Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Dieses Experiment zielt darauf ab, zu definieren, ob zwei Proteine in Zellen interagieren und Aspekte der Orte dieser Interaktion abzugrenzen. Die ersten Zellen werden mit Expressionskonstrukten transfiziert, die für die beiden interessierenden Proteine kodieren, von denen eines mit dem Endterminus eines fragmentierten fluoreszierenden Proteins und das andere mit dem komplementären C-Terminus des fragmentierten fluoreszierenden Proteins fusioniert ist. Nachdem die transfizierten Zellen in Kultur ein Fluoreszenzsignal entwickeln konnten, werden die Proteinkomplexe durch Bildgebung und Immunblotting sichtbar gemacht.

Als nächstes werden die gesammelten Bilder in eine Bildgebungssoftware wie Image J exportiert. Um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Zelle in einem kontrollierten Experiment zu quantifizieren, können BIFC-Ergebnisse Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Lokalisierung dieser Komplexe demonstrieren, wie z. B. die SH drei Domänen des Gerüstproteins, die sich schneiden, und die Pro-Rich-Domäne von PI drei KC zwei beta. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Kolokalisation, Immunpräzipitation und Bünd besteht darin, dass BFC die räumliche Lokalisierung schwächerer transienter Wechselwirkungen in der Zelle ermöglicht. Und diese Methode erfordert keine umfangreiche Nachbearbeitung von Bildern, wie man sie bei bünde sieht.

Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Signaltransduktion beantworten, wie z.B. wie die DO-Proteine X und Y interagieren, und wenn ja, in welchen spezifischen Kompartimenten diese Komplexe in der Zelle lokalisiert sind? Im Allgemeinen werden Neulinge in dieser Methode Schwierigkeiten haben, weil sie nicht die richtige Konfiguration für die Durchführung ihrer Biopsie gewählt haben. Markierte Proteine von Interesse Beginnen Sie mit der Auswahl eines der zahlreichen Fluorophore für die BIFC-Fusionsproteine.

Man bedenke, dass die Amino- und Carboxy-terminalen Enden der Venus in der Lage sind, bei 37 Grad Celsius einen Komplex zu bilden, während die Y-F-P-B-I-F-C-Fragmente eine Vorinkubation bei 30 Grad Celsius erfordern. Entwerfen Sie Expressionsvektoren für die Tag-Addition an die interessierenden Proteine, indem Sie berücksichtigen, wie die Bindung der BIFC-Fragmente die Funktion der interessierenden Proteine beeinflussen kann. Zum Beispiel sind die RAs-Familie, GTP a's, am Carboxy-Terminus lipidmodifiziert und können an diesem Ende nicht markiert werden, ohne diese Modifikation zu stören.

Führen Sie immer Pilotversuche durch, um die Transfektionsbedingungen zu bestimmen. Überwachen Sie die Zellen auch durch Fluoreszenzmikroskopie, um einen optimalen Zeitpunkt für die Signalentwicklung zu ermitteln. Führen Sie dann eine westliche Blütenanalyse durch, um die gleichmäßige Ausprägung der Konstrukte zu bestätigen.

Wichtig ist, dass eine Immunfärbung für den HA- oder Flaggen-Tag durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass die Zugabe der BIFC-Fragmente die zelluläre Lokalisierung der interessierenden Proteine für jede Probenplatte nicht verändert. 1,3 mal 10 der fünf Ursachenzellen auf jeweils eine Glasbodenplatte und zwei Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte und lassen Sie die Zellen am nächsten Tag über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator absetzen. Bereiten Sie DNAs für die Transfektion durch Lipektomie oder eine andere bevorzugte Methode vor.

Zuerst verdünnen Sie die DNA in 250 Mikrolitern serumfreiem DMEM als Transfektionskontrolle. Fügen Sie CFP bei eins 50 hinzu, der Menge Ihrer gesamten BIFC-DNAs. Verdünnen Sie nun die Lippe in 250 Mikrolitern serumfreiem DMEM mit 10 Mikrolitern Lippe pro Mikrogramm DNA.

Mischen Sie die DNA und die Lippenverdünnungen und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen zweimal mit warmem, serumfreiem DMEM. Geben Sie zwei Milliliter serumfreies DMEM in jede Glasbodenplatte oder Vertiefung einer Sechs-Well-Schale.

Teilen Sie dann jede Transfektionsmischung gleichmäßig auf eine Glasbodenschale und zwei Vertiefungen mit sechs Vertiefungen auf. Inkubieren Sie die Zellen mit der Well-Platte fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie abschließend das Transfektionsmedium und ersetzen Sie es durch vollständiges DMEM plus 10%FBS-Medium.

