Specifically, fügen Sie einen Tropfen (5 ul) von Mineralöl in die Kammer, und alles Öl. Dies minimiert die Gegenwart von restlichem Stimulans, die aus der Pipette kann zugespielt haben während der Aufzeichnung. </li><li> Vor der nächsten Sitzung einen Tropfen Öl wie zuvor beschrieben. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Je nach dem Kontrollgerät verwendet werden (zB die besondere Verstärker, Digitalisierungs-Hardware, etc.), ist ein repräsentatives Ergebnis einer extrazellulären Aufnahme mit einem S: N-Verhältnis von mindestens 3:1. Erfolgreiche Bau der Mineralöl-Kammer ist notwendig für die Isolierung chemische Stimulation einzelner Sensillen, da sie ein Medium für die Bereitstellung von polaren (Wasser-) chemischen Geschmacksstoffe 8 bietet. Wenn es zu wenig Öl oder gar keine, wird der stimulierende Lösung aus den aufgezeichneten Sensillum zu seinen benachbarten Sensillen, die zu einem länger anhaltenden, unkontrollierten Anfall von chemischen Stimulation 8 Ursache zu verbreiten.

<ol><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+a+Primary+Chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physiology of a Primary Chemoreceptor unit.</a> Science. 12, 417-418 (1955).</li>
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<li>Carthy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure+and+function+of+the+sensory+pegs+on+the+scorpion+pecten%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten.</a> Experientia. 22, 89-91 (1966).</li>
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<li>Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tip-recording+method+to+test+scorpion+pecten+chemoresponses+to+water-soluble+stimulants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants.</a> J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.</li>
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<li>Cate, H. S., Derby, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooded+Sensilla+Homologues%3A+Structural+Variations+of+a+Widely+Distributed+Bimodal+Chemomechanosensillum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum.</a> J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).</li>
</ol>

Wir haben bereits diese Methoden in beiden Zeitschriften Knowlton und Gaffin (2009) and Knowlton und Gaffin (in press) veröffentlicht.

Das Protokoll über beschrieben, wie eine Wüste Grünland Skorpion (Paruroctonus utahensis) für elektrophysiologische Untersuchung vorzubereiten. Insbesondere zeigen wir, wie eine Kammer für die kontrollierte extrazelluläre tip-Aufnahmen von pectinal chemosensorischen Neuronen unter Öl zu bauen. Da Öl und Wasser nicht mischen, ist es möglich, chemische Stimulation (mit Wasser-basierte Stimulanzien) zu einzelnen Sensillen zu isolieren. Es sollte betont werden, dass P. utahensis, ist ein relativ kleines Tier (≈ 2,5-5 cm) und die Anwendung dieses Protokolls, um größere Tiere können viele size Anpassungen, wie zB die Größe des Tieres Plattform-, Kammer-und Ölmenge angewandt erfordern. Wir empfehlen Pilotstudien, die minimale Menge an Öl, die für kontrollierte Abgabe von Wasser-basierte chemische Stimulanzien testen. Darüber hinaus fanden wir keinen Einfluss von Öl auf der Grundlinie neuronale Aktivität innerhalb pectinal Sensillen 8. Dies sollte für andere Modellsysteme bestätigt auch sein, vor der Beurteilung chemoresponsiveness. Diese Methode kann in Verbindung mit einer anderen Methode zur chemoresponse Wechselwirkungen zwischen den Sensillen in der sensorischen Feldtest eingesetzt werden. Zum Beispiel ist es möglich, tip-Record (unter Öl) von einem Sensillum wie wir Basis-Datensatz (über eine Wolfram-Elektrode) aus einem benachbarten Sensillum 9. Eine solche Aufnahme-Konfiguration verwendet werden, um festzustellen, ob auch chemisch nicht stimulierend Sensillum beeinflusst die neuronale Aktivität der Basis-recorded Sensillum werden. Bis heute hat niemand diese für scorpion pectinal Sensillen getestet, und es bleibt eine offene Frage für andere chemosensorischen Systemen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir die Spitze-Recording-Methode unter Öl Fortschritte Rahmen der elektrophysiologischen Untersuchungen der neuronalen Basis von Arthropoden gustation. In diesem Manuskript, bieten wir ein Protokoll für die Vorbereitung Tiere für diese Methode, und wir hoffen, es bietet eine solide Grundlage für weitere Untersuchungen der peripheren sensorischen Nervensystem.

