Name: Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Analyse und Quantifizierung von 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin in Balb/c-Gehirngewebe mit dem EpiMark-Kit. Diese enzymatische Methode ermöglicht eine zuverlässige Unterscheidung epigenetischer DNA-Modifikationen.

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Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Gyeong Chin, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, Steven E. Jacobsen s Labor, UCLA. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH 1R44GM095209-01 unterstützt.

1. DNA Glucosylierung and Control Reaktionen <ol><li> In einem 1,5 ml Reaktionsgefäß auf Eis mischen 5-10 Mikrogramm der genomischen DNA (für eine endgültige Konzentration von 30 Mikrogramm / Milliliter), 12,4 Mikroliter UDP-Glucose (für eine endgültige Konzentration von 80 Mikromol), 31 Mikroliter NEBuffer 4 und bis zu 310 Mikroliter Nuklease-freies Wasser zu bringen das Gesamtvolumen auf 310 Mikroliter. </li><li> Split dieses Reaktionsgemisch in zwei Röhren von 155 Mikroliter jeder. </li><li> Dann fügen Sie 30 Einheiten oder 3 Mikroliter, der T4-β-glucosyltransferase zu einer Röhre. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Die zweite Röhre wird der Kontroll-Reaktion, so fügen Sie 3 Mikroliter Wasser anstelle von T4-BGT. </li><li> Inkubieren beiden Röhren bei 37 Grad Celsius für 12 bis 18 Stunden, während welcher Zeit der T4-BGT wird Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-Hydroxymethylcytosin Gruppen in der Probe hinzufügen. </li></ol> 2. Restriktionsenzymverdau <ol><li> Label drei 0,2 ml PCR-Streifen Rohre Nummern 1 bis 3. Aliquot 50 ul des Reaktionsgemisches in jedem. </li><li> Label drei 0,2 ml PCR-Streifen Rohre Nummern 4 bis 6 aus. Aliquot 50 ul der Kontrolle Mischung in jeder. </li><li> Add 100 Einheiten, oder 1 Mikroliter, der MspI in Röhrchen 1 und 4. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. </li><li> Fügen Sie 50 Einheiten, oder 1 Mikroliter, der HpaII in Rohren 2 und 5. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. </li><li> Fügen Sie nicht etwas zu Röhrchen 3 und 6, da sie steuert werden. </li><li> Inkubieren Sie alle 6 Röhren bei 37 Grad Celsius für mindestens 4 Stunden. </li><li> Add 1 Mikroliter Proteinase K in jedes Röhrchen und inkubieren Sie bei 40 Grad Celsius für 30 Minuten. </li><li> Inaktivierung der Proteinase K durch Inkubation bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten. </li></ol> 3. Analysieren DNA durch PCR / qPCR Dieses Protokoll verwendet NEB ist LongAmp Taq für Endpunkt PCR, die gezeigt worden ist, eine gute Leistung. Andere PCR-Protokolle ersetzt werden können. <ol><li> Fügen Sie die folgenden Komponenten, um eine 0,2 Milliliter PCR-Reaktionsgefäß auf Eis: 10 Mikroliter 5X LongAmp Taq-Reaktionspuffer, 1,5 Mikroliter 10 mM dNTPs, 1 Mikroliter von 10 Mikromol Vorwärtsprimer, 1 Mikroliter von 10 Mikromol Reverse-Primer, 3 Mikroliter Vorlage DNA aus den vorherigen Schritten, 1 Mikroliter LongAmp Taq DNA Polymerase und Nuklease-freies Wasser bis zu 50 Mikroliter. Diese Mengen können je nach PCR-Protokoll zu ändern. </li><li> Vorsichtig mischen die Reaktion. Wenn nötig, sammeln Sie alle Flüssigkeit auf den Boden der Röhre durch eine schnelle Runde. </li><li> Overlay der Probe mit Mineralöl bei Verwendung eines Thermocycler ohne Heizdeckel. </li><li> Übertragen Sie die PCR-Röhrchen von Eis zu einem Thermocycler mit dem Block vorgeheizt auf 94 Grad Celsius und starten Sie den Radsport-Programm. Für eine Routine 3-Schritt-PCR, sollte es eine initiale Denaturierung bei 94 Grad Celsius für 30 Sekunden von 30 Zyklen von 94 Grad Celsius Denaturierung für 15 Sekunden, 55 bis 65 Grad Celsius Annealing für 30 Sekunden und 65 Grad Celsius Erweiterung folgen für 20 Sekunden oder 50 Sekunden pro kb. Dies sollte durch eine letzte Verlängerung bei 65 Grad Celsius für 5 Minuten eingehalten werden. Real-time PCR kann auch durchgeführt werden, um Mengen von 5-Methyl-und 5-Hydroxymethylcytosin quantifizieren sein. Bitte beachten Sie die Produkt-Handbuch, auf neb.com gefunden für spezifische Informationen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vergleich von 5-Hydroxymethylcytosin Mengen an Locus 12 in verschiedenen Maus Balb / C Gewebeproben. (A), End-Point-PCR. (B), Real time PCR. DNA aus vier Mausgeweben analysiert. Zum Zwecke der Vergleichbarkeit wurden real time PCR Daten uncut DNA normalisiert. Eine Standardkurve wurde verwendet, um die Nummer des Exemplars zu bestimmen. Die Proben konnten, indem man die Kopienzahl der Proben No 1-6 durch die Kopienzahl der Kontrolle, ist unverdaut (Nr. 5) normalisiert werden. Boxed Gelspur zeigt Variante in 5-HMC präsentieren.

