Name: Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Erfahren Sie die orthotope Verpflanzung von Retinoblastom-Tumoren in immundefiziente Mäuse durch intravitreale Injektion kultivierter Tumorzellen. Diese Methode ermöglicht die Erforschung von Tumorbiologie und Therapieansätzen.

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Die Finanzierung für dieses Projekt wird von der Clayton-Stiftung für Forschung und die Retina Research Foundation zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung der Retinoblastom tumorspheres <ol><li> Erhalten Retinoblastom Tumor Probe unter einem IRB-genehmigten Protokoll. </li><li> Bereiten Sie frische definiert Stammzellen Medien (Neurobasal-A Media, 1x B-27 Ergänzung minus Vitamin A, 1X Nicht-essentielle Aminosäure-Lösung, 1x L-Glutamin, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF). </li><li> Mechanisch disaggregate das Tumorgewebe mit einem Skalpell mit einem Querschnittsthema Technik in eine sterile, Gewebekultur-behandelten 6-Well-Platte. Sofort im 100 L definiert Stammzellen Medien, um das Gewebe und sanft verteilen das zerkleinerte Gewebe mit dem Skalpell. 5 ml definiert Stammzellen Medien zum Brunnen. </li><li> Bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator und inspizieren täglich. Einige tumorspheres sollte aus dem gestörten Tumorgewebe fast sofort entstehen, mit steigenden Zahlen im Laufe von 2-4 Tagen. </li><li> Wöchentlich, Zentrifuge tumorspheres bei 300xg für 5 Minuten in frisch zubereiteten definiert Stammzellen Medien resuspendieren und Pipette nach oben und unten 10 mal größeren, zentral nekrotischen Bereichen zu stören und damit neue, gesunde Kugeln zu bilden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Tumorzellen zur Injektion <ol><li> Sollte das Spritzen kultivierten tumorspheres vorsichtig pipet Kugeln in einem 15-mL konischen Rohr. Vorsichtig pipet oben und unten mit einer serologischen Pipette 10-15 Mal auf die Bereiche zu stören. </li><li> Zählen Sie die Zellen injiziert mit einer Hämazytometer und aliquoten mindestens 50.000 Zellen pro Injektion in ein neues Röhrchen werden. Bereiten Sie sich auf so viele Injektionen wie möglich auf die Anzahl der Zellen Verfügung stehen. </li><li> Zentrifuge bei 300xg für 5 Minuten. Vorsichtig absaugen den Überstand und resuspendieren in 5 ml PBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Aspiration und resuspendieren in 10 ul PBS pro Injektion. </li></ol> 3. Vorbereitung der Tiere <ol><li> Mit einer Insulin-Spritze verabreichen eine intraperitoneale Injektion von Nagetier Anästhesie-Cocktail (Ketamin 37,6 mg / ml, 1,92 mg Xylazin / ml, Acepromazin 0,38 mg / mL) bei 1 mL pro Gramm Körpergewicht (GBW). Warten Sie 5 Minuten für das Tier zu werden sediert. Überprüfen Sie Herzschlag und Ort des Tieres auf einem Heizkissen. Halten Sie Tiere auf einem Heizkissen jederzeit bis zur Genesung. </li><li> Nach Sedierung, verwalten 1 Tropfen Proparacain HCl auf dem rechten Auge. Ersetzen Tier auf Heizkissen und 1 Minute warten. </li><li> Verwalten 1 Tropfen Phenylephrin HCI auf dem rechten Auge. Ersetzen Sie das Tier auf dem Heizkissen und 5 Minuten warten. Wenn Erweiterung der Pupille nicht aufgetreten ist, erneut zu verwalten 1 Tropfen und weitere 5 Minuten warten. </li><li> Monitor auf Anzeichen von Bewegung oder Zuckungen, die bei&gt; 30 Minuten nach der Sedierung auftreten können. Auf den ersten Anzeichen für eine Bewegung, zu verwalten 1 ul / GBW von Ketamin HCl (verdünnt auf 10 mg / mL in PBS) und 5 Minuten warten. </li></ol> 4. Die Injektion von Tumorzellen <ol><li> Setzen Sie den narkotisierten Tier unter dem Mikroskop auf seiner Seite, mit dem rechten Auge nach oben und mit dem Kopf auf Gaze und zentriert um eine rote Reflex des rechten Auges Fundus (Schüler sollten in dieser Zeit erweitert werden) zu erhalten, wenn