Immunzytochemie: Human Neural Stem Cells

Hallo, ich bin Steve. Ich arbeite im Labor von Dr. Flanagan in der Abteilung für Pathologie an der UC, Irvine. Und heute zeige ich Ihnen, wie man die Immunchemie von menschlichen neuronalen Vorläuferzellen durchführt.

Dieses Protokoll umfasst das Auflegen von Zellen auf eingelegte beschichtete Deckgläser und das Blockieren und Inkubieren von Zellen in Primärantikörpern über Nacht, und dann das Auflegen mehrerer Schichten und das Aufsetzen von Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur. Und schließlich die Montage der Deckgläser an den Mikroskopflügeln. Fangen wir an.

Zuerst lege ich also drei sterile deutsche Glasdeckgläser mit einem Durchmesser von 12 Millimetern in eine 24-Well-Platte, um sie mit Laminat zu beschichten. Jetzt habe ich also meine Deckgläser in der Platte, und zuerst füge ich eine Lösung aus PDL-Polylysin hinzu, und ich werde die Deckgläser fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in PDL inkubieren. Nach fünf Minuten entferne ich PDL und trage Laminin auf, und ich werde die Deckgläser mindestens vier Stunden oder besser über Nacht in Laminat inkubieren.

Also habe ich die Platte über Nacht in Laminat inkubiert, und jetzt werde ich die Deckgläser mit PBS spülen und menschliche neuronale Vorläuferzellen plattieren, die ich bereits gezählt habe. Also habe ich gerade die Laminatlösungen entfernt und werde jetzt die Deckgläser mit PBS zügeln. Jetzt werde ich PBS entfernen und die Medienlösung aufsetzen.

Und endlich bin ich bereit, die Zellen zu sehen. Ich werde also die Zellen bei hunderttausend Zellen pro Mühle sehen, was bedeutet, dass ich für eine 24-Well-Platte 50.000 Zellen pro Well hinzufügen werde, weil, weil jede Vertiefung einen halben Milliliter enthält. Also kippe ich die Platte von einer Seite zur anderen, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig auf der Oberfläche des Deckglases verteilen.

Und jetzt werde ich sie für mindestens 24 Stunden in den Inkubator legen, damit sie sich beruhigen und für die Immunchemie verteilen können. Die Zellen sind also seit 24 Stunden gewachsen und ich habe sie mir angeschaut und sie sind angeheftet und schön verteilt. Jetzt werde ich sie also mit 4%perfor Höhe für fünf Minuten fixieren.

Aber zuerst werde ich das Medium entfernen und ich möchte die Zellen nicht austrocknen lassen. Also werde ich das Medium entfernen und gleichzeitig Fixiermittel hinzufügen. Man nennt es also eine Zweihandtechnik.

Jetzt werde ich die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in Fixiermittel inkubieren. Es sind also fünf Minuten vergangen. Ich entferne PFA und lege es in den PFA-Abfallbehälter und füge PBS hinzu, während ich gleichzeitig PFA entferne, damit die Zellen nicht austrocknen.

Ich werde also eine dieser Kunststoff-Saugpipetten verwenden, um PFA herauszuziehen, und ich werde den Timer auf fünf Minuten stellen. Während sich meine Zellen also in PBS-Waschung befinden, werde ich mit Triton X 100 eine Perme-Visualisierungslösung vorbereiten. Es ist ein nichtionisches Waschmittel und es ist sehr, sehr viskos.

Daher ist es wichtig zu warten, bis die gesamte Lösung in die Pipette gelangt ist. Ich werde also eine 0,3%ige Lösung in PBS vorbereiten und 10 mils PBS hinzufügen. Und zu diesen 10 mil PBS füge ich 30 Mikroliter Tri next 100 hinzu.

Also werde ich 30 Mikroliter Tri next 100 bis 10 mils PBS hinzufügen. Ich werde also etwa 10 Sekunden hinzufügen, damit die gesamte Lösung in die Spitze gelangt. Also, ich, ich habe hier meine Lösung zur Dauerverwertung.

Ich lege es für 10 Minuten auf den Rotator und dann vertexe ich es, um sicherzustellen, dass sich das viskose Tritton vollständig aufgelöst hat. Jetzt bin ich bereit, den Schritt der Perme-Visualisierung durchzuführen. Und so werde ich es für immer fünf Minuten bei Raumtemperatur machen.

