Name: Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Erfahren Sie die bioorthogonale Click-Chemie zur schnellen Markierung von Glykanen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht dynamische In-vivo-Bildgebung fucosylierter Glykane während der Entwicklung.

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Und Anschubfinanzierung von Albert Einstein College of Medicine; Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health (3U54AI057158-06S1 zu RDS GM093282 zu PW) unterstützt.

1. Egg Collection und Dechorionation <ol><li> Sammeln und Transfer Zebrafisch-Eier zu 35mm Petrischale, so viel Wasser wie möglich zu entfernen und fügen Sie dann 1 mg / ml Pronease E in E3 Embryo Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4), um das Chorion zu verdauen. </li><li> Nach 3-5 Minuten verschmelzen die Schüssel in ein Becherglas mit Fisch Wasser (60 mg "Instant Ocean" pro Liter destilliertem H 2 O) gefüllt und sanft Übertragung der Eier in das Becherglas und lassen die Eier zu "stürzen" ins Wasser. </li><li> Spülen Sie die Eier mit Fisch Wasser dreimal. Die meisten Eier werden aus ihren Chorion veröffentlicht werden. </li><li> Mit einem Feuer-poliertem Glas Pasteur Pipette die dechorionated Eier Agarose beschichteten Petrischalen mit E3 Embryo Medium gefüllt ist. </li></ol> 2. Mikroinjektion mit einem BIP-FucAl <ol><li> Bereiten Sie die Injektion Gerichte nach dem Berichtsmonat Protokoll 7. </li><li> Transfer dechorionated Eier in Injektion Gerichte mit E3 Embryo Medium gefüllt ist. </li><li> Bereiten Sie die Nadel und Last mit 2 ul Injektionslösung. Diese Lösung enthält 20 mM GDP-FucAl synthetisiert chemoenzymatisch 8 und entweder Alexa Fluor 594-Dextran (5% w / v) als Tracer oder Phenolrot Loading Dye (0,1% w / v) in 0,2 M KCl. Als Negativ-Kontrolle, ersetzen BIP-FucAl mit GDP-Fucose in Injektionslösung. </li><li> Break the Nadel und stellen Sie den Einspritzdruck und die Dauer einer 1 nL drop 9 ergeben. </li><li> Spritzen Sie die Eier mit 1 nL der jeweiligen Lösung. </li><li> Übertragen Sie die Eier in Agarose-beschichteten Petrischalen mit E3 Embryo Medium gefüllt ist. </li><li> Inkubieren Eier bei 28 ° C und entfernen Sie die unbefruchteten Eier in drei Minuten vor vier Stunden nach der Befruchtung. </li></ol> 3. BTTES-Cu (I)-katalysierten Klick-Chemie Reaction <ol><li> Wenn die Embryonen erreichen Entwicklungsstadien (zB verspätete Gastrula-, Gewebe-Segmentierung und der frühen Larve), Mantel der Basis einer 96-Well-Platte mit Agarose gewünscht. </li><li> Add 92 ul E3 Embryo Medium in jede Vertiefung, durch Zugabe von 4 ul Alexa Fluor-488-Azid gefolgt (von 2,5 mM Lager in H 2 O), 2 ul BTTES-CuSO 4 6.01 komplex, und schütteln Sie sie leicht zu mischen. </li><li> Transfer-Embryonen in den Brunnen mit dem Klick-Chemie-Reagenz mit einem Feuer-poliertem Glas Pasteur Pipette. Jedes der gut sollte weniger als fünf Embryonen. </li><li> Add 2,5 ul frisch zubereiteten Natriumascorbat (von 100 mM Lager in H 2 O), um die Klick-Reaktion 3 einzuleiten. Endkonzentration jedes Reagenz: Alexa Fluor-488-Azid: 100 nM; CuSO 4: 50 uM; BTTES: 300 nM; Natriumascorbat: 2,5 mm. </li><li> Nach 3 min, add 2 ul Bathocuproin sulfonat (50 mM Lager in H 2 O), einem biokompatiblen Kupfer-Chelator, um die Reaktion dann zu löschen verdünnen sofort mit 100 ul E3 Embryo Medium. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen einer Glas-Petrischale und waschen Sie die behandelten Embryonen 2 mal mit 15 mL E3 Embryo Medium. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Geben Sie einen Tropfen extrem niedrigen Schmelzpunkt Agarose (1,2% (w / v) in E3 Embryo medium) auf einem MatTek Glasboden Mikrotiterplatten Schale und setzen ein Embryo in die Agarose fallen. </li><li> Position der Embryonen dorsal oder lateral und die Schale auf Eis für 5 min auf die Agarose Tropfen erstarren. Add E3 Embryo Medium vorsichtig in die Schale, bis sie die Agarose Tropfen abdeckt. </li><li> Fluoreszenz-und Hellfeld-Bilder erworben werden nacheinander mit einem konfokalen Mikroskop. Alle Embryo Bilder aufgenommen mit einem 5 um Schritt Intervall. Zusammengesetzte Zahlen werden unter Verwendung von ImageJ-Software. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt den Workflow unserer Zwei-Schritt-Kennzeichnung Strategie. Abbildung 2 zeigt die Kennzeichnung von Zebrafisch-Embryonen via BTTES-vermittelte CuAAC bei 9,5 Stunden nach der Befruchtung (HPF). BTTES ist ein Tris (triazolylmethyl) amin-Liganden. Er beschleunigt CuAAC dramatisch, wenn die Abstimmung mit den in situ erzeugten Cu (I), und fördert die Cycloaddition schnell in lebenden Systemen ohne erkennbare Toxizität. Unmittelbar nach einem 3-min-Klick-Reaktion, sind wir in der Lage, robuste Kennzeichnung des BIP-FucAl behandelten Embryonen (Abbildung 2, linkes Bild) zu erkennen. Nur Hintergrundfluoreszenz wird für die Steuerung von Embryonen mit GDP-Fucose (Abbildung 2, rechts Panels) mikroinjiziert erkannt. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die Strategie der Kennzeichnung fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht von Zebrafisch-Embryonen. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. In-vivo-Bildgebung von fucosylierte Glykane in Zebrafisch-Embryogenese über BTTES-Cu (I)-katalysierten Klick-Chemie. Ein-Zell-Stadium Zebrafischembryonen sind mit einer einzigen Dosis des BIP-FucAl mikroinjiziert und dürfen develop auf 9,5 hpf. Die Embryonen werden dann mit Alexa Fluor 488-Azid, katalysiert durch BTTES-Cu (I) umgesetzt. Reagierte Embryonen abgebildet werden mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Maximale Intensität z-Projektion Bilder von Alexa Fluor 488-Fluoreszenz (oberes Bild); Hellfeld (unteres Bild). Maßstab: 100 um. Fehlerbehebung <table border="1"><tbody><tr><td> Problem </td><td> Ursache </td><td> Abhilfe </td></tr><tr><td> Die Embryonen ungesund aussehen </td><td> Die mikroinjiziert Lösung enthält Schadstoffe </td><td> Die Reinheit des Nucleotidzucker sollte größer sein als 85%. Überprüfen Sie Ihre Hand. </td></tr><tr><td> Es gibt keine Kennzeichnung nach der Reaktion </td><td> Kupfer-Konzentration unterhalb von 30 pM </td><td> Achten Sie darauf, die Reaktionslösung durch Zugabe überschüssiger E3 Embryo Medium bei Zugabe der Embryonen, wie die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt deutlich, wenn die Kupfer-Konzentration unter 30 uM zu verdünnen. </td></tr><tr><td> Die Embryonen sterben nach der Reaktion </td><td> Unsachgemäße Behandlung der Embryonen </td><td> Sicherstellen, dass die Pipette ist feuerpolierte und das Reaktionsgefäß mit einer sehr dünnen Schicht von 0,5% Agarose beschichtet. </td></tr><tr><td> Die Bilder sehen fleckig </td><td> Die Reagenzien sind nicht richtig, bevor Sie die Embryonen gemischt </td><td> Befolgen Sie die empfohlene Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien, und stellen Sie sicher, dass der Klick-Chemie Reagenzien wurden ordnungsgemäß vor der Zugabe des Embryos vermischt. </td></tr><tr><td> Die Bilder zeigen die Embryonen geschädigt werden </td><td> Heftiges Schütteln Schäden die Embryonen während der Reaktion </td><td> Sanft für weniger als 10 Sekunden schütteln, wenn die Embryonen in der Lösung sind. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Imaging Biomolekülen<em&gt; In vivo</em&gt; Liefert wichtige Erkenntnisse ihrer biologischen Aktivitäten in ihrer natürlichen Umgebung. In diesem Video zeigen wir, wie die Kennzeichnung von fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht von Zebrafisch-Embryonen durch Mikroinjektion one-Zell-Stadium Embryos mit einem BIP-FucAl und eine zweite für-Schritt-Fluorophor Konjugation über BTTES-vermittelte biokompatiblen CuAAC realisiert<sup&gt; 3</sup&gt;. Robust Kennzeichnung kann innerhalb von 2-3 Minuten erreicht werden...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Kupfer (II)-sulfat-Pentahydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Azid </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> Dextran, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+)-Natrium-L-Ascorbat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic Säure </td><td> Acros Organics </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Glasboden Mikrotiterplatten Gericht </td><td> MatTek </td><td> P35G-1,5-14-C </td></tr></tbody></table>

