Name: Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie HIV-1-infizierte primäre CD4+ T-Zellen als Zielzellen für NK-Zell-Zytotoxizitätsassays herstellen. Diese Methode nutzt die CD4-Downmodulation durch HIV-1 zur Isolierung hochreiner infizierter Zellpopulationen.

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<ol><li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III%2FLAV-infected+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li>
<li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li>
<li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li>
<li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li>
<li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+endogenously+infected+CD4%2B+T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li>
<li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells%3A+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li>
<li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li>
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Wenn es richtig gemacht die Tests in diesem Protokoll beschriebenen sollte ein repräsentatives Bild der NK-Zellen die Fähigkeit, gegen degranulieren und lysieren HIV-1 infizierten Zellen (siehe Abbildung 5). NK-Zell-Degranulation in Reaktion auf HIV-infizierten Zellen und der NK-Zellen Lyse HIV-infizierten Zellen sollten direkt proportional 10. Zuverlässige Ergebnisse für die beiden NK-Zell-funktionellen Assays, zytotoxische Reaktionen auf HIV-infizierten Zellen zu messen sind abhängig von der Isolierung von hochreinem NK-Zellen sowie ein hochreines Bevölkerung von infizierten Zellen. Nachdem gereinigt NK-Zellen und HIV-1 infizierten Zellen sind von entscheidender Bedeutung für die Erreichung der eine ziemlich genaue Effektor-Verhältnisses Ziel. Ebenso ist das Entfernen von toten und apoptotischen Zellen aus dem Ziel-Zell-Populationen vor 51 Cr Kennzeichnung oder der Inkubation mit den Effektorzellen wichtig. 51 Cr kann durch Zellen, die Apoptose sind als das Vorhandensein von toten oder apoptotischen Zellen während der Isotopenmarkierung Schritt verinnerlicht werden wird in eine hohe spontane Freisetzung führen und den berechneten% spezifische Lyse zu verzerren. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von toten oder apoptotischen Zellen auslösen NK-Zell-Degranulation was zu ungewöhnlich hohen CD107a Ausdruck. Präzise Pipettieren ist notwendig, wenn das Entfernen der zellfreien Überstände nach der Inkubation von NK-Zellen und Zielzellen in der 51 Cr-Release Assays, da die Unterschiede in der Lautstärke der Überstand aus jeder Wiederholung entfernt und wird in hohen Standardabweichungen führen. Änderungen können auf dieser Protokolle vorgenommen werden, um die Rolle spezifischer NK-Rezeptoren bei der Auslösung von NK-Zellen die Lyse von HIV-infizierten Zellen durch Inkubation der Effektoren oder Ziele vor Co-Kultur mit antagonistischen Antikörpern an spezifische Rezeptoren oder Liganden 6,11 zu bewerten. Zytokin-behandelten NK-Zellen (zB IL-2, IL-15) kann verwendet werden, um die Funktionalität der stimulierten NK Zellen 12 zu bewerten. In ähnlicher Weise können Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität erfolgt über diese Protokolle werden. Anti-HIV-Antikörper (zB Anti-gp120) an den Zielzellen für die Erkennung durch die NK-Zelle mit niedriger Affinität Fc-Rezeptor CD16 13 hinzugefügt werden. Diese Assays, obwohl bis zu NK-Zelle zytotoxische Reaktionen auf HIV-infizierten Zellen zu messen, kann auch geändert werden, um die Fähigkeit der NK-Zellen, Zytokine zu folgenden HIV-infizierten Zelle Anerkennung produzieren zu messen. Obwohl wir in diesem Protokoll beschrieben die Verwendung von in vitro infizierten Zellen als Zielzellen haben wir kürzlich die Erzeugung von Ziel-Zellen von Patienten mit HIV infiziert beschrieben. Dies erfordert die Isolierung von CD4 + T-Zellen durch Ausdehnung der Zellen über einen Zeitraum von zwei Wochen nach Stimulation durch Mitogene in Anwesenheit von Interleukin-2 11 gefolgt. Nach der zweiwöchigen Periode der Expansion werden die Protokolle in diesem Artikel beschrieben wird verwendet, um die Zielzellen zu isolieren.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer-Röhrchen (Natriumheparin)</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep CD4+ T-Zell-Isolationskit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CMF PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Lymphozyten-Separationsmedium</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>T-Zell-Expansionskit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>CMF HBSS (1x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>NK-Zell-Negativ-Isolationskit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ Positiv-Isolationskit</td><td>Invitrogen</td><td>113.31D</td><td></td></tr><tr><td>Tote-Zellen-Entfernungskit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;Chrom</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>Gamma-Zählrohre</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>2470 Automatischer Gamma-Zähler</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung und verwendung von hiv-1 infizierten primären cd4 + t-zellen als zielzellen in der natürlichen killerzellen zytotoxische assays