Es sind also fünf Minuten vergangen. Ich werde jetzt drei fünfminütige PBS-Wäschen machen, um sicherzustellen, dass das gesamte Triton weggespült wird. Also werde ich die Uhr wieder auf fünf Minuten stellen.

Ich habe gerade alle meine Waschschritte abgeschlossen, also bin ich bereit, den Blockierungsschritt zu machen. Für den Blockierungsschritt habe ich eine 5%BSA-Lösung in PBS vorbereitet. Und genau wie bei allen Waschungen werde ich das PBS entfernen und gleichzeitig die Blockierungslösung hinzufügen.

Und der Blockierungsschritt wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur dauern. Während meine Zellen also blockiert sind, werde ich die Platte für die Inkubation der primären Antikörper vorbereiten. Ich beginne also mit dieser Glasplatte und schneide ein Stück Para-Film, das ungefähr so groß ist.

Und was ich tun werde, ist, dass ich es umwickeln werde und ich brauche etwas Klebeband, also brauche ich vier Stücke Klebeband. Also werde ich sie einfach alle vorbereiten. Ich nehme also dieses Stück Para-Folie und glätte es, so dass die Oberfläche schön glatt ist.

Und dann nehme ich jedes Ende und klebe es an die Rückseite der Glasplatte. Jetzt ziehe ich das andere Ende, um sicherzustellen, dass die Oberflächen gerade sind, und ich klebe das andere Ende an die Rückseite. Jetzt brauche ich also noch ein Stück Paarfolie in der gleichen Größe wie das erste.

Und im Grunde werde ich das Gleiche tun. Also klebte ich ein zweites Stück Para-Folie auf das erste, genau wie das erste, außer dass ich ein Ende des zweiten Stücks Perfil locker gelassen habe, weil ich die Antikörperlösung platzieren und dann Power-Slips auf das erste Stück legen werde. Und dann lege ich das zweite Stück darauf, das ein Sandwich ergibt.

Aber im Moment werde ich die Stelle beschriften, an der ich die Antikörperlösung und die Abdeckung platzieren werde. Also, die Zellen sind jetzt seit einer Stunde in der Blocklösung, und ich werde jetzt die Deckgläser auf Tröpfchen des Primärantikörpers für die Inkubation über Nacht kleben. Ich werde also einen Tropfen mit 35 Mikrolitern Primärantikörper geben und sehr vorsichtig sein, nicht die gesamte Flüssigkeit auszustoßen, da dies Blasen erzeugen könnte und Blasen die Bindung des Antikörpers an das Antigen beeinträchtigen könnten.

Ich möchte also versuchen, Blasen in dem Tropfen zu vermeiden, alle drei Tropfen des Primärantikörpers, und ich bin bereit, auf diese Tropfen Deckgläser mit Zellen zu legen. Was ich jetzt also tun werde, ist, dass ich einen Deckzettel aufheben werde. Zuerst schiebe ich also den Deckglas zur Seite und versuche, ihn mit geöffneter Pinzette vorsichtig anzuheben.

Sobald ich das Gefühl habe, dass ich den Deckglas in den Griff bekommen habe, schließe ich die Pinzette langsam und hebe den Deckglas vorsichtig aus der Vertiefung. Die Zellen befinden sich jetzt also oben auf dem Deckglas. Was ich also tun werde, ist, umzukehren und den Tropfen sanft zu berühren und ihn langsam auf den Tropfen zu legen, ohne Blasen zu erzeugen.

Und so werde ich das gleiche Verfahren mit dem zweiten und dritten Deckglas wiederholen. Und der letzte Schritt besteht darin, das zweite Stück Para-Folie darauf zu legen. Und die Art und Weise, wie ich es machen werde, ist, dass ich es in einer einzigen Bewegung so ablegen werde.

Ich möchte versuchen, mich nicht zu bewegen, sondern es von einer Seite zur anderen zu bewegen. Und zum Schluss werde ich es mit einem weiteren Stück Klebeband an der Unterseite der Platte befestigen. Und jetzt sind die Zellen endlich bereit, über Nacht bei vier Grad inkubiert zu werden, und das ist das Ende des ersten Tages der Immunchemie.