imaging glykane in zebrafisch-embryonen durch metabolische markierung und bioorthogonale click-chemie

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging Glykane in vivo wurde vor kurzem durch die Verwendung einer bioorthogonale chemischen Reporter, indem man Zellen oder Organismen mit Azid-oder Alkin-markierten Monosacchariden 1, 2. Die modifizierte Monosaccharide, durch die Glykan Biosynthese-Maschinerie verarbeitet, sind in der Zelloberfläche Glycokonjugate eingearbeitet. Die bioorthogonale Azid-oder Alkin-Tags dann eine kovalente Konjugation mit fluoreszierenden Sonden für die Visualisierung oder mit Affinitätssonden zur Anreicherung und glycoproteomic Analyse. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren in der Regel für nicht-invasive Bildgebung von fucosylierte Glykane in Zebrafisch-Embryonen verwendet werden, einschließlich: 1) Mikroinjektion von one-Zell-Stadium Embryos mit einem BIP-5-alkynylfucose (BIP-FucAl), 2) Kennzeichnung fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht aus Zebrafisch-Embryos mit Azid-konjugierten Fluorophore über biokompatible Cu (I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) und 3) Bildgebung durch konfokale Mikroskopie 3. Die hier beschriebene Methode kann leicht erweitert werden, um andere Klassen von Glykane, zB Glykane mit Sialinsäure 4 und N-Acetyl-5, 6, bei der Entwicklung von Zebrafisch und in anderen Lebewesen zu visualisieren.

Ein Klick-Chemie basierende Methode, die für die schnelle, nichtinvasive und robuste Kennzeichnung von Alkin-markierten Glykane in Zebrafisch-Embryonen erlaubt wird beschrieben. Fucosylierte Glykane in der umhüllenden Schicht von Zebrafisch-Embryonen in den späten Gastrulation Bühne wurden in dieser Studie abgebildet.

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

Die In-vivo-Bildgebung von Glykanen wurde kürzlich durch eine bioorthogonale chemische Reporterstrategie ermöglicht, bei der Zellen oder Organismen mit Azid- oder ...