durch das Mikroskop beobachtet . </li><li> Prop bis die richtige Welt, indem Sie vorsichtig nach unten drücken gleichzeitig mit zwei Fingern auf den Augenlidern und halten Sie diese Position stetig für den Rest des Verfahrens. </li><li> Mit einer sterilen 30-Gauge-Nadel an einem Luer-Lock-Spritze, die Welt durchdringen seitlich durch die Bindehaut und Sklera neben dem Limbus corneae im Bereich der Pars plana (Abb. 1) und nur durch die Aderhaut in den Glaskörperraum. Entfernen Sie die Nadel aus der Öffnung. </li><li> Sterilisieren Hamilton Nadel mit einem Alkoholtupfer. Zeichnen Sie die Zellsuspension in die Hamilton-Spritze und die Nadel in die Öffnung, bis die Nadel wird visualisiert durch das Mikroskop hinter der Linse in den Glaskörper in der Nähe der Netzhaut. Mit Hilfe einer zweiten Person, während die Nadel ständig in dieser Position, drücken Sie den Kolben langsam. Entfernen Sie die Nadel. Falls erforderlich, verwenden Sie ein Wattestäbchen keine Flüssigkeit aus der Öffnung zu absorbieren. </li><li> Vorsichtig den Druck aus den Augenlidern, die Maus Augenlider zu schließen. </li><li> Verwalten 1 Tropfen Hypromellose für jedes Auge und kehren Tier Heizkissen für die Verwertung. </li></ol> 5. Die Überwachung der injizierten Mäusen und Ernte von Tumoren <ol><li> Täglich prüfen die injizierten Auge für Leukokorie (weiß papillären Reflex) und / oder periokuläre Ausdehnung, die in der Regel zeigt sich 2-4 Wochen nach der Injektion. </li><li> Sobald das Tumorwachstum festgestellt wird, Tier nach den Richtlinien des Instituts einschläfern. </li><li> Wenn das Auge des Tumors durch die Augenlider bedeckt sind, verwenden Sie das Skalpell zu zwei Schnitte senkrecht auf die Lidspalte zu machen und heben Sie die Hautlappen. </li><li> Unter Visualisierung mit dem Stereomikroskop, einen umlaufenden Schnitt am Limbus, Entfernen der Hornhaut und der Linse, und sorgfältig zu sezieren den Großteil der Tumormasse von den anderen Geweben mit tweeGefriergeräte. Ort des Tumors in sterile RPMI-1640-Medien. </li><li> Sie mit einer Pinzette langsam ziehen die offene Welt aus der Steckdose. Um zu gewährleisten, eine angehängte Sehnerv so Tumorinvasion visualisiert werden können, ziehen Sie den Globus, bis der Nerv freigelegt und mit einer Schere auf die Nerven so lange wie möglich schneiden. Legen Sie in 10% Formalin für regelmäßige Verarbeitung zur histologischen Untersuchung. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Retinoblastoma tumorspheres beginnen, aus dem disaggregierten Gewebe fast sofort, als sie befreit von der Tumormasse sind, erscheinen. Innerhalb von 2-4 Tagen werden mehr tumorspheres beginnt sich zu bilden und an Größe zunehmen. Die Kugeln sind in der Regel regelmäßig und zeigen eine gut definierte, sekundäre Membran umgibt das Aggregat (Abbildung 2). Das Tier in der Regel präsentiert mit Leukokorie innerhalb von 4 Wochen nach der Injektion (Abbildung 3b), gefolgt von der Erweiterung des Erdballs und Dehnung der umgebenden Gewebe 5-8 Wochen nach der Injektion wie der Tumor wächst (Abbildung 3c). <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Querschnittsdiagramm der Maus Auge Hervorhebung Features in das Protokoll verwiesen. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Culture menschlichen Retinoblastom-Zellen in vitro abgebildet bei a) 4x, und b) 10-fach Objektiv Vergrößerung. Retinoblastoma primären Tumorzellen produzieren tumorspheres mit einem regelmäßigen Sphäroid Form und eine knusprige äußere Membran. Scale-Balken stellen a) 500 um, und b) 200 um. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 Eye of Rag2 -. / - Maus zeigt a) normale Funktionen, b) Leukokorie Hinweis auf eine Tumormasse in Glaskörperraum und c) eine große Tumormasse Füllung um den Globus mit zugehörigen periokuläre Blähungen, intraokularen Blutungen.

