Genaue und einfache Messung der pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β mit einem Vollblut Stimulation Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, proinflammatorische Zytokine zu messen, die in einem Ganzblut-Stimulationsassay produziert werden. Zunächst werden die zellulären Bestandteile des Vollbluts durch Zentrifugation vom Plasma getrennt, und die weißen Blutkörperchen werden mittels Acridinorange-Färbung gezählt. Anschließend werden die Zellen in einer Platte kultiviert und mit LPS stimuliert, gefolgt von einem TP, um die Zytokinproduktion durch Zellen, die mikrobielle Mustererkennungsrezeptoren exprimieren, auszulösen. Danach werden die Kulturüberstände zu bestimmten Zeitpunkten nach Beginn der Stimulation gesammelt.

Abschließend werden die Zytokinkonzentrationen in den Überständen in einem Multiplex-Assay in einer 96-Well-Platte gemessen. Mithilfe dieser einfachen Methode können Variationen in den Konzentrationen proinflammatorischer Zytokine, die von stimulierten Zellen verschiedener Spender produziert werden, schnell bewertet werden. Diese Methode ist besonders nützlich, um eine durch I one vermittelte entzündliche Erkrankung bei Patienten mit pathologisch antiinflammatorischer Manifestation zu identifizieren, insbesondere unter Bedingungen, bei denen das verfügbare Blutvolumen begrenzt ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden bei der Messung von Zytokinkonzentrationen liegt darin, dass die auf Luminex basierende Technologie die gleichzeitige Bestimmung mehrerer Zytokine ermöglicht, wobei nur ein geringes Probenvolumen benötigt wird. Gewinnen Sie Proben, die 10 Milliliter oder mehr venöses Blut von betroffenen Personen sowie von gesunden, hinsichtlich Alter und Geschlecht angepassten Kontrollpersonen enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Proben in Natriumheparin-Vakutainer-Blutentnahmeröhrchen gesammelt werden, und fügen Sie kein EDTA oder andere Antikoagulanzien hinzu, da diese die Analyse stören würden. Bearbeiten Sie die Proben unmittelbar nach der Entnahme so schnell wie möglich. Falls erforderlich, können die Proben bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur unter gedämpftem Licht gelagert werden.

Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 3000 U/min für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bremsung. Nach der Zentrifugation entfernen Sie das Plasma von der Oberseite der Röhrchen, wobei Sie vorsichtig vorgehen, um die Buffy-Coat-Schicht, die mononukleäre Zellen enthält, nicht zu stören. Resuspendieren Sie den Buffy Coat und das darunterliegende Pellet aus roten Blutkörperchen in serumfreiem RPMI-Medium bei Raumtemperatur, um die Zellen zu waschen, und pipettieren Sie die Mischung vorsichtig.

Überführen Sie anschließend die Zellen aus dem Sammelröhrchen in einen 50-Milliliter-Kegel. Auffüllen des Volumens auf 50 Milliliter mit RPMI und vorsichtiges Umstülpen jedes Röhrchens zum Mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 3000 RPM für 10 Minuten.

Anschließend den Überstand vorsichtig abpipettieren, wobei darauf geachtet werden muss, das Zellpellet nicht aufzulösen. Diesen Waschschritt zwei bis viermal wiederholen, um Kontaminationen zu entfernen und zellgebundene Zytokine zu eliminieren. Nach dem Waschen die Zellen in serumfreiem RPMI auf ein Gesamtvolumen von 20 Millilitern resuspendieren. Zum Zählen der Zellen 20 Mikroliter einer 1:1-Mischung aus Probe und Aine Orange in eine Einweg-Counting-Kammer (Soter Vision) geben. Aine Orange, das in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter verwendet wird, färbt ausschließlich kernhaltige weiße Blutkörperchen und ermöglicht so deren Unterscheidung von roten Blutkörperchen.

Zählen Sie nur die D-positiven Zellen, nachdem eine Zellzahl bestimmt wurde. Resuspendieren Sie die Proben in serumfreiem RPMI, um eine Endkonzentration von 2 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen. Beschriften Sie für jede Probe duplicate Wells einer 24-Well-Platte mit den zu testenden experimentellen Bedingungen.

In diesem Fall handelt es sich um die Bedingungen unbehandelt, LPS allein, ein TP allein sowie LPS plus ein TP. Geben Sie ein Milliliter verdünnte Zellen in jede Vertiefung und fügen Sie LPS den entsprechenden Vertiefungen in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie die Proben 2 Stunden und 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach dieser ersten Inkubationszeit fügen Sie das TP in den Vertiefungen „TP allein“ und „LPS plus TP“ in einer Endkonzentration von zwei Millimolar hinzu. Anschließend inkubieren Sie die Platten weitere 20 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach Abschluss der zweiten Inkubation die Zellen aus jedem Well in ein separat vorgelabeltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, die Proben zwei Minuten bei Raumtemperatur mit 10.000 RRP M zentrifugieren und anschließend das Überstand aus jedem Röhrchen in ein neues vorgelabeltes EOR-Röhrchen übertragen. Der Überstand kann unmittelbar zur Bestimmung von Zytokinen verwendet oder eingefroren aufbewahrt werden, um die Konzentrationen von IL-1β oder anderen Zytokinen zu analysieren. Für die Proben verwenden wir das Bio-Plex-Pro-Human-Zytokin-X-plex mit dem Bio-Plex-200-System.

Gemäß den Herstelleranweisungen. In dieser Abbildung zeigt die Analyse der IL-1β-Produktion nach Stimulation normaler Vollblutzellen mit LPS, ATP oder beiden Stimuli zusammen eine Antwort auf LPS plus ATP, deren Ausmaß von der Anzahl der stimulierten Zellen abhängt. Im Gegensatz zu gesunden Kontrollen weisen Vollblutassays von Patienten mit autoinflammatorischen Erkrankungen eine erhöhte IL-1β-Produktion nach LPS-Stimulation in Abwesenheit von exogen zugegebenem ATP auf. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Körperflüssigkeiten wie Blut äußerst gefährlich sein kann, und beachten Sie stets universelle Sicherheitsvorkehrungen, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.