High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Umweltproben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Klassifizierung von enzymhydrolysiertem organischem Phosphor in Extrakten aus Boden- oder Gülleproben. Dies wird erreicht, indem zunächst Proben mit Natriumhydroxid-EDTA-Lösung extrahiert und der pH-Wert der Extrakte eingestellt wird. Inkubieren Sie dann diese angepassten Extrakte mit zwei verschiedenen Enzymlösungen.

Auf einer 96-Well-Platte besteht der letzte Schritt darin, das enzymfreigesetzte Orthophosphat mittels Molybdänblau-Kolorimetrie zu messen. Letztendlich können die meisten nativen Orthophosphat-Monoester-Phosphor- und Diaster-Phosphorformen in Boden- oder Gülleproben auf der Grundlage der unterschiedlichen Freisetzung von Orthophosphat durch die Enzymhydrolysemethode klassifiziert werden. Diese Methode kann kostengünstig in jedem Standardlabor durchgeführt werden.

Der Hauptvorteil gegenüber bestehenden Methoden wie der Phosphor-31-Kernspinresonanzspektroskopie besteht darin, dass sie das Potenzial nativer Bodenenzyme messen kann, in Zukunft Orthophosphat aus organischen Erbsenverbindungen freizusetzen. Daher können die mit dieser Methode gewonnenen Daten dazu beitragen, die Bodenfruchtbarkeit oder das Potenzial des Bodens, schädliche Mengen an algenverfügbarem Orthophosphat freizusetzen, vorherzusagen. 30 Milliliter der 0,25 molaren Natronlauge werden zu zwei Gramm nasser oder getrockneter Probe in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen gegeben.

Rühren 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben 30 Minuten lang 3000 Mal G und geben Sie dann 100 Mikroliter in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das bereits Acetatpuffer enthält. Die adjustierte Probe hat ein Gesamtvolumen von einem Milliliter und einen pH-Wert von 5,0.

Es werden zwei Stammlösungen hergestellt, die 0,5 Einheiten pro Milliliter saure Phosphatase in 10 Millilitern frisch zubereitetem 0,1 molaren Natriumacetat mit einem pH-Wert von fünf enthalten. Nun wird die rekonstituierte lyophilisierte Nuklease NP one aus Penicillium Citron in eines der 10-Milliliter-Röhrchen mit sauren Phosphatase-Stämmen bis zu einer Endkonzentration von 2,5 Einheiten NP one pro Milliliter gegeben, die durch mehrmaliges Invertieren schonend gemischt werden, die beiden Enzymlösungen bei 3000 mal G für 30 Minuten zentrifugieren. Um eine Kalibrierkurve zu erstellen, beginnen Sie mit der Zugabe eines Milliliters einer millimolaren Kaliumphosphat-Stammlösung zu einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und führen Sie sieben 0,5-Milliliter-Getreideverdünnungen durch. Verwerfen Sie das erste Röhrchen, so dass die endgültige Verdünnung von 20 al bis 0,625 nm Phosphor reicht.

Übertragen Sie nun die ORTHOPHOSPHAT-Standards auf die letzten beiden Spalten auf der Platte, beginnend mit null NM Orthophosphat in Reihe A und endend mit 20 nm Orthophosphat in Reihe H bis zu den ersten drei Vertiefungen von Spalte 10. Geben Sie 40 Mikroliter PP plus GP-Enzymlösung in die nächsten drei Vertiefungen von Spalte 10. Fügen Sie 40 Mikroliter PP plus GP plus NP eine Enzymlösung hinzu.

Geben Sie zum Schluss 40 Mikroliter 100 millimolaren Acetatpuffer in alle sechs Vertiefungen. Nun sollte jede der ersten sechs Vertiefungen in Spalte 10 80 Mikroliter Lösung für die nächsten beiden Vertiefungen enthalten. Fügen Sie 40 Mikroliter Natriumacetatlösung hinzu, die 10 M Glukose, sechs Phosphate und 40 Mikroliter PP plus GP-Enzymlösung enthält.

Verteilen Sie für jede zu testende Probe 40 Mikroliter pH-angepasste Probenextrakte in die Vertiefungen eins bis neun in bis zu acht Reihen, nachdem alle Proben verteilt wurden. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um PP plus GP-Enzymlösung in die Spalten eins bis drei, PP plus GP plus NP eins in die Spalten vier bis sechs und 0,1 molaren Natriumacetatpuffer in die Spalten sieben bis neun zu verteilen. Führen Sie diesen Schritt schnell durch, um sicherzustellen, dass alle Proben die gleiche Inkubationszeit erhalten.

Decken Sie die 96-Well-Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie Proben, Enzymlösungen, Kontrollen und Kalibrierkurve genau eine Stunde bei 37 Grad Celsius in deionisiertem Wasser. Bereiten Sie jeweils 50 Milliliter von vier Stammlösungen vor. A muss täglich mit einer Mehrkanalpipette schnell zubereitet werden.

Geben Sie 25 Mikroliter SDS, 100 Mikroliter Lösung A, 20 Mikroliter Lösung B und 50 Mikroliter Lösung C in alle Vertiefungen in der 96. Platte gut schütten, die Platte abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Messen Sie schließlich die Extinktion bei 850 Nanometern in einem beliebigen T-einstellbaren Mikroplatten-Reader mit einer Tabellenkalkulationsanwendung.

Stellen Sie zunächst die anorganische Phosphor-Kalibrierkurve mit null bis 20 Nanomol Phosphor auf der x-Achse und dem Mittelwert der doppelten Absorptionsmessungen auf der Y-Achse dar, führen Sie eine lineare Regression durch und finden Sie die Gleichung der Linie der besten Anpassung. Berechnen Sie als Nächstes den anorganischen Phosphor im Hintergrund, indem Sie die Werte in den Spalten eins bis drei mitteln, und wenden Sie dann die Kalibrierungskurve auf das Dataset an. Als nächstes wird zur Bestimmung des aus hydrolysierten Phosphormonoestern gewonnenen Phosphors die dreifachen Probenwerte aus den Spalten vier bis sechs gemittelt und die Kontrollenzymlösung plus anorganischer Hintergrundphosphor subtrahiert.

Um dann den Phosphorgehalt aus hydrolysiertem Phosphor zu berechnen, mitteln die DERs die dreifachen Probenwerte aus den Spalten sieben bis neun und subtrahieren die Kontrollenzymlösung plus anorganischen Hintergrundphosphor plus hydrolysierten Monoester-Phosphor aus den Spalten vier bis sechs. Eine typische 96-Well-Platte zeigt die Ergebnisse für acht Proben und eine Kalibrierungskurve. Die Steuerelemente befinden sich in Spalte 10.

Die Zunahme der Farbintensität zwischen den Spalten eins bis drei und vier bis sechs ist auf hydrolysierte Monoester-Phosphorverbindungen zwischen den Spalten vier bis sechs und sieben bis neun auf hydrolysierte Phosphorverbindungen zurückzuführen. Hier wurde die Methode der enzymatischen Hydrolyse mit hohem Durchsatz verwendet, um die Verteilung der Phosphorklassen in einem 0,25 molaren Natriumhydroxid und 0,05 molaren EDTA-Extrakten einer Bodenprobe aus Vermont erfolgreich zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man native Orthophosphat-, Monoester- und Diastererbsenverbindungen in Boden- oder Mistextrakten mittels enzymatischer Hydrolyse misst.

Diese Technik kann Forschern in den Bereichen Umweltchemie und Nährstoffmanagement den Weg ebnen, um das Verhalten von organischem P in Böden oder Güllesystemen zu untersuchen.