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natürliche Killerzellen (NK)-Zellen sind ein wichtiger Bestandteil der angeborenen Immunantwort auf Virus-infizierte Zellen. Es ist wichtig, die Fähigkeit der NK-Zellen zu erkennen und zu lysieren HIV-1 infizierten Zellen, weil die Identifizierung jeder aberrancy in NK-Zell-Funktion gegen HIV-infizierten Zellen könnte möglicherweise zu Therapien, die ihre zytolytische Aktivität zu erhöhen führen würde verstehen. Es ist notwendig, um HIV-infizierte primäre T-Zell-Blasten als Zielzellen eher dann infizierten-T-Zell-Linien in der Zytotoxizitätsassays verwenden. T-Zell-Linien, auch ohne Infektion, sind sehr anfällig für NK-Zell-Lyse. Darüber hinaus ist es notwendig, autologe primäre Zellen verwenden, um Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I Diskrepanzen zwischen Soll-und Effektor-Zelle, in Lyse Ergebnis zu verhindern. Frühe Studien, die NK-Zelle zytolytische Antworten auf primären HIV-infizierten Zellen keine signifikanten Abtötung der infizierten Zellen 1,2 zeigen. Allerdings mit HIV-1 infizierten primären T-Zellen als Zielzellen in NK-Zellen funktionelle Assays wurde schwierig, da das Vorhandensein von kontaminierenden nicht infizierten Zellen 3. Dieser Widerspruch infizierten Zelle zu Zelle infiziert Verhältnis wird in Variation in NK-Zellen töten zwischen den Proben, die möglicherweise nicht durch Schwankungen in Spender NK-Zell-Funktion führen. So wäre es von Vorteil sein, mit einer gereinigten infizierte Zellpopulation zu arbeiten, um den Effektor zu standardisieren, um Zell-Verhältnissen zwischen 3,4 Experimente Ziel. Hier zeigen wir die Isolierung eines hochgereinigten Bevölkerung von HIV-1 infizierten Zellen durch die Nutzung von HIV-1 die Fähigkeit down-Modulation CD4 auf infizierten Zellen und die Verfügbarkeit von kommerziellen Kits zu entfernen tote oder sterbende Zellen 3-6. Das gereinigte infizierten primären T-Zell-Blasten können dann als Ziele entweder in einer Degranulation oder zytotoxische Assay mit gereinigten NK-Zellen als Effektor-Population 5-7 verwendet werden. Verwendung von NK-Zellen als Effektoren in einer Degranulation Test bewertet die Fähigkeit eines NK-Zellen, die lytische Inhalte spezialisiert Lysosomen 8, genannt &quot;zytolytische Granulat&quot; freizugeben. Durch Färbung mit einem Fluorochrom konjugierte Antikörper gegen CD107a, eine lysosomale Membranprotein, ausgedrückt auf der NK-Zell-Oberfläche, wenn die zytolytische Granulat zur Plasmamembran verschmelzen wird, können wir bestimmen, welcher Prozentsatz der NK-Zellen degranulieren in Reaktion auf Zell-Erkennung Ziel. Alternativ können NK-Zell-lytischen Aktivität in einem zytotoxischen Assay, dass für die Ermittlung des Prozentsatzes der Zielzellen durch Freisetzung von 51 Cr aus der Zielzelle in Gegenwart von NK-Zellen lysiert ermöglicht ausgewertet werden.