Inkubieren Sie die Zellen für die in Pilotversuchen festgelegte Zeit, um die erforderlichen Expressionsniveaus der interessierenden Proteine zu erhalten. Untersuchen Sie die transfizierten Zellen unter einem Epi-Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass die Positivkontrolle fluoreszierend ist. Spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS für die Bildgebung lebender Zellen.

Platzieren Sie die Zellen in Medien ohne Indikatorstempel. Für die Bildgebung fixierter Zellen. 2%Para-Formaldehyd hinzufügen und 10 Minuten auf Eis legen.

Spülen Sie dann die Zellen dreimal mit PBS, das nun mit einem Milliliter PBS bedeckt ist, und lagern Sie sie im Dunkeln bei vier Grad Celsius, lyzieren Sie die Zellen sofort in der Sechs-Well-Schale. Für Western-Blot-Analysen ist es wichtig, dass alle Zellen gleichzeitig präpariert werden, so dass die Lys-Zellen repräsentativ für die Bildzellen sind. Führen Sie einen Western Blot durch, um sicherzustellen, dass die Tag-Proteine auf gleichwertigem Niveau exprimiert werden.

Bei der Bildgebung von Zellen mit einem konfokalen Mikroskop ist es wichtig, die Einstellungen während des gesamten Experiments konstant zu halten, damit die Fluoreszenz zwischen den Proben vergleichbar ist. Achten Sie darauf, einzelne Zellen abzubilden, in denen die Pixel nicht gesättigt sind. Da CFP als Transfektionskontrolle einbezogen wurde, wählen Sie nur CFP-positive Zellen für die Analyse der BIFC-Signale aus.

Quantifizieren Sie die Fluoreszenz mit Bildgebungssoftware wie Image J.Öffnen Sie Bilddateien in Image J.Go, um die eingestellten Messungen zu analysieren. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für die Fläche und den mittleren Grauwert im Messfeld. Beachten Sie, dass in diesem Beispiel venöse Bilder pseudofarben grün und CFP-Bilder pseudofarben rot waren.

Zeichnen Sie mit dem Freihandauswahlwerkzeug einen Umriss um den Rand der gesamten Zelle im CFP-Kanal, wobei Sie diesen Umriss an Ort und Stelle belassen. Wechseln Sie zum YFP-Kanal. Gehen Sie zur Analyse, messen Sie den mittleren Grauwert, der die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Zelle für jedes Bild widerspiegelt.

Zeichnen Sie einen Kreis im YFP-Kanal in einem Bereich, der keine Zelle enthält. Nehmen Sie eine Messung für diesen Bereich als Hintergrund vor. Subtrahieren Sie den Hintergrund von jedem Bild.

Um schließlich die durchschnittliche Fluoreszenzintensität für eine Zellpopulation zu berechnen, mitteln Sie den Mittelwert abzüglich des Hintergrunds für alle Zellen, die in einer Probe abgebildet wurden. Idealerweise quantifizieren Sie 60 Zellen in drei Experimenten. Das sich kreuzende Multi-Domain-Gerüstprotein reguliert das neuronale Überleben durch Regulation einer neuartigen Klasse zwei PI drei Kinase, PI drei KC zwei beta kreuzende SH drei Domänen interagieren mit der aminoterminalen Prolin-reichen Region von PI drei KC zwei beta Transfektion von VN markierten Kreuzungen mit VC markierten PI drei KC zwei beta führt zu einem Fluoreszenzsignal im YFP-Kanal, die pseudogrün gefärbt ist, was auf die Komplexbildung hinweist.

CFP, hier in rot gefärbt, wird als Kontrolle verwendet, um transfizierte Zellmutationen in der prolinreichen Domäne von PI drei KC zwei beta zu markieren, die die Co-Ausfällung von sich schneidenden und PI drei KC zwei beta das BIFC-Signal stören. Dieser Unterschied im BIFC-Signal ist nicht auf Unterschiede in der Expression des Wildtyps und der PA PI drei K-Proteine zurückzuführen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren durchführen, müssen Sie daran denken, die richtigen Kontrollen durchzuführen und die Proteinexpression zu überprüfen, um sicherzustellen, dass Unterschiede im BC-Signal auf Unterschiede in der Komplexbildung und nicht auf die Expression nach diesem Verfahren zurückzuführen sind.

Andere Techniken, wie z.B. Oberflächenplasma an Bewohnern, können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten wie: Was sind die unterschiedlichen Affinitäten dieser Komplexe zueinander?