<ol><li>Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li>
<li>Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).</li>
<li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li>
</ol>

Beide Ted und Romas, sind Autoren dieses Artikels, Mitarbeiter der NEB; Romas ist der Hauptentwickler des Kits, mit Ted wird der Direktor des Applications &amp; Development Department, dass die Entwicklung dieses Kit überwachte.

Es gibt einige kritische Dinge zu beachten bei der Einrichtung dieses Experiment. Zunächst ist es wichtig, dass die Glucosylierung der genomischen DNA vollständig verläuft. Die Sequenz-Spezifität der T4-BGT ist nicht bekannt, und es scheint keine andere Wahl für das Substrat Folge haben. Daher ist in einigen Fällen kann längere Inkubationszeiten notwendig sein. Zweitens MspI und HpaII Verdauung muss, um Hintergrund-Signal zu vermeiden abzuschließen. Für diese Restriktionsenzyme, empfehlen wir eine Inkubationszeit von 4 Stunden, aber mehr Inkubationen können durchgeführt werden, wenn unvollständige Spaltung beobachtet werden. Drittens kann Input DNA-Menge angepasst je nach Verfügbarkeit, seit 20 ngs der DNA für die Endpunkt-PCR verwendet werden kann. Schließlich empfehlen wir die Nutzung der mitgelieferten Kontroll-DNA, die parallel mit genomischer DNA für 5-mC und 5-HMC Quantifizierung kann ausgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>EpiMark&amp;#8482; 5-hmC- und 5-mC-Analysekit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3317</td><td></td></tr><tr><td>Lokus-spezifische Primer, die eine CCGG-Stelle der Wahl flankieren</td><td></td><td></td><td>Individuell je nach Experiment; vom Anwender bereitzustellen</td></tr><tr><td>LongAmp&amp;#174; &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt;-DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0323</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Wasser der Molekularbiologie-Qualität</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hohe empfindlichkeit 5-hydroxymethylcytosin erkennung in balb / c gehirngewebe