<ol><li>Chèvez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li>
<li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li>
<li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors%3A+Dependence+on+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Baylor College of Medicine IACUC Ausschusses durchgeführt.

Die Technik hier beschriebenen erleichtert die Ausbreitung Retinoblastom Tumoren in ihren intraokularen, intravitreale Milieu. Die intraokulare Injektion Technik hat in der Vergangenheit verwendet, um Tumore aus Retinoblastom-Zelllinien 1 sowie die virale Vektoren für die Gentherapie intraokularen 2,3 liefern zu schaffen. Diese Technik wurde inzwischen erfolgreich genutzt, um Menschen Retinoblastom Tumoren durch direkte Injektion von Zellen aus dem Primärtumor und Injektion von tumorspheres sowie serielle Ausbreitung von Xenograft zu produzieren. Sichtbares Zeichen der Tumorbildung (in der Regel Leukokorie) ist in der Regel zunächst innerhalb von 4 Wochen darauf hingewiesen, nach der intraokularen Blutungen und Ausdehnung des Globus und / oder Gewebe um die Umlaufbahn innerhalb von 5-8 Wochen entwickeln. Eine Minderheit der injizierten Mäusen verletzen das injizierte Auge, was zu einer endgültigen Schließung der Augenlider. In diesen Fällen ist Ausdehnung das einzige Zeichen der Tumorbildung. Gründung der murinen Xenograft nicht erfolgreich mit allen menschlichen Retinoblastom Tumoren, obwohl Ausbreitung von etablierten Xenograft ist höchst erfolgreich. Diese Beobachtung legt nahe, dass bestimmte Eigenschaften des Primärtumors, wie Invasivität und Ausmaß der Differenzierung oder eine andere unbekannte Faktor, kann Einfluss auf die Fähigkeit dieser Tumoren in der Maus-Okular Umwelt belasten. Die Menge des Gewebes, die von einem menschlichen Retinoblastom Tumor erworben werden können, ist recht klein, und es bestehen erhebliche Einschränkungen auf die Fähigkeit zur Kultur menschlichen Retinoblastom-Zellen in vitro wie begrenzte Lebensdauer, Verlust von soliden Tumoren Gewebe sowie Veränderungen in der zellulären Phänotyp. Dieses Protokoll bietet eine relativ einfache Art und Weise auf den menschlichen Tumor ausbreiten und einen Maus-Modell der menschlichen Erkrankung. Dies erlaubt eine weitere in vitro und in vivo Experimente der Biologie der Retinoblastom und längere Wartungsintervalle der Tumor außerhalb des Patienten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Catalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Phenylephrin HCl 2,5% </td><td> Bausch &amp; Lomb </td><td> 053-11 </td><td> Ophthalmic Lösung </td></tr><tr><td> 30-ga Needle </td><td> BD </td><td> 305128 </td><td> Regelmäßige Fase </td></tr><tr><td> 10-mL Luer-Lock-Spritze </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 3/10-cc Insulinspritze </td><td> BD </td><td> 328431 </td><td></td></tr><tr><td> Alkoholtupfer </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte, gewebekulturbehandelten </td><td> BD </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Proparacain