Eine β-Glucuronidase (GUS) Basierend Cell Death Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe eines Gus-Reportersystems die potenziellen Todeseigenschaften bestimmter Gene zu analysieren. Gene von Interesse werden in eine Gus-Kassette kloniert und in den entsprechenden Agrobacterium-Vektoren unter einem 35-s-Promotor gezüchtet. Diese Vektoren werden dann in den Agrobacterium-Stamm LBA 44 0 4 umgewandelt und mit einer Kultur gemischt, die eine Gus-Expressionskassette enthält, um die Blätter von Nick Oceana Hamana zu infiltrieren.

Die Gus-Aktivität kann visuell durch histochemische Färbung oder quantitativ durch einen fluormetrischen Becher-Assay beurteilt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie DNA-Laddering oder Tunnel-Assay wird häufig in Säugetiersystemen verwendet, ist aber in Pflanzen schwer zu reproduzieren, da es sich um einen empfindlichen, schnellen transienten Assay auf pflanzlicher Basis handelt, der sich die einfache Tatsache zunutze macht, dass lebende Zellen für die Gasexpression erforderlich sind. Das Verfahren wird heute von Hua RAOs demonstriert.

Als Postdoktorand in unserem Labor benötigt die Infiltration vollständig ausgebreitete, gesunde Blätter von drei bis sechs Wochen alten Nicotiana Hamana-Pflanzen, die bei 25 Grad Celsius wachsen. Planen Sie, dieses Protokoll über acht Tage durchzuführen. Am ersten Tag knirscht der Streifen mit Glycerin, die Bestand an Agrobacterium-Tumor, Fassan, das die Vektoren für den Zelltod-Assay enthält, und der Vektor mit der Gus-Expressionskassette enthalten auch immer einen leeren Vektor als Negativkontrolle oder Stuffer, wenn mehrere Kulturkombinationen getestet werden.

Inkubieren Sie die Platten zwei Tage lang bei 28 Grad Celsius. Am dritten Tag impfen Sie zwei Milliliter selektives LB mit einer einzigen Kolonie aus jeder Platte. Inkubieren Sie jede Kultur, indem Sie sie 24 Stunden lang bei 28 Grad Celsius und 200 U/min schütteln, bis die maximale Wachstumsdichte erreicht ist.

Nach 24-stündiger Inkubation wird die Kultur durch Pipettieren vollständig resuspendiert, wenn Verklumpungen vorhanden sind, und das Gesamtvolumen für jede Kultur auf 10 Milliliter mit frischem selektivem LB erhöht, um Agrobacterium-Virulenzgene zu induzieren. Geben Sie Aceton zu 25 Mikromolaren und inkubieren Sie jede Kultur unter Schütteln bei 28 Grad Celsius für weitere 16 Stunden. Der nächste Schritt besteht darin, jede Kultur bei 4.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu zentrifugieren und das Pellet in 10 Millilitern Infiltrationsmedium zu suspendieren.

Kein Aceton hinzufügen, die Kulturen erneut zentrifugieren, sondern jetzt Resus. Jedes Pellet wird in fünf Millilitern Infiltrationsmedium suspendiert, das 100 mikromolares Aceton enthält. Messen Sie nun den Außendurchmesser bei 600 Nanometern.

Konzentrationen von nur 0,1 sind akzeptabel, aber wenn sie größer als 0,9 sind, dann vor der Infiltration mit Infiltration, Medium und Aceton auf 0,9 verdünnen. Inkubieren Sie die Kulturen erneut bei 28 Grad Celsius und schütteln Sie sie drei Stunden lang nach der Inkubation. Mischen Sie die Versuchskulturen und Kontrollkulturen im Eins-zu-Eins-Verhältnis mit der Kultur, die die Gus-Kassette enthält.