Zytotoxizitätsassays auf natürlichen Killerzellen lytische Reaktionen auf HIV-infizierten Zellen zu messen ist durch die Reinheit der Zielzellen beschränkt. Wir zeigen hier die Isolierung eines hochgereinigten Bevölkerung von HIV-1 infizierten primären T-Zell-Blasten durch die Nutzung von HIV-1 s Fähigkeit, down-Modulation CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind eine wesentliche Komponente der angeborenen Immunantwort auf virusinfizierte Zellen. Es ist wichtig, die Fähigkeit von NK-Zellen zu verstehen ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zytotoxische Reaktion der NK-Zellen gegenüber mit HIV-1 infizierten Zellen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst CD4-positive T-Zellen aus venösem Blut isoliert und infiziert werden. Anschließend werden natürliche Killerzellen vom selben Spender isoliert. Anschließend werden nicht infizierte CD4-positive T-Zellen von den infizierten Zellen abgetrennt. Schließlich werden die infizierten Zellen bzw. die NK-Zellen als Ziel- bzw. Effektorzellen in einem von zwei Assays verwendet, um die zytotoxische Wirkung der NK-Zellen zu bewerten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass NK-Zellen auf HIV-V1-infizierte Zellen reagieren können, entweder durch die Hochregulation von CD107a, deren Expression mittels Durchflusszytometrie bestimmt wird, oder durch die Freisetzung von Chrom-51, die mit einem Gammazähler nachgewiesen wird.Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich HIV-1 beantworten, beispielsweise, ob NK-Zellen auf HIV-1-infizierte Zellen reagieren, welche Rezeptor-Ligand-Interaktionen bei der Interaktion zwischen NK- und T-Zellen wichtig sind und ob HIV-1-virale Proteine die Reaktion der NK-Zellen gegenüber HIV-1-infizierten Zellen modulieren. Nach der Stimulation von aus humanem peripherem Blut isolierten CD4-positiven T-Zellen mittels anti-CD3-, anti-CD28-gekoppelter Perlen über 72 Stunden hinweg, zählen Sie die resultierende T-Zell-Population mit einem Hämozytometer und teilen die Kultur anschließend in zwei Gruppen auf: etwa 2 × 10⁶ T-Zellen in einen 15-Milliliter-Konischgefäß als nicht infizierte Kontrollgruppe, und den Rest der CD4-positiven T-Zell-Suspension in ein 50-Milliliter-Konischgefäß für die Infektionsgruppe.Zentrifugieren Sie beide Gruppen bei 300 ×g bei 22 Grad Celsius für 10 Minuten und aspirieren Sie anschließend den Überstand. Suspendieren Sie die CD4-positiven T-Zellen aus dem 50-Milliliter-Röhrchen direkt in Kulturflüssigkeit, die Viren enthält, und geben Sie Polybrain auf eine Endkonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter hinzu. Anschließend infizieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1200 ×g für zwei Stunden bei 20 bis 25 Grad Celsius.Hier werden die Zellen mit DHIV drei bei einer Multiplizität von fünf infiziert. Nach Abschluss der Spin-Infektion entfernen Sie das Überstand und resuspendieren die infizierten Zellen bei einer Dichte von drei mal 10 hoch sechs pro Milliliter in RPMI vollständig, ergänzt mit 100 Einheiten pro Milliliter IL-2.Kultivieren Sie anschließend die nicht infizierten Zellen und die neu infizierten Zellen 72 Stunden lang in einer sechswelligen Platte. Falls ein replikationsinkompetentes Virus zur Infektion der Zellen verwendet wurde, oder fünf bis sieben Tage lang, falls ein replikationskompetentes Virus verwendet wurde, sammeln Sie das Überstand enthaltende infizierte CD4-positive T-Zellkultur und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 ×g für 10 Minuten bei 22 °C mit eingeschaltetem Bremsmodus. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet. Suspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern PBS mit 2 % FBS und zwei Millimolar EDTA und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung eines CD4-positiven Isolationskits.Entfernen Sie die CD4-positiven, nicht infizierten T-Zellen. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Isolierung der CD4-positiven T-Zellen, mit der Ausnahme, dass ein Verhältnis von 1:1 Anti-CD4-Antikörper pro Zelle verwendet wird. Entfernen Sie anschließend die toten Zellen aus der gereinigten, virushaltigen Zellpopulation mithilfe eines Kits zur Entfernung toter Zellen.Gemäß den Herstelleranweisungen die lebende T-Zell-Population sammeln und die gereinigten Zellen 10 Minuten bei 300 G zentrifugieren. Unter Verwendung der Bremse anschließend den Überstand entfernen, den Zellpellet resuspendieren und in einem Milliliter vollständigem RPMI aufnehmen und die Zellen zählen. Periphere Blut-NK-Zellen werden zunächst vom selben Spender isoliert wie die CD4-positiven T-Zellen.Nach der Übernacht-Kultur die NK-Zellen mit einem Hämo-Zytometer zählen, sie 10 Minuten bei 300 × g mit eingeschaltetem Bremsmodus zentrifugieren und dann die Zellen in komplettem RPMI resuspendieren, wobei die Endkonzentration auf 10⁶ Zellen pro Milliliter eingestellt wird. Danach die gereinigten, infizierten und kontrolluninfizierten T-Zell-Suspensionen sammeln und 10 Minuten bei 300 × g zentrifugieren. Mit eingeschaltetem Bremsmodus das SANE entfernen und die Zellpellets resuspendieren.In RPMI vollständig bei zwei mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter für eine positive Kontrolle etwa zwei mal 10 hoch 6 NK-Lyse-empfängliche K562-Zellen werden in diesem Video verwendet. Zentrifugieren Sie die K562-Zellen bei 300 × g für 10 Minuten mit Bremse, dann entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in RPMI vollständig bei zwei mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter.Nachdem alle Zellpopulationen gewaschen und in ihren experimentellen Konzentrationen resuspendiert wurden, mischen Sie die NK-Zellen entweder mit K562-Zellen, nicht infizierten T-Zellen oder HIV-infizierten T-Zellen. In einzelnen Vertiefungen einer 96-Loch-V-Boden-Platte wird jeweils nur ein Replikat pro Zielzelltyp verwendet, um die unspezifische Degranulation der NK-Zellen zu messen. Geben Sie 100 Mikroliter NK-Effektorzellen und 100 Mikroliter Medium allein in eine Vertiefung.Geben Sie den fluorochromkonjugierten Anti-CD107a-Antikörper in einem Volumen von 10&nbsp;Mikroliter in jede Vertiefung und zentrifugieren Sie die Platte bei 20&nbsp;×&nbsp;g für zwei Minuten mit Bremse bei 22&nbsp;°C. Inkubieren Sie anschließend die Platte für vier Stunden bei 37&nbsp;°C und 5&nbsp;% Kohlendioxid. Zentrifugieren Sie danach die Platte bei 400&nbsp;×&nbsp;g für fünf Minuten mit Bremse bei 22&nbsp;°C und entfernen Sie die Überstände mit einer 2-Milliliter-Aspirationspipette, die mit einer P200-Spitze ausgestattet ist.Fügen Sie anschließend 100 µL Flusspuffer in jede Mulde hinzu und färben Sie die Zellen mit Anti-CD3 14-20 Pacific Blue-Antikörpern und Anti-CD56 APC-Antikörpern auf Eis 20 Minuten lang. Nach der Färbung fügen Sie 200 µL Flusspuffer zu jeder Mulde hinzu und zentrifugieren die Platte fünf Minuten bei 400 ×g. Bei einer Bremstemperatur von 22 °C saugen Sie vorsichtig den Flusspuffer aus jeder Mulde ab.Unter Verwendung einer zweimilliliterigen Aspirationspipette, die mit einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze ausgestattet ist, und darauf achten, dass das Pellet nicht gestört wird, die Zellen erneut waschen und anschließend die Pellets in 200 Mikrolitern 1 % Paraformaldehyd in kalzium- und magnesiumfreier PBS resuspendieren. Abschließend die Zellsuspensionen in Durchflussröhren überführen und das Gesamtvolumen in den Röhren durch Zugabe von jeweils etwa 100 Mikrolitern 1 % Paraformaldehyd in kalzium- und magnesiumfreier PBS auf 300 Mikroliter ergänzen. Anschließend zwei Mal 10 hoch vier NK-Zell-Ereignisse mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der Software FACS Diva erfassen und die Daten mit der Software FlowJo analysieren. Gereinigte HIV-V1-infizierte und nicht infizierte T-Zell-Ziele mit 125 Mikrocurie Chrom-51 in physiologischer Kochsalzlösung pro 10 hoch sechs Zellen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einer 15-Milliliter-Konikalröhre als positiven Kontrollansatz markieren; zudem 10 hoch sechs K562-Zellen zwei Stunden lang mit 100 Mikrocurie Chrom-51 markieren.Unter denselben Kulturbedingungen. Verwenden Sie RPMI komplett, um das Endvolumen der Färbelösung für jede Zellpopulation auf 500 Mikroliter einzustellen. Das Volumen von Chrom 51, das den Zielzellen zugesetzt wird, wird mithilfe des universellen Radioaktiven-Zerfall-Rechners berechnet, der auf der PerkinElmer-Website verfügbar ist, während die Zielzellen markiert werden.Entfernen Sie zuvor isolierte NK-Zellen aus der Kultur und zählen Sie sie; zentrifugieren Sie die NK-Zellen 10 Minuten bei 300 G mit eingeschalteter Bremse und resuspendieren Sie die Zellpellets in vollständigem RPMI. Verteilen Sie die resultierenden Zellsuspensionen auf drei konische 15-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie die Zelldichte im ersten Röhrchen auf 10⁵ pro Milliliter, im zweiten Röhrchen auf 2,5 × 10⁵ pro Milliliter und im dritten Röhrchen auf 5 × 10⁵ pro Milliliter ein. Die NK-Zellen im dritten Röhrchen werden als Effektorzellen im Chrom-51-Freisetzungsassay in einem Verhältnis von 1:1, 2,5:1 bzw. 5:1 verwendet.Entfernen Sie die nun markierten Zielzellen aus dem Inkubator und geben Sie 4,5 Milliliter RPMI vollständig zu jedem Röhrchen hinzu. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 G für 10 Minuten. Gießen Sie dann vorsichtig den Überstand in einen Behälter für radioaktive Flüssigabfälle, ohne den Pellet zu stören.Die Zielzellen zwei weitere Male waschen, um sämtliches nicht adsorbiertes Chrom-51 zu entfernen. Der Überstand der dritten Wäsche kann in einem Behälter für nicht radioaktive Flüssigabfälle entsorgt werden. Anschließend die Zielzellen erneut in RPMI vollständigem Medium resuspendieren, um eine endgültige Zelldichte von 10⁵ pro Milliliter zu erreichen, wie hier als Beispiel für einen typischen Aufbau eines Chrom-51-Freisetzungsassays gezeigt.Beachten Sie, dass jede Gruppe in dreifachen Aliquoten durchgeführt wird: 100 Mikroliter markierte Zielzellen in jede der angegebenen Vertiefungen einer 96-Well-V-Boden-Platte überführt werden, um eine endgültige Zellzahl von 10 hoch 4 Zielzellen pro Vertiefung zu erreichen. Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter der NK-Zellsuspensionen in den entsprechend angegebenen Effektor:Zielzell-Verhältnissen zu den Zielzellen hinzu. Danach werden 100 Mikroliter Zielzellen in die entsprechenden Vertiefungen gegeben, in denen die Effektorzellen für die Gruppen der maximalen und spontanen Freisetzung fehlen.Ergänzen Sie die Gruppe mit spontaner Freisetzung um zusätzliche 100 Mikroliter vollständiges RPMI, zentrifugieren Sie die Platte bei 20 ×g für zwei Minuten mit Bremse und inkubieren Sie anschließend die Platte für vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der vierstündigen Inkubation fügen Sie fünf Mikroliter einer 1:10-Verdünnung von menschlichen roten Blutkörperchen in vollständigem RPMI in jedes Loch hinzu, mit Ausnahme der Löcher für maximale Freisetzung; danach geben Sie 100 Mikroliter 10 %iger Natrium-ESAL-Lösung zu den Löchern für maximale Freisetzung und zentrifugieren die Platte bei 400 ×g für fünf Minuten. Um die Zellen abzulesen, beschriften Sie ein Gamma-Zählrohr für jedes experimentelle und Kontrollloch.In der 96-Loch-Platte jeweils 100 Mikroliter zellfreies Überstand aus jedem Loch ernten und den Überstand aus jedem Loch in vorbereitete Röhrchen geben. Die Menge an Chrom 51 in jedem Röhrchen mit einem automatischen Gamma-Zähler PerkinElmer 24 70 messen. Die folgenden Streudiagramme zeigen eine typische Durchflusszytometrie-Gating-Strategie zur Analyse der Ergebnisse einer CD 1 0 7.Ein Degranulations-Assay. Zunächst werden Einzelzellen selektiert, wobei Aggregate oder Doppelzellen in einem Plot von FSCA gegen FSCH ausgeschlossen werden. Anschließend wird die Gate für Einzelzellen, dargestellt als FSCA gegen SSC, auf die Lymphozytenpopulation gesetzt, die erneut durch die rosa Farbmarkierung gekennzeichnet ist.Das Lymphozyten-Tor wird anschließend als CD 3 14 20 gegen CD 56 dargestellt, wobei auf die CD 56-positive und CD 3 14 20-negative Population, wie durch das vertikale rosa Oval angegeben, gezielt ausgewählt wird. Hier wird die NK-GA als CD 1 0 7 A gegen CD 56 dargestellt, um NK-Zellen sichtbar zu machen, die in den folgenden beiden Abbildungen degranuliert haben. Repräsentative Ergebnisse der Beurteilung der zytotoxischen Reaktion natürlicher Killerzellen gegen HIV-eins-infizierte Zellen werden hier gezeigt. Die NK-Zellen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Degranulation ohne Zielstrukturen sowie als Reaktion auf K 5 62-Zellen, primäre CD vier-positive T-Zellen und HIV-infizierte primäre T-Zellen untersucht, gemessen am Prozentsatz der NK-Zellen, die die Oberflächenmarkierung CD 1 0 7 A exprimieren. Die Zahlen in jedem Quadranten repräsentieren den Prozentsatz der gesamten NK-Zellen in dieser Abbildung.NK-Zellen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, K562-Zellen, nicht infizierte CD4-positive T-Zellen sowie HIV-1-infizierte T-Zellen in einem Chrom-51-Freisetzungs-Assay bei Effektorzellen-Targetzellen-Verhältnissen von 2,5:1, 5:1 und 7,5:1 nach ihrer Entwicklung zu lysieren. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der HIV-1-Biologie den Weg, um zu untersuchen, wie natürliche Killerzellen auf HIV-1-infizierte Zellen bei HIV-infizierten Patienten reagieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