<table><tbody><tr><td>Lift-N-Press-Tab</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16082</td><td>Beidseitiges Klebeband</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G</td><td>Mikropipettenfüller</td></tr><tr><td>Standard-Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-6</td><td>Glaspipetten</td></tr><tr><td>Mikr&amp;#8211;Elektrodenhalter</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MEH3SBW10</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrophysiologie des scorpion peg sensillen

Electrophysiology of Scorpion Peg Sensilla

Wir beschreiben eine Änderung einer bestehenden tip-Aufnahmetechnik 1,2 für elektrophysiologisch untersucht kurzen, zapfenförmigen sensorischen Sensillen 3,4. Auf der Mitte der ventralen Oberfläche aller Skorpione sind zwei Anhängsel namens Pektine, die dichten Bereichen haben mechano-und chemosensorischen peg Sensillen 5,6. Eine Methode zur Beurteilung chemoresponsiveness dieser Sensillen verwendet eine Wolfram-Elektrode für extrazellulär Aufnahme neuronaler Aktivität innerhalb eines Sensillum als flüchtige Riechstoff der sensorischen Bereich 5,7 eingeführt wird. Die Grenzen dieser Methode sind langsame Datensammlung und unkontrollierte Stimulans Einführung und Entnahme aus der Zapfen Feld. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir einen neuen Tipp-Aufnahmetechnik, dass unpolare Mineralöl als Medium, durch die Wasser-Basis Geschmacksstoffe zu einzelnen peg Sensillen 8,9 zu liefern. Wir haben erfolgreich diese Methode angewendet, um sensillar chemoresponses Zitronensäure, Ethanol und Salz zu erhalten. Hier beschreiben wir die experimentelle Protokoll für eine solche Studie 9. Wir denken, diese neue Methode kann nützlich sein für die Untersuchung der Reaktion Eigenschaften von anderen Arthropoden chemosensorischen-Systeme einschließlich derer von Insekten 10, 11 und Krebstiere 12.

Dieser Artikel beschreibt eine elektrophysiologische Methode zur Isolierung chemische Stimulation einzelner Sensillen via extrazelluläre, tip-Aufnahmen unter Mineralöl.