HCl 0,5% </td><td> Butler AHS </td><td> 017239 </td><td> Ophthalmic Lösung </td></tr><tr><td> Ketamin HCl 100mg/ml </td><td> Fort Dodge </td><td> 4402A </td><td></td></tr><tr><td> 10-ul Hamilton-Spritze </td><td> Hamilton Company </td><td> 7648-01 </td><td></td></tr><tr><td> 32-ga Hamilton Needle </td><td> Hamilton Company </td><td> 7803-04 </td><td> Kundenspezifische Länge - 0,5 &quot; </td></tr><tr><td> Neurobasal-A Media </td><td> Invitrogen </td><td> 10888-022 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X </td><td> Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-1640 Medien </td><td> Mediatech </td><td> 10 bis 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäure-Lösung, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25 bis 025-CI </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25 bis 005-CI </td><td></td></tr><tr><td> Disposable # 11 Scalpel </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td><td></td></tr><tr><td> Nager Anästhesie Combo </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> In-house-Apotheke Formulierung (Ketamin 37,6 mg / ml, 1,92 mg Xylazin / ml, Acepromazin 0,38 mg / mL) </td></tr><tr><td> Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td> Rekonstituieren bei 10 ug / ml Stammlösung </td></tr><tr><td> Rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02634 </td><td> Rekonstituieren bei 10 ug / ml Stammlösung </td></tr><tr><td> OMS-75 Operationsmikroskop </td><td> Topcon Medical Systems </td><td> OMS-75 </td><td> Dieses Modell ist nicht mehr </td></tr><tr><td> 10% Formalin </td><td> VWR </td><td> 95042-908 </td><td></td></tr></tbody></table>

aufbau und verbreitung der menschenrechte retinoblastoma tumore in immundefizienten mäuse

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Die Kultivierung Retinoblastom Tumorzellen in definierten Stammzellen Medien entstehen primäre tumorspheres dass gewachsen und nur für eine begrenzte Zeit aufrechterhalten werden kann. Diese kultivierten tumorspheres kann zeigen deutlich unterschiedliche zelluläre Phänotypen, wenn die ursprüngliche Tumoren verglichen. Demonstration, dass kultivierte Zellen die Fähigkeit zur Bildung neuer Tumoren haben ist wichtig um sicherzustellen, dass kultivierte Zellen-Modell der Biologie des ursprünglichen Tumors. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vermehrung menschlicher Retinoblastom Tumoren in vivo mit Rag2 - / - immungeschwächten Mäusen. Kultivierte humane Retinoblastom tumorspheres der niedrigen Passage oder Zellen aus frisch geernteten menschlichen Retinoblastom Tumor direkt in den Glaskörperraum des murinen Augen injiziert erhalten bilden Tumore innerhalb von 2-4 Wochen. Diese Tumoren können geerntet und entweder weiter in murine Augen in vivo passagiert oder gewachsen tumorspheres in vitro. Propagation wurde erfolgreich für mindestens drei Passagen wodurch eine ständige Quelle der menschlichen Retinoblastom Gewebe für weitere Experimente durchgeführt. Wesley S. Bond und Lalita Wadhwa sind Co-Erstautoren.