Verwenden Sie für jede Kultur eine nadellose Ein-Milliliter-Spritze, um das ABA-Siegel oder die Unterseite der neu entstehenden Blätter zu infiltrieren. Das Infiltrationsvolumen spielt keine Rolle. Wenn sich eine Einweichfläche bildet, in der genügend Wasser hinzugefügt wurde, infiltrieren Sie sowohl die Negativkontrolle als auch das zu testende Gen auf gegenüberliegenden Blättern derselben Pflanze und infiltrieren Sie dann zwei weitere Pflanzen auf die gleiche Weise.

Es gibt also für jede Kultur dreifache Pflanzen. Drei Tage nach der Infiltration ist es an der Zeit, die Blätter zu sammeln und auf die Expression von Böenprotein zu testen. Beginnen Sie die histochemische Analyse, indem Sie das gesamte Blatt mit xlu-Substrat vakuuminfiltrieren, bis es vollständig durchnässt ist.

Inkubieren Sie die Blätter nun über Nacht dunkel bei Raumtemperatur oder bis eine deutliche blaue Färbung auftritt, wenn eine blaue Färbung sichtbar ist. Spülen Sie die Blätter in destilliertem Wasser ab und inkubieren Sie sie über Nacht in 70%igem Ethanol, bis ihr Chlorophyll entfernt ist. Spülen Sie am nächsten Tag die Blätter und das destillierte Wasser ab und beurteilen Sie die GUS-Expressionswerte.

Um die Gus-Expression zu quantifizieren, wird ein Substratbecher in ein fluoreszierendes Produkt mu umgewandelt, das gemessen werden kann, indem infiltrierte Blattscheiben in einem Mörser mit flüssigem Stickstoff gemahlen werden. Fügen Sie dann 100 Mikroliter GUS-Extraktionspuffer hinzu, während Sie die Probe auf Eis halten. Zentrifugieren Sie nun die Suspension bei 14.000 GS pro fünf Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand mit den gesamten löslichen Proteinen, zu dem auch Gus gehört.

Messen Sie die Gesamtkonzentration löslicher Proteine mit einem NanoDrop und stellen Sie die Konzentration auf 100 Mikrogramm Gesamtprotein für jede Probe im Gus-Extraktionspuffer ein. Geben Sie nun Bechersubstrat in Gus-Extraktionspuffer zu jeder Probe bis zu einer Endkonzentration von zwei Millimolaren Bechern. Ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Probe sollte durch Pipettieren ausreichend gemischt werden und die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Stoppen Sie die Reaktion nach einer Stunde, indem Sie 800 Mikroliter Böenstopppuffer hinzufügen. Um das mu zu quantifizieren, werden 100 Mikroliter jeder Probe auf eine Mikrotiterplatte geladen, die in einem Plattenleser analysiert wird; die Fluoreszenz bei 365 Nanometern Anregung und 455 Nanometern Emissionswellenlängen wird gemessen und mit einer Standardkurve verglichen, die Guss-Aktivität kann dann als M mu pro Mikrogramm des gesamten löslichen Proteins pro Minute Reaktion angegeben werden. Je nach verwendetem Konstrukt werden unterschiedliche Böenniveaus detektiert, wenn die GUS-Expressionskassette mit einem negativen Regulator des Zelltods oder einem Anti-Todes-Gen infiltriert wird.

Im Vergleich dazu sind hohe Böen zu beobachten. Die Gus-Pegel in der leeren Vektorsteuerung sind viel niedriger. Umgekehrt, wenn ein positiver Regulator des Zelltods oder ein Pro-Death-Gen verwendet wird, wird eine Marktreduktion der Gus-Expression im Vergleich zur Kontrolle des leeren Vektors beobachtet.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Woche durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Technik als erster Schritt verwendet wird, um das Potenzial bestimmter Gene zu bestimmen. Es müssen weitere Arbeiten durchgeführt werden, um diese ersten Ergebnisse zu bestätigen und den Zelltyp zu bestimmen, um den es sich handelte.