Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, fünf Methylcytosin und fünf Hydroxyethylcytosin innerhalb eines spezifischen Locus der genomischen DNA zu analysieren und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Hydroxylgruppe von fünf Hydroxyethyl-Ain angesteuert wird, wodurch ein spaltbares MSP an einer Stelle in eine nicht spaltbare Stelle umgewandelt wird. In einem zweiten Schritt wird die genomische DNA von den Restriktionsenzymen MSP eins und HPA zwei verdaut, die ihre differentielle Methylierungssensitivität nutzen, um fünf mit Glukose verwandte fünf Hydroxyethylcytosin-Stellen zu identifizieren.

Als nächstes wird die PCR verwendet, um den Locus zu befragen. Es werden Ergebnisse erhalten, die das Vorhandensein von fünf Hydroxyethylcytosin in einem spezifischen Locus zeigen. QPCR kann verwendet werden, um die Menge von fünf Methylcytosin und fünf Hydroxyethylcytosin zu quantifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z. B. der Bi-Sulfit-Sequenzierung, besteht darin, dass Sie zwischen fünf Methylain und fünf Hydroxyethylain unterscheiden können. Aufführend. Die Experimente heute werden Romas Vice Villa Romas war einer der Hauptentwickler dieses Kindes bei New England Biolabs. Vor dem Start dieses Protokolls reinigte er die genomische DNA aus dem Gehirngewebe des B-Meeres, wie in der schriftlichen Prozedur beschrieben, in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Mischen Sie den genomischen D-N-A-U-D-P, Glukose, NEB-Puffer, vier und genügend nukleasefreies Wasser, um das Gesamtvolumen auf 310 Mikroliter zu bringen.

Dieses Reaktionsgemisch wird in zwei Röhrchen à 155 Mikroliter aufgeteilt. Geben Sie dann 30 Einheiten oder drei Mikroliter T-Vier-Beta-Gluc-Cosaltransferase in ein Röhrchen. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.

Geben Sie das T vier BGT nicht in das zweite Röhrchen, da es sich um die Kontrollreaktion handelt, sondern stellen Sie sicher, dass Sie drei Mikroliter Wasser hinzufügen. Inkubieren Sie beide Röhrchen 12 bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, während dieser Zeit fügt das BGT Glukose zur Hydroxylgruppe von fünf Hydroxyethylcytosingruppen in der Probe hinzu. Um den Restriktionsenzymverdau zu beginnen, aliquotieren Sie 50 Mikroliter des Reaktionsgemisches in jedes der drei 0,2-Milliliter-PCR-Streifenröhrchen, die mit den Markierungen eins bis drei gekennzeichnet sind.

Aliquotieren Sie dann 50 Mikroliter des Kontrollgemisches in jedes der drei PCR-Streifenröhrchen, die mit vier bis sechs gekennzeichnet sind. Fügen Sie 100 Einheiten msp hinzu, eine in die Röhrchen eins und vier. Geben Sie dann 50 Einheiten HPA zwei in die Röhrchen zwei und fünf und mischen Sie gut, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.

Fügen Sie den Röhren drei und sechs nichts hinzu, da es sich um Bedienelemente handelt. Inkubieren Sie alle sechs Röhrchen mindestens vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann einen Mikroliter Proteinase K in jedes Röhrchen und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.

Zum Schluss inaktivieren Sie die Proteinase K, indem Sie 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius inkubieren. Dieses Verfahren wird unter Verwendung des Long Amp TAC von NE B für die Endpunkt-PCR demonstriert. Andere PCR-Reagenzien und -Verfahren können jedoch durch ein 0,2-Milliliter-PCR-Reaktionsröhrchen auf Eis ersetzt werden.

Geben Sie fünf x Long Amp TAC, Reaktionspuffer, DN, NTPs, Vorwärts- und Rückwärtsprimer, das zuvor erhaltene Template, DNA, Long AMP, TDNA-Polymerase und genügend nukleasefreies Wasser zu, um ein Endvolumen von 50 Mikrolitern zu erreichen. Mischen Sie die Reaktion bei Bedarf vorsichtig und sammeln Sie die gesamte Flüssigkeit durch schnelles Schleudern am Boden des Röhrchens. Übertragen Sie die PCR-Röhrchen vom Eis in einen Thermocycler, wobei der Block auf 94 Grad Celsius vorgeheizt ist, und starten Sie das Zyklusprogramm für eine routinemäßige dreistufige PCR.

Es sollte einen anfänglichen Denaturierungsschritt bei 94 Grad Celsius für 30 Sekunden geben, gefolgt von 30 Zyklen einer Denaturierung bei 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, 55 bis 65 Grad Celsius, einem Knien für 30 Sekunden und einer 65 Grad Celsius Verlängerung für 20 Sekunden oder 50 Sekunden pro kb. Daran schließt sich eine letzte Verlängerung bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten an. Die Echtzeit-PCR kann auch durchgeführt werden, um Mengen von fünf Methylcytosin und fünf Hydroxyethyltoin zu quantifizieren.

Spezifische Informationen finden Sie im Produkthandbuch auf nb. com. Ein Vergleich von fünf Hydroxyethylain-Mengen an Locus 12 wurde mittels Endpunkt-PCR und Echtzeit-PCR durchgeführt. Es wurden vier verschiedene Maus-BSY-Gewebeproben analysiert, darunter Gehirn, Leber, Herz und Milz.

Die Variation von fünf Hydroxyethylcytosin ist zu Vergleichszwecken in der Boxed-Gel-Lane der Endpunkt-PCR-Proben offensichtlich. Die Echtzeit-PCR-Daten wurden auf ungeschnittene DNA normalisiert und eine Standardkurve zur Bestimmung der Kopienzahl verwendet. Die Proben wurden normalisiert, indem die Kopienzahl der Proben durch die Kopienzahl der unverdauten Kontrolle dividiert wurde.

Hier kann die Variation in fünf Hydroxyethylcytosin durch den Vergleich der gelben Balken gesehen werden. Ein paar Hinweise zur Durchführung der Technik. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass alle enzymatischen Reaktionen zu Ende geführt werden. Für die BGT ist es wichtig, dass Sie über Nacht gehen, damit Sie alle DNA-Stellen für Ms.P eins und HEPA zwei isolieren können, es ist wichtig, dass Sie mindestens vier Stunden mit diesen Reaktionen verbringen, um sicherzustellen, dass Sie die Fertigstellung erreichen.

Und schließlich bieten wir DNA-Kontrollen und Primer-Kontrollen an, damit Sie Kontrollreaktionen nebeneinander durchführen können.