Dies ist der zweite Tag der Immunchemie, und ich werde die Deckgläser fünf Minuten lang in PB S3 waschen. Und dann werde ich zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einem Sekundärantikörper inkubieren. Zuerst schneide ich die Para-Folie so ab, damit ich die Deckgläser entfernen kann.

Und ich hebe das obere Stück der Para-Folie langsam an, so dass die Deckgläser auf dem unteren Stück der Pflege-Para-Folie verbleiben. Also habe ich das erste Stück entfernt und habe eine Platte mit PBS-Waschlösung bereit. Also hebe ich jede Decksuppe an und lege sie in die Vertiefung, um alle verbleibenden primären Antikörper abzuwaschen, die nicht an das Epitop gebunden sind.

Um den Deckzettel anzuheben, werde ich ihn zuerst mit einer Rasierklinge so halten und einfach vorsichtig versuchen, ihn aufzuheben. Und da die Zellen der Antikörperlösung zugewandt sind, werde ich sie so umdrehen, dass sie jetzt oben sind, und sie in die Vertiefung schieben, so dass sie immer noch oben verbleiben. Und ich werde den Vorgang für die verbleibenden Power-Slips wiederholen.

Und so werden sie fünf Minuten lang gewaschen. Es sind also fünf Minuten vergangen. Ich werde die PBS-Lösung ersetzen.

Ich werde die Haken stanzen hinzufügen. Jetzt werde ich es fünf Minuten lang inkubieren. Die Inkubation der Haken ist also abgeschlossen, und jetzt bin ich bereit, die Abdeckung sos und zu montieren und sie mir anzusehen.

Zuerst werde ich also einen Quad-Vektor-Schild verwenden, der hilft, die fluoreszierenden Groschen vom Bleichen abzuhalten. Ich werde zuerst die Folie mit dem beschriften, mit der Anzahl der Deckblätter, und dann werde ich 10 Mikroliter Vektorschild platzieren. Vector Shield ist ein Öl und es ist wirklich viskos, also ist es auch wichtig, ein wenig zu warten, bis alles in die Spitze gelangt.

Also habe ich den Vektorschild auf dem Objektträger platziert, und jetzt bin ich bereit, die Deckgläser auf dem Objektträger zu platzieren. Was ich also zuerst tun werde, ist, dass ich einen Deckglas aufnehme und die Rückseite des Deckglases mit deionisiertem Wasser abspüle, denn wenn ich das nicht tue, wird das Salz, das in PBS enthalten war, beim Austrocknen kristallisieren und die optischen Eigenschaften von fluoreszierenden Stempeln beeinträchtigen. Also werde ich, ich habe mein deionisiertes Wasser bereit.

Und so nehme ich den Deckglas und spüle die Rückseite mit entionisiertem Wasser ab. Und dann werde ich ein Blechtuch anrühren, um es zu trocknen. Und dann werde ich es wieder invertieren, so dass die Zellseite invertiert wird und auf den Objektträger fällt.

Und genau wie zuvor werde ich den Tropfen des Vektorschilds berühren und ihn langsam absenken, ohne Blasen einzufangen. Und ich werde das Gleiche, die gleiche Prozedur für alle Cargo-Flips wiederholen. Und jetzt schauen wir uns das mal an.

Dies ist ein Beispiel dafür, was Sie erhalten könnten, nachdem Sie Immunchemie betrieben, Ihre Bilder erhalten und Overlays erstellt haben und dergleichen. In diesem Bild, das, das ist ein Bild von hippokampalen Neurostammzellen, die aus Dent Gys in postnatalen Mäusen isoliert wurden. Heute habe ich Ihnen gezeigt, wie man Immunchemie von menschlichen neuralen Vorläuferzellen durchführt.

Und wenn Sie es bemerken, können Sie mit dieser Technik das expansive Antikörperreagenz aufbewahren. Wir verwendeten ein sehr kleines Volumen an primären und sekundären Antikörpern, indem wir einen kleinen Tropfen auf ein Perfil gaben und das Deckglas mit den Zellen darauf invertierten. Also machen Sie weiter, machen Sie Immuntherapie-Chemie und danke, dass Sie mir zugesehen haben.