Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, fünf Methylcytosin- und fünf Hydroxyethylcytosin-Reste innerhalb eines spezifischen Locus der genomischen DNA zu analysieren und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Hydroxylgruppe von fünf Hydroxyethylaminen abgeschirmt wird, wodurch eine spaltbare MSP-I-Stelle in eine nicht spaltbare Stelle umgewandelt wird. Im zweiten Schritt wird die genomische DNA mit den Restriktionsenzymen MSP-I und Hpa-II verdaut, die ihre unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Methylierung nutzen, um glucoserelevante 5-Hydroxyethylcytosin-Stellen zu identifizieren.

Anschließend wird eine PCR verwendet, um den Locus zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von fünf Hydroxyethylcytosin an einem spezifischen Locus. Mit qPCR kann die Menge an fünf Methylcytosin und fünf Hydroxyethylcytosin quantifiziert werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der Bisulfitsequenzierung besteht darin, dass Sie zwischen fünf Methylamin und fünf Hydroxyethylamin unterscheiden können. Die Experimente, die heute durchgeführt werden, basieren auf der Arbeit von Romas Vice Villa, der ein Hauptentwickler dieses Kits bei New England Biolabs war. Vor Beginn dieses Protokolls wurde die genomische DNA aus B-Sehirngewebe wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen gereinigt. Mischen Sie die genomische DNA, UDP-Glucose, Puffer 4 von NEB und ausreichend nukleasefreies Wasser, um ein Gesamtvolumen von 310 Mikrolitern zu erreichen.

Teilen Sie diese Reaktionsmischung auf zwei Reagenzgläser mit jeweils 155 Mikrolitern auf. Geben Sie dann 30 Einheiten oder drei Mikroliter T4-Betaglucosyltransferase in ein Reagenzglas. Mischen Sie gründlich durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren.

Fügen Sie das T vier BGT nicht dem zweiten Reaktionsgefäß hinzu, da es die Kontrollreaktion darstellt; geben Sie stattdessen drei Mikroliter Wasser hinzu. Inkubieren Sie beide Gefäße 12 bis 18 Stunden bei 37 Grad Celsius, wobei die BGT Glukose an die Hydroxylgruppe von fünf Hydroxyethylcytosin-Gruppen in der Probe anhängt. Um mit der Restriktionsenzymverdauung zu beginnen, pipettieren Sie 50 Mikroliter der Reaktionsmischung in jeweils drei mit 1 bis 3 nummerierte 0,2-Milliliter-PCR-Streifengefäße.

Aliquotieren Sie anschließend 50 Mikroliter der Kontrollmischung in jeweils drei PCR-Streifengefäße, die mit vier bis sechs beschriftet sind. Geben Sie 100 Einheiten msp je eine in die Gefäße eins und vier. Fügen Sie danach 50 Einheiten HPA zwei in die Gefäße zwei und fünf hinzu und mischen Sie durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gut durch.

Fügen Sie nichts zu den Röhrchen drei und sechs hinzu, da diese Kontrollen sind. Inkubieren Sie alle sechs Röhrchen bei 37 Grad Celsius für mindestens vier Stunden. Geben Sie anschließend je einen Mikroliter Proteinase K in jedes Röhrchen und inkubieren Sie bei 40 Grad Celsius für 30 Minuten.

Schließlich die Proteinase K durch Inkubation bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten inaktivieren. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von NE B'S long amp TAC für die Endpunkt-PCR demonstriert. Es können jedoch andere PCR-Reagenzien und -Verfahren in einem 0,2-Milliliter-PCR-Reaktionsgefäß auf Eis verwendet werden.

Fügen Sie fünf x langen Amp-TAC-Reaktionspuffer, dNTPs, Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die zuvor gewonnene DNA-Vorlage, long AMP T-DNA-Polymerase und ausreichend nukleasefreies Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 50 Mikrolitern zu erreichen. Mischen Sie die Reaktion vorsichtig gegebenenfalls und sammeln Sie die gesamte Flüssigkeit durch einen kurzen Zentrifugationsschritt am Boden des Röhrchens. Übertragen Sie die PCR-Röhrchen von Eis in einen Thermocycler, dessen Block auf 94 Grad Celsius vorgewärmt ist, und starten Sie das Zyklenprogramm für eine routinemäßige dreistufige PCR.

Es sollte ein anfänglicher Denaturierungsschritt bei 94 Grad Celsius für 30 Sekunden erfolgen, gefolgt von 30 Zyklen mit einer Denaturierung bei 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, einer Annealing-Phase bei 55 bis 65 Grad Celsius für 30 Sekunden und einer Verlängerung bei 65 Grad Celsius für 20 Sekunden oder 50 Sekunden pro kb. Anschließend sollte eine abschließende Verlängerung bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten durchgeführt werden. Echtzeit-PCR kann ebenfalls durchgeführt werden, um die Mengen von 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin zu quantifizieren.

Bitte beachten Sie das Produkthandbuch auf nb.com für spezifische Informationen. Ein Vergleich von fünf Hydroxyethyl-ain-Mengen an Locus 12 wurde mittels Endpunkt-PCR und Echtzeit-PCR durchgeführt. Vier verschiedene Maus-BSY-Gewebeproben wurden analysiert, einschließlich Gehirn, Leber, Herz und Milz.

Die Variation von fünf Hydroxyethylcytosin ist im markierten Geleinsatz der Endpunkt-PCR-Proben zu erkennen, um einen Vergleich zu ermöglichen. Die Echtzeit-PCR-Daten wurden auf ungeschnittene DNA normalisiert, und eine Standardkurve diente zur Bestimmung der Kopienzahl. Die Proben wurden normalisiert, indem die Kopienzahl der Proben durch die Kopienzahl der undigested Kontrolle dividiert wurde.

Hier ist die Variation von fünf Hydroxyethylcytosin ersichtlich, indem man die gelben Balken vergleicht. Einige Hinweise zur Durchführung der Technik: Es ist entscheidend, dass alle enzymatischen Reaktionen vollständig durchgeführt werden. Bei der BGT ist es wichtig, dass Sie über Nacht inkubieren, um sämtliche DNA-Stellen für Ms.P eins zu isolieren, und bei HEPA zwei ist es wichtig, dass Sie mindestens vier Stunden für diese Reaktionen einplanen, um sicherzustellen, dass die Reaktionen vollständig ablaufen.

Und schließlich stellen wir DNA-Kontrollen und Primer-Kontrollen bereit, sodass Sie Kontrollreaktionen parallel durchführen können.