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA Hydroxymethylierung ist eine lange bekannte Modifizierung von DNA, aber seit kurzem ein Schwerpunkt in der epigenetischen Forschung. Mammalian DNA wird enzymatisch an der 5 th Kohlenstoff-Position von Cytosin (C)-Reste bis 5-mC geändert, überwiegend im Zusammenhang mit der CpG-Dinukleotide. 5-mC zugänglich ist enzymatische Oxidation zu 5-HMC von der Tet-Familie von Enzymen, die vermutlich in Entwicklung und Krankheit beteiligt sind. Derzeit ist die biologische Rolle von 5-HMC nicht vollständig verstanden, sondern ist auf großes Interesse, da ihr Potential als Biomarker. Dies ist auf mehrere bahnbrechende Studien zu identifizieren 5-Hydroxymethylcytosin in embryonalen Maus-Stammzellen (ES) und neuronalen Zellen. Forschung Techniken, einschließlich Bisulfit-Sequenzierung Methoden sind nicht in der Lage, problemlos zwischen 5-mC-und 5-hmc unterscheiden. Ein paar Protokolle existieren, die Gesamtbeträge von 5-Hydroxymethylcytosin in das Genom zu messen, einschließlich Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Analyse oder Dünnschichtchromatographie einzelner Nucleoside aus genomischer DNA verdaut gekoppelt. Antikörper, die auf 5-Hydroxymethylcytosin gibt es auch, die für Dot-Blot-Analyse, Immunfluoreszenz oder Fällung von hydroxymethylierten DNA verwendet werden, können aber diese Antikörper nicht haben Einzel-Basis resolution.In Darüber hinaus hängt die Auflösung auf die Größe des immunpräzipitiert DNA und für Microarray-Experimenten, hängt davon ab, Sonde Design. Da nicht bekannt ist, wo genau 5-Hydroxymethylcytosin in das Genom oder seine Rolle in der epigenetischen Regulation existiert, sind neue Techniken erforderlich, die spezifischen Locus Hydroxymethylierung identifizieren. Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit bietet eine Lösung für die Unterscheidung zwischen diesen beiden Änderungen an bestimmten Orten. Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit ist eine einfache und robuste Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von 5-Methyl-und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb eines bestimmten DNA-Locus. Diese enzymatische Ansatz nutzt die Differential-Methylierung Empfindlichkeit des Isoschizomere MspI und HpaII in einer einfachen 3-Schritt-Protokoll. Genomic DNA von Interesse ist mit T4-BGT behandelt, indem eine Glukose moeity bis 5-Hydroxymethylcytosin. Diese Reaktion ist Sequenz-unabhängige, also alle 5-HMC glucosylierten werden; unmodifizierte oder 5-mC mit DNA wird dadurch nicht beeinflusst. Diese Glucosylierung wird dann durch Restriktionsendonukleaseverdau gefolgt. MspI und HpaII erkennen die gleiche Sequenz (CCGG), sind aber empfindlich auf unterschiedliche Methylierung Staaten. HpaII spaltet nur einen komplett unveränderten Ort: jede Änderung (5-mC, 5-HMC-oder 5-ghmC) an beiden Cytosin-Blöcke Spaltung. MspI erkennt und schneidet 5-mC-und 5-HMC, aber nicht 5-ghmC. Der dritte Teil des Protokolls ist eine Abfrage der Locus durch PCR. So wenig wie 20 ng der DNA-Eingang genutzt werden kann. Verstärkung der experimentellen (glucosylierten und verdaut) und Kontrolle (mock glucosylierten und verdaut) Ziel-DNA mit Primer flankieren CCGG Ort von Interesse (100-200 bp) durchgeführt wird. Wenn der CpG site enthält 5-Hydroxymethylcytosin, ist eine Band nach Glucosylierung und Verdauung erkannt, aber nicht in den nicht-glucosylierten Kontroll-Reaktion. Real-time PCR gibt eine Annäherung, wie viel Hydroxymethylcytosin ist in diesem besonderen Ort. In diesem Experiment werden wir die 5-Hydroxymethylcytosin Betrag in eine Maus Babl / C Gehirn Probe zu analysieren, indem Endpunkt PCR.