Elektrophysiologie des Scorpion Peg Sensillen

Wir beschreiben eine Modifikation einer bestehenden Tip-Recording-Technik1,2 zur elektrophysiologischen Untersuchung kurzer, stiftförmiger sensorischer Sensillen3,4. Auf der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die chemosensorische Physiologie einzelner Pegillen auf einem Skorpion-Pectin zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein anästhesierter Skorpion mit der Bauchseite nach oben auf einem Objektträger fixiert wird. Mithilfe von Modelliermasse wird eine Halterung vorbereitet, wobei die Pectine in eine speziell angefertigte, mit Öl gefüllte Kammer eingetaucht werden, und Elektroden, die mit einem chemischen Stimulans gefüllt sind, hergestellt werden.Chemorezeptive Antworten werden an einzelnen Illa auf dem Pectin aufgezeichnet, die letztendlich ähnliche Antwortprofile auf wässrige Chemo-Stimulanzien erzeugen. Wir verwendeten die Ableitung vom Basisbereich der Illa, während wir flüchtige Stimulanzien über die Poren strömten ließen. Der Hauptvorteil der Spitzenableitungstechnik besteht darin, dass die Stimulation auf ein einzelnes Pigmentum beschränkt werden kann, ohne die Aktivität der benachbarten Strukturen zu beeinflussen.Mit dieser Methode können wir zentrale Fragen im Bereich der chemosensorischen Biologie beantworten, zum Beispiel: Warum nutzen Tiere so viele wiederholte Sillen bei der chemischen Detektion und Wahrnehmung? Skorpione scheinen möglicherweise nicht die sichersten Tiere für Studien zu sein, doch nicht alle Arten sind gefährlich oder schwer zu handhaben. Zum Beispiel sind die Wüsten-Graslandskorpione nur vier bis fünf Zentimeter lang, lassen sich leicht im Labor halten und stechen selten, wenn man sie ordnungsgemäß behandelt.Wenn Sie gestochen werden, löst das Gift künstlich Ihre Sinnesneuronen aus, von denen einige Schmerzinformationen weiterleiten. Das Gefühl lässt normalerweise nach etwa 15 Minuten nach. Skorpione sind robuste Versuchsobjekte und können mehrere Tage lang Experimenten standhalten, wobei sie oft in ihre Behausungen zurückgebracht werden.Wenn das Experiment abgeschlossen ist, um den Skorpion zu immobilisieren, legen Sie ihn in einen vorab gekühlten Glasbehälter. Danach stellen Sie das Gefäß mit dem Skorpion für mindestens zwei Minuten in eine Gefrierumgebung und nehmen es aus dem Gefrierschrank, sobald das Tier regungslos ist. Legen Sie nun den immobilisierten Skorpion mit der Bauchseite nach oben auf einen Objektträger.Befestigen Sie die Schwanzbeine und Pedipalpen mit formbarem Ton. Die Peitschenorgane der Skorpione sind paarige, kämmeförmige Strukturen in der Nähe der Geschlechtsorgane und für diese Tiere einzigartig. Es muss eine Kammer angefertigt werden, um ein einzelnes Peitschenorgan zu enthalten, ohne es vom Tier zu entfernen.Zunächst stellen Sie eine Plattform her, auf die die Pektinmasse passt, und schneiden sie auf eine Glasdeckfolie mit einer Größe von etwa fünf Millimetern mal 18 Millimetern. Das eignet sich normalerweise gut. Als Zweites befestigen Sie doppelseitiges Klebeband auf der Plattform und schneiden das Band gegebenenfalls passend zurecht.Drittens schmelzen Sie etwa 100 % Bienenwachsplättchen in einer Glaswanne mit einem Heizblock. Tauchen Sie nun drei der vier Kanten der Plattform bis zu einer Tiefe von drei bis vier Millimetern in das geschmolzene Bienenwachs. Das abgekühlte Wachs dient als Wand, um eine Kammer zu bilden.Platzieren Sie nun die nicht fixierte Kante der Plattform direkt hinter dem Ansatzpunkt der Brustflosse des Tieres. Stabilisieren Sie die Plattform, indem Sie ihre rechte und linke Außenkante vorsichtig mit einer feinen Pinzette gegen den Ton drücken, mit dem die Beine des Tieres fixiert sind. Halten Sie vorsichtig eine der Kammplatten entlang der Brustflossen-Spine fest und führen Sie sie behutsam unter dem Deckglas hervor, um sie anschließend auf den klebrigen Boden der Plattform abzulegen.Befestigen Sie das Pektin, indem Sie vorsichtig Druck auf die Pektalspine ausüben. Vervollständigen Sie die Kammer, indem Sie mit einem vorgewärmten Metallspatel geschmolzenes Wachs auf die unverklebte Kante der Plattform auftragen. Das Tier ist nun fast bereit für elektrophysiologische Ableitungen.Jetzt ist ein günstiger