Ein Verfahren ist für die menschliche Retinoblastom Tumoren in Mäusen zu propagieren. Tumorzellen sind direkt in die Augen immungeschwächten Mäusen injiziert. Sekundäre Tumoren wurden erfolgreich etabliert mit beiden Zellen direkt aus humanen Tumoren und kultiviert tumorspheres geerntet.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Die Kultivierung von Retinoblastom-Tumorzellen in definierten Stammzellmedien führt zur Bildung primärer Tumorsphären, die nur für einen begrenzten Zeitraum gezüchtet und aufrechterhalten werden können ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein orthotopes Retinoblastom in einer immundefizienten Maus zu etablieren, wodurch ein praktisches Modell für weitere Experimente bereitgestellt und die Tumorausbreitung ermöglicht wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen aus einem primären Tumor oder Xenotransplantat gewonnen und Tumorsphären in vitro kultiviert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die kultivierten Tumorzellen in die Glaskörperhöhle oder den subretinalen Raum des Auges einer immundefizienten rag-two-null-Maus zu injizieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die injizierten Mäuse auf Anzeichen von Tumorbildung zu überwachen, einschließlich Leukokorie, GLO-Vergrößerung und periokulärer Schwellung. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Entnahme des Xenotransplantat-Tumors. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels histopathologischer Untersuchung die orthotopische Tumorbildung im murinen Auge zeigen.Die visuelle Demonstration dieser Technik ist aufgrund der empfindlichen Natur der intraokularen Injektion entscheidend. Umgebende Strukturen können leicht beschädigt werden, wenn sie nicht korrekt identifiziert werden. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Platzierung der Injektion in der Glaskörperhöhle präzise erfolgen muss, um die Tumorzellen an der richtigen Stelle abzugeben.Nun kann diese Methode Einblicke in die Biologie von Retinoblastomtumoren liefern. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewandt werden, wie beispielsweise die interokuläre Verabreichung von Vektoren für den Gentransfer. Bereiten Sie zunächst frisches, definiertes Stammzellmedium in einer sterilen, zellkulturgeeigneten 10-Zentimeter-Schale vor.Platzieren Sie das Retinoblastom-Tumorgewebe und aspirieren Sie das überschüssige Transportmedium, wobei genügend zurückbleibt, um Austrocknung zu verhindern. Zerkleinern Sie das Gewebe mechanisch mit einem Skalpell unter Verwendung einer Kreuzschneidetechnik. Geben Sie sofort 100 Mikroliter definiertes Stammzellmedium zum Gewebe hinzu und verteilen Sie das zerkleinerte Gewebe vorsichtig mit dem Skalpell. Fügen Sie danach 10 Milliliter definiertes Stammzellmedium in die Petrischale hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator und überprüfen Sie täglich auf Trübung und pH-Änderungen.Einige Tumorsphären sollten nahezu unmittelbar aus dem disruptierten Tumorgewebe entstehen, wobei die Anzahl innerhalb von sieben bis zehn Tagen zunimmt, sobald ausreichendes neues Wachstum beobachtet wird. Danach wöchentlich die Tumorsphären bei 300 × g für fünf Minuten zentrifugieren. Resuspendieren Sie sie in frisch zubereitetem definiertem Stammzellmedium und pipettieren Sie zehnmal auf und ab, um größere, zentral nekrotische Sphären zu disruptieren und die Bildung neuer, gesunder Sphären zu ermöglichen.Um kultivierte Tumorsphäroide für die Injektion vorzubereiten, überführen Sie die Sphäroide vorsichtig in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Pipettieren Sie sanft 10 bis 15 Mal auf und ab, um die Sphäroide aufzulösen. Zählen Sie die zu injizierenden Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau, um nicht lebensfähige Zellen auszuschließen.Bereiten Sie so viele Injektionen vor, wie aufgrund der verfügbaren Zellanzahl und der experimentellen Anforderungen notwendig sind. Zentrifugieren Sie danach die Röhrchen mit 300 ×g für fünf Minuten. Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter.PBS die Zentrifugations- und Aspirationsschritte noch einmal wiederholen. Abschließend die Zellen in 10 Mikroliter sterilem PBS pro Injektion resuspendieren. Um die Tiere auf das Verfahren vorzubereiten, beginnen Sie damit, eine anästhesierte Maus auf eine beheizte Unterlage zu legen.Um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, geben Sie einen Tropfen Propan HCL in das rechte Auge und warten Sie eine Minute. Danach geben Sie einen Tropfen Phenylephrin HCL in das rechte Auge und warten Sie fünf Minuten. Falls eine Pupillenerweiterung nicht eingetreten ist, verabreichen Sie einen weiteren Tropfen und warten Sie weitere fünf Minuten.Legen Sie das anästhetisierte Tier seitlich unter das Mikroskop und stützen Sie den Kopf auf Gaze. Drehen Sie die rechte Seite nach oben und zentrieren Sie das Auge, um einen roten Reflex des rechten Auges zu erhalten. Stützen Sie den Bulbus des rechten Auges, indem Sie vorsichtig gleichzeitig mit zwei Fingern auf die Augenlider nach unten drücken, wenn der Augenhintergrund durch das Mikroskop betrachtet wird.Halten Sie diese Position für den Rest des Verfahrens stabil. Verwenden Sie eine sterile Kanüle mit 30 Gauge, die an eine Luer-Lock-Spritze angeschlossen ist. Durchstechen Sie das Bulbus lateral durch die Bindehaut und Sklera in der Nähe des Hornhautlimbus im Bereich der Pars plana und gerade durch die Aderhaut in den Glaskörperraum.Entfernen Sie die Nadel von der Öffnung. Sterilisieren Sie eine Hamilton-Nadel mit einem Alkoholtupfer. Ziehen Sie die Zellsuspension in die Hamilton-Spritze auf und führen Sie die Nadel in die Öffnung ein, bis die Nadel unter dem Mikroskop hinter der Linse im Glaskörper in der Nähe der Netzhaut sichtbar ist.Mit Hilfe einer zweiten Person halten Sie die Nadel in dieser Position stabil, während der Kolben gedrückt wird, und entfernen Sie die Nadel langsam. Falls erforderlich, verwenden Sie einen Wattestäbchen, um Blut oder Flüssigkeit von der Öffnung aufzunehmen. Lösen Sie den Druck vorsichtig, um die Augenlider der Maus zu schließen.Bringen Sie das Tier zur Erholung auf eine beheizte Unterlage zurück. Untersuchen Sie täglich nach der Injektion das Auge auf Leukokorie. Diese wird gewöhnlich zwei bis vier Wochen nach der Injektion sichtbar.Sobald Tumorwachstum festgestellt wird, euthanasieren Sie das Tier gemäß den institutionellen Richtlinien. Unter einem stereoskopischen Mikroskop führen Sie einen kreisförmigen Schnitt am Limbus durch, entfernen die Hornhaut und die Linse und dissezieren vorsichtig den Großteil der Tumormasse von den anderen Geweben mit einer Pinzette. Legen Sie den Tumor in steriles RPMI 1640.Verwenden Sie Pinzette, um die offene Bulbus langsam aus der Augenhöhle zu ziehen, bis der Sehnerv freigelegt ist. Heben Sie dabei vorsichtig den Bulbus aus der Augenhöhle. Schneiden Sie mit einer Schere den Sehnerv durch, wobei so viel Nerv wie möglich am Bulbus belassen wird, um eine Invasion des Tumors in den Sehnerv beurteilen zu können. Legen Sie das Präparat zur histologischen Untersuchung in 10 % neutral gepuffertes Formalin ein.Hier ist ein Beispiel für kultivierte Tumorsphäroide. Nach drei Tagen sind nur wenige Tumorsphäroide im zerfallenen Tumorgewebe erkennbar. Nach 10 Tagen hat sich jedoch die Anzahl der Tumorsphäroide erhöht.Die Sphären weisen mehrere Wochen nach der Injektion eine scharfe äußere Membran auf, wie im Einleger oben rechts gezeigt. Die injizierte Maus zeigt eine Leukokorie, der weiße Pupillenreflex beruht auf einem Tumor im hinteren Augenabschnitt. Bei diesen Beispielen von mit H und D gefärbten Augenschnitten beachten Sie den xenotransplantierten Retinoblastomtumor, der links den Glaskörperraum ausfüllt, sowie das Fehlen eines solchen Wachstums im simuliert injizierten Auge rechts.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man kultivierte Tumorzellen vorbereitet, eine intrazelluläre Injektion in das Auge einer Maus korrekt durchführt und wie man auf Tumorprogression achtet. Sobald die Injektionstechnik beherrscht ist, kann sie pro Tier in etwa 30 Minuten durchgeführt werden. Wenn die Arbeit ordnungsgemäß durchgeführt wird, vergessen Sie nicht, dass Tumorzellen gefährlich sein können und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA, einschließlich Laborkittel und Schutzmasken, stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren ausgeführt wird. Menschliche Krebszellen sollten immer unter BSL-2-Bedingungen manipuliert werden.

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Forschung

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