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Die DNA-Hydroxymethylierung ist eine seit langem bekannte Modifikation der DNA, ist jedoch in jüngster Zeit in den Fokus der epigenetischen Forschung gerückt. Säugetier-DNA wird enzymatisch ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, fünf Methylcytosin- und fünf Hydroxyethylcytosin-Reste innerhalb eines spezifischen Locus der genomischen DNA zu analysieren und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Hydroxylgruppe von fünf Hydroxyethylaminen abgeschirmt wird, wodurch eine spaltbare MSP-I-Stelle in eine nicht spaltbare Stelle umgewandelt wird. Im zweiten Schritt wird die genomische DNA mit den Restriktionsenzymen MSP-I und Hpa-II verdaut, die ihre unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Methylierung nutzen, um glucoserelevante 5-Hydroxyethylcytosin-Stellen zu identifizieren.Anschließend wird eine PCR verwendet, um den Locus zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von fünf Hydroxyethylcytosin an einem spezifischen Locus. Mit qPCR kann die Menge an fünf Methylcytosin und fünf Hydroxyethylcytosin quantifiziert werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der Bisulfitsequenzierung besteht darin, dass Sie zwischen fünf Methylamin und fünf Hydroxyethylamin unterscheiden können. Die Experimente, die heute durchgeführt werden, basieren auf der Arbeit von Romas Vice Villa, der ein Hauptentwickler dieses Kits bei New England Biolabs war. Vor Beginn dieses Protokolls wurde die genomische DNA aus B-Sehirngewebe wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen gereinigt. Mischen Sie die genomische DNA, UDP-Glucose, Puffer 4 von NEB und ausreichend nukleasefreies Wasser, um ein Gesamtvolumen von 310 Mikrolitern zu erreichen.Teilen Sie diese Reaktionsmischung auf zwei Reagenzgläser mit jeweils 155 Mikrolitern auf. Geben Sie dann 30 Einheiten oder drei Mikroliter T4-Betaglucosyltransferase in ein Reagenzglas. Mischen Sie gründlich durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren.Fügen Sie das T vier BGT nicht dem zweiten Reaktionsgefäß hinzu, da es die Kontrollreaktion darstellt; geben Sie stattdessen drei Mikroliter Wasser hinzu. Inkubieren Sie beide Gefäße 12 bis 18 Stunden bei 37 Grad Celsius, wobei die BGT Glukose an die Hydroxylgruppe von fünf Hydroxyethylcytosin-Gruppen in der Probe anhängt. Um mit der Restriktionsenzymverdauung zu beginnen, pipettieren Sie 50 Mikroliter der Reaktionsmischung in jeweils drei mit 1 bis 3 nummerierte 0,2-Milliliter-PCR-Streifengefäße.Aliquotieren Sie anschließend 50 Mikroliter der Kontrollmischung in jeweils drei PCR-Streifengefäße, die mit vier bis sechs beschriftet sind. Geben Sie 100 Einheiten msp je eine in die Gefäße eins und vier. Fügen Sie danach 50 Einheiten HPA zwei in die Gefäße zwei und fünf hinzu und mischen Sie durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gut durch.Fügen Sie nichts zu den Röhrchen drei und sechs hinzu, da diese Kontrollen sind. Inkubieren Sie alle sechs Röhrchen bei 37 Grad Celsius für mindestens vier Stunden. Geben Sie anschließend je einen Mikroliter Proteinase K in jedes Röhrchen und inkubieren Sie bei 40 Grad Celsius für 30 Minuten.Schließlich die Proteinase K durch Inkubation bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten inaktivieren. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von NE B'S long amp TAC für die Endpunkt-PCR demonstriert. Es können jedoch andere PCR-Reagenzien und -Verfahren in einem 0,2-Milliliter-PCR-Reaktionsgefäß auf Eis verwendet werden.Fügen Sie fünf x langen Amp-TAC-Reaktionspuffer, dNTPs, Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die zuvor gewonnene DNA-Vorlage, long AMP T-DNA-Polymerase und ausreichend nukleasefreies Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 50 Mikrolitern zu erreichen. Mischen Sie die Reaktion vorsichtig gegebenenfalls und sammeln Sie die gesamte Flüssigkeit durch einen kurzen Zentrifugationsschritt am Boden des Röhrchens. Übertragen Sie die PCR-Röhrchen von Eis in einen Thermocycler, dessen Block auf 94 Grad Celsius vorgewärmt ist, und starten Sie das Zyklenprogramm für eine routinemäßige dreistufige PCR.Es sollte ein anfänglicher Denaturierungsschritt bei 94 Grad Celsius für 30 Sekunden erfolgen, gefolgt von 30 Zyklen mit einer Denaturierung bei 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, einer Annealing-Phase bei 55 bis 65 Grad Celsius für 30 Sekunden und einer Verlängerung bei 65 Grad Celsius für 20 Sekunden oder 50 Sekunden pro kb. Anschließend sollte eine abschließende Verlängerung bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten durchgeführt werden. Echtzeit-PCR kann ebenfalls durchgeführt werden, um die Mengen von 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin zu quantifizieren.Bitte beachten Sie das Produkthandbuch auf nb.com für spezifische Informationen. Ein Vergleich von fünf Hydroxyethyl-ain-Mengen an Locus 12 wurde mittels Endpunkt-PCR und Echtzeit-PCR durchgeführt. Vier verschiedene Maus-BSY-Gewebeproben wurden analysiert, einschließlich Gehirn, Leber, Herz und Milz.Die Variation von fünf Hydroxyethylcytosin ist im markierten Geleinsatz der Endpunkt-PCR-Proben zu erkennen, um einen Vergleich zu ermöglichen. Die Echtzeit-PCR-Daten wurden auf ungeschnittene DNA normalisiert, und eine Standardkurve diente zur Bestimmung der Kopienzahl. Die Proben wurden normalisiert, indem die Kopienzahl der Proben durch die Kopienzahl der undigested Kontrolle dividiert wurde.Hier ist die Variation von fünf Hydroxyethylcytosin ersichtlich, indem man die gelben Balken vergleicht. Einige Hinweise zur Durchführung der Technik: Es ist entscheidend, dass alle enzymatischen Reaktionen vollständig durchgeführt werden. Bei der BGT ist es wichtig, dass Sie über Nacht inkubieren, um sämtliche DNA-Stellen für Ms.P eins zu isolieren, und bei HEPA zwei ist es wichtig, dass Sie mindestens vier Stunden für diese Reaktionen einplanen, um sicherzustellen, dass die Reaktionen vollständig ablaufen.Und schließlich stellen wir DNA-Kontrollen und Primer-Kontrollen bereit, sodass Sie Kontrollreaktionen parallel durchführen können.

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