Zeitpunkt, um eine indifferenten Elektrodenanschluss herzustellen. Führen Sie einen Silberdraht zwischen zwei Schwanzsegmente in den Hämolymphe des Skorpions ein. Drücken Sie einen Teil des Drahtes, der aus dem Tier austritt, in den Ton, um ihn zu befestigen, und lassen Sie genügend Länge frei, um den Verstärker erreichen zu können.Stellen Sie die Präparation nun mindestens eine Stunde lang beiseite, bevor Sie die Aufnahmen durchführen, um der Präparation Zeit zu geben, sich für die Aufnahmen zu stabilisieren. Verwenden Sie einen Mikropipettenzug, um Pipetten herzustellen, deren Innendurchmesser etwa zwei Mikrometer größer ist als der Sensorporendurchmesser, der je nach Tier variiert. Eine Stunde vor der Aufnahme füllen Sie die Pektinkammer mit fünf Mikrolitern Mineralöl.Danach positionieren Sie das Tier unter dem Mikroskop mit hoher Vergr&ouml;&szlig;erung und Objektiven mit gro&szlig;em Arbeitsabstand sowie Epi-Beleuchtung, um die Pegillen chemisch zu stimulieren. F&uuml;llen Sie die Stimulationspipette mit w&auml;ssrigen Geschmacksstoffen, die in einer elektrolythaltigen L&ouml;sung gemischt sind. Befestigen Sie anschlie&szlig;end die gef&uuml;llte Stimulationspipette mithilfe eines Mikropipettenf&uuml;llers an einem Mikromanipulator.Bringen Sie nun die Ableitelektrode in das offene Ende der Stimulationspipette ein. Es ist wichtig, den Kontakt zwischen der Metallelektrode und der elektrolytischen Stimulationslösung sicherzustellen. Schließen Sie die Leitungen der Ableit- und der indifferenten Elektrode an einen Differenzverstärker an.Der Verstärker ist an ein Oszilloskop zur Visualisierung der elektrischen Aktivität und an einen Lautsprecher zur akustischen Detektion elektrischer Änderungen angeschlossen. Die Versuchsanordnung ist nun bereit, Aufnahmen durchzuführen. Senken Sie mit Hilfe des Mikromanipulators die Pipette vorsichtig auf eine Sensorpore ab.Ein Wechsel zu höheren Frequenzen ist hörbar, wenn ein elektrischer Kontakt zwischen dem Pipettenelektrolyt und der Flüssigkeit innerhalb des Peg-Sens hergestellt wird. Zu diesem Zeitpunkt sind auch die charakteristischen Knackgeräusche neuronaler Aktionspotentiale zu hören. Die Dauer der chemischen Stimulation pro Perpetual-Sens kann zwischen einer Sekunde und bis zu 30 Minuten variieren.Im Allgemeinen kann eine Pipette mehr als 30 Stifte abdecken. Ersetzen Sie verstopfte Pipetten durch saubere. Pipetten sind einfach herzustellen, und Verstopfungen treten nicht selten auf; halten Sie daher immer zusätzliche Pipetten bereit.Es ist möglich, an einem einzelnen Tier über mehrere Stunden in einer einzelnen Aufnahmesitzung zu messen, bevor das Mineralöl gewechselt werden muss. Ein einzelnes Tier kann über mehrere aufeinanderfolgende Tage hinweg für mehrere Aufnahmesitzungen in der Versuchsanordnung fixiert bleiben. Für nachfolgende Sitzungen verwenden Sie die Pektalkammer erneut, ersetzen jedoch das Mineralöl.Entfernen Sie einfach das gesamte alte Öl mit einer Pipette und geben Sie einen neuen Tropfen hinzu. Dies trägt dazu bei, das Vorhandensein von Reststimulanzien zu minimieren, die während der Aufnahmesitzung möglicherweise aus der Stimulanzienpipette ausgetreten sind. Hier sind repräsentative Spitzenaufnahmen auf verschiedene Stimulanzien. Diese Spur zeigt eine relativ konstante Reaktion auf 0,01 molares Kaliumchlorid. Die Reaktion auf 0,1 molare Zitronensäure setzt deutlich intensiver ein und nimmt innerhalb eines Bruchteils einer Sekunde an Intensität ab, gefolgt von einer Abnahme der Frequenz. Bei einer typischen Reaktion auf 30 % Ethanol zeigt die Spur Bursts mit mehreren Spikes zwischen kurzen Phasen Inaktivität. Beim Vergleich von Spitzenableitungen verschiedener Sensorreaktionen auf denselben Stimulus, wie 0,1 molare Zitronensäure, werden diese Muster sichtbar.Die Reaktionen sind sehr ähnlich. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Pipettenspitzen einen wasserbasierten Stimulus zu füllen, der sich nicht mit dem Ölmilieu vermischt und es ermöglicht, jeweils ein einzelnes Lum chemisch zu stimulieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne CIN auf einem Skorpion-Pectin kontrolliert unter Verwendung von Mineralöl als Medium stimulieren kann.

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