Mehrere 2'-Fluoro RNA-Aptamere gegen HIV-1Ba-L gp120 mit Nanomol Affinität von einer RNA-Bibliothek isoliert...

Entwicklung von Zell-spezifischen Anti-HIV-gp120-Aptamere für siRNA

Dieses Video zeigt die Durchführung eines Laktat-Dehydrogenase-Freisetzungsassays, um die Zytotoxizität von natürlichen Killerzellen (NK) gegenüber den Zielkrebszellen zu bestimmen. Der Assay quantifiziert die Freisetzung des zytoplasmatischen Laktatdehydrogenase-Enzyms aus Krebszellen, indem er die Absorption des gebildeten rot gefärbten Produkts misst.

Ein In-vitro-Assay zur Bewertung der Zytotoxizität natürlicher Killerzellen gegen Krebszellen

CD4+ Regulatorische T-Zellen sind potente Immunmodulatoren und erfüllen wichtige Funktionen bei der Immunhomöostase. Der Mangel an diesen Zellen im peripheren Blut macht funktionelle Studien, insbesondere im Zusammenhang mit HIV-1-Infektionen, zu einer Herausforderung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Isolierung und Expansion funktioneller CD4+ Tregs aus peripherem Blut von HIV-1-infizierten Personen.

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

Wir entwickelten ein in vitro Assay, um die Rolle von immunWege in der Regulation der Zytokin-Sekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen zu untersuchen.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

Anders als zellfreie HIV-1-Partikeln infiziert sind CD4 + -T-Zellen wirksam durch plasmacytoid dendritischen Zellen (pDC) abgetastet. Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren, bei peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder isolierten pDCs co-kultiviert, das mit HIV-1 infizierte T-Zellen, um angeborene Erfassung durch pDCs bewerten, wie durch Freisetzung von Typ-I-IFN beurteilt.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

Das Ziel dieser Studie war es, Technologien zu formulieren, die für erfolgreiche gen Transduktion in primären natürlichen killer (NK) Zellen ermöglichen. Die Dextran-vermittelten Lentivirale Transduktion von Mensch oder Maus primären NK Zellen führt zu höheren Wirkungsgraden der gen-Expression. Diese Methode des Gens Transduktion wird NK Zelle genetischen Manipulation erheblich verbessern.

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Eine einfache Methode für den Erhalt der NK und T-Zell-Klone von CAEBV Patienten wurde mit hohem Wirkungsgrad, eine kleine Menge des peripheren Blutes und einen Low-Dose von IL-2 entwickelt.

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

In diesem Artikel beschreiben wir einige etablierte Methoden zur Bestimmung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort (UPR), mit besonderem Schwerpunkt auf HIV-1-Infektionen. In diesem Artikel wird auch eine Reihe von Protokollen beschrieben, um die Auswirkungen von ER-Stress/UPR auf die HIV-1-Replikation und die Infektiosität der Virionen zu untersuchen.

Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation

Erfahren Sie, wie Sie HIV-1-infizierte primäre CD4+ T-Zellen als Zielzellen für NK-Zell-Zytotoxizitätsassays herstellen. Diese Methode nutzt die CD4-Downmodulation durch HIV-1 zur Isolierung hochreiner infizierter Zellpopulationen.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays (Video) | JoVE Journal

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

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