Die jüngste Demonstration der In-vivo-Bildgebung von Glykanen nutzt eine bioorthogonale chemische Reportertechnik, bei der Zellen oder Organismen mit Alkin- oder Azid-markierten Monosacchariden behandelt werden. Modifizierte Monosaccharide, die von der glykanbiosynthetischen Maschinerie verarbeitet wurden, werden in glykankonjugierte Zelloberflächenstrukturen eingebaut, die bioorthogonale Alkin- oder Azid-Markierungen enthalten. Diese ermöglichen anschließend die kovalente Konjugation mit fluoreszierenden Sonden zur Visualisierung oder mit Affinitätssonden zur Anreicherung und glykoproteomischen Analyse.Diese auf Click-Chemie basierende Methode ermöglicht die schnelle, nichtinvasive und robuste Markierung von Alkin- oder Azid-detektierbaren Glykanen in Zebrafischembryonen und kann leicht auf die Visualisierung anderer Glykanklassen in sich entwickelnden Organismen erweitert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Lectin- oder Antikörper-basierten Glykandetektion liegt darin, dass sie für die dynamische In-vivo-Bildgebung eingesetzt werden kann. Mit Lectin- und Antikörper-basierten Bildgebungsverfahren erhält man lediglich eine Momentaufnahme der Glykane zu einem bestimmten Zeitpunkt.Sie sind im Kontext dynamischer Studien schwer umzusetzen. Außerdem erfordert die Markierung von Glykanen mit Lektinen oder Antikörpern die Entfernung der Zellen oder Gewebe von Interesse aus ihrem natürlichen Milieu und deren Fixierung vor der Analyse. Im Gegensatz dazu überwindet die Markierung von Glykanen mittels der bioorthogonalen chemischen Reporterstrategie diese Einschränkungen und kann direkt zur nicht-invasiven Bildgebung von Glykanen in lebenden Systemen wie Zebrafischembryonen und Seeigeleleganz-Embryonen angewendet werden.Mithilfe der von BTT Es vermittelten Azi-Aine-Cyclo-Addition, einer biokompatiblen Version der Qlik-Chemie, kann eine robuste Markierung innerhalb von einer bis fünf Minuten erreicht werden. Zunächst behandeln Sie das Verfahren wie folgt: Sammeln und überführen Sie Zebrafischeier in eine 35-Millimeter-Petri-Schale. Entfernen Sie so viel Wasser wie möglich und geben Sie anschließend Pronase E in Embryomedien mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu, um die Chorionhülle zu verdauen. Nach drei bis fünf Minuten kann ein Blasen an der Chorionhülle auftreten; danach tauchen Sie die Schale in einen Becher, der mit Fischwasser gefüllt ist.Überführen Sie die Eier vorsichtig in den Becher, indem Sie die Eier in das Wasser fallen lassen. Spülen Sie die Eier umfassend mit Fischwasser, sodass die meisten Eier von ihrem Chorion befreit werden. Übertragen Sie die beschichteten Eier nun mit einer flammenglatten Pipette in mit Agar beschichtete Petrischalen, die mit E3-Embryomedium gefüllt sind. Füllen Sie die vorbereiteten Injektionsschalen mit E3-Embryomedium und geben Sie die beschichteten Eier hinein.Bereiten Sie als Nächstes die Nadel vor und füllen Sie sie mit zwei Mikrolitern Injektionslösung, die 20 Millimolar GDP Fukall und entweder 5 % Lor, 5 94 Dextrin als Tracer oder 0,1 % Phenylrot-Ladefarbstoff in 0,2 Molaren Kaliumchlorid als Negativkontrolle enthält. Ersetzen Sie GDP FUCA in der Injektionslösung durch GDP Fuco. Brechen Sie nun die Nadel ab und stellen Sie den Injektionsdruck und die Dauer so ein, dass ein Tropfen von einem Nanoliter entsteht.Danach injizieren Sie die Eier mit einem Nanoliter der Lösung. Abschließend überführen Sie die injizierten Eier in mit Agros beschichtete Petrischalen, die mit E3-Embryomedium gefüllt sind, und inkubieren sie bei 28 Grad Celsius innerhalb von drei bis vier Stunden nach der Befruchtung. Entfernen Sie die unbefruchteten Eier, wenn die Embryonen die gewünschten Entwicklungsstadien erreicht haben, beispielsweise die späte Gastrulationsgewebesegmentation und das frühe Larvenstadium.Bestreichen Sie den Boden einer 96-Well-Platte mit aros. Geben Sie 92 Mikroliter Embryonenmedium in jedes Well, gefolgt von der Zugabe von vier Mikrolitern oder 4 88 Azid aus einer 2,5-Millimolar-Stammlösung in Wasser und zwei Mikrolitern B-T-T-E-S-Kupfersulfat-Sechs-zu-eins-Komplex mit einer feuerpolierten Glas-Pastettenpipette. Überführen Sie weniger als fünf Embryonen in das Well. Setzen Sie die Zugabe des Click-Chemie-Reagenz fort, indem Sie 2,5 µL frisch zubereiteter 100 mM Natriumascorbatlösung hinzufügen. Um die Click-Reaktion zu starten, 3 Minuten lang reagieren lassen. Geben Sie nun 2 µL 50 mM Bathocuproin-Disulfonat, einen biokompatiblen Kupferchelator, hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und verdünnen Sie sofort mit 100 µL Embryomedium. Überführen Sie die Embryonen in eine Glas-Petrischale und waschen Sie die behandelten Embryonen zweimal mit jeweils 15 Milliliter Embryo.Medium. Geben Sie einen Tropfen Ultraniedrigschmelzender Agarose auf eine matte Tech Glasboden-Mikroplatte und überführen Sie einen Embryo in den Agarosetropfen. Positionieren Sie den Embryo und stellen Sie die Schale fünf Minuten lang auf Eis.Um den Agros-Tropfen zu fixieren, langsam Embryomedium in die Petrischale geben, bis der Agros bedeckt ist. Tropfen Sie nacheinander auf. Erwerben Sie Fluoreszenz- und Hellfeldaufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop in Fünf-Mikrometer-Schritten und erstellen Sie zusammengesetzte Abbildungen.Unter Verwendung von Bild. J-B-T-T-E-S ist ein aminobasierter Ligand, der die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition erheblich beschleunigt, wenn er mit dem aus NC zwei generierten Kupfer(I) koordiniert, und die Cycloadditionsreaktion in lebenden Systemen rasch fördert, ohne offensichtliche Toxizität zu zeigen. Hier werden Zebrafischembryonen über eine B-T-T-E-S-vermittelte Kupfermarkierung gefärbt.Eine a C bei 9,5 Stunden nach der Befruchtung unmittelbar nach einer dreiminütigen Click-Reaktion. Wie erwartet wird eine starke Markierung des GDPF in allen behandelten Embryonen detektiert. Bei Kontrollembryonen, die mit GDP-Fuco mikroinjiziert wurden, wird nur Hintergrundfluoreszenz beobachtet. Die Markierung und Bildgebung kann jederzeit zwischen 2,5 und 96 Stunden nach der Befruchtung durchgeführt werden.Diese Aufnahmen werden 24 und 48 Stunden nach der Befruchtung angefertigt. Pulse-Chase. Mithilfe dieser Strategie lässt sich die dynamische Biosynthese von gesättigten Glykanen verfolgen, bei der Alcon-Fuco, die zu verschiedenen Zeitpunkten produziert werden, mit Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Farbe markiert werden.Dieses Verfahren kann mit genetischen Mutanten oder morphbasierten genetischen Unterdrückungstechniken kombiniert werden, um die spezifischen Rollen einzelner Glykan-synthetisierender Enzyme während der Zebrafisch-Embryogenese zu untersuchen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Glykobiosynthese ermöglicht, kann sie auch auf andere posttranslationale Modifikationen wie die Acylierung bei der Liquifizierung angewendet werden.Es kann auch zur Untersuchung neu synthetisierter Proteine angewendet werden.

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Forschung

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Biology

Biologie

Wir berichten über die Entwicklung eines Systems zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-transgenen Embryos in Mikrotiterplatten. Dies demonstriert die Fähigkeit, dosisabhängige Wirkung eines kleinen Moleküls, BCI, auf Fibroblast Growth Factor Expression des Reportergens zu messen und Technologie für den Aufbau High-Throughput-Zebrafisch chemische Bildschirme.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Dieses Video zeigt einen Antikörperaufnahme-Assay zur Abbildung der Notch/DeltaD-Signalgebung in radialen Glia-Vorläufern von Zebrafischen. Dazu gehören die Montage von in Agarose eingebetteten dechorionierten Zebrafischembryonen, die Injektion einer Farbstofflösung, die auf DeltaD-Liganden abzielt, auf RGPs und die Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop für die asymmetrische Zellteilung, die die Aktivierung des Notch/DeltaD-Signalwegs bestätigt.

Ein Antikörperaufnahme-Assay zur Abbildung des Notch/DeltaD-Signalwegs in radialen Glia-Vorläuferzellen von Zebrafischen

Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Eine neuartige Technik zum Nachweis von endogenen Rezeptoren mit geringer Abundanz in Zebrafischembryonen wird beschrieben. Wir haben es AFLIP genannt, weil es aus der Affinitätsmarkierung des Rezeptors durch seinen Liganden besteht, der mit der Immunpräzipitation verbunden ist.

Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen

Diese Arbeit beschreibt Methoden, um akute und chronische Hyperglykämie Modelle in Zebrafisch zu etablieren. Ziel ist es, die Auswirkungen von Hyperglykämie auf physiologische Prozesse, wie zB konstitutive und verletzungsinduzierte Neurogenese, zu untersuchen. Die Arbeit hebt auch die Verwendung von Zebrafisch hervor, um radiomarkierten Molekülen (hier [ 18 F] -FDG) unter Verwendung von PET / CT zu folgen.

Akute und chronische Modelle der Hyperglykämie in Zebrafisch: Eine Methode zur Beurteilung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Neurogenese und die Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen

Hier schlagen wir ein einfaches Protokoll vor, das metabolisches Oligosaccharid-Engineering, Click-Chemie und Expansionsmikroskopie kombiniert und die Biobildgebung von intrazellulären sialylierten N-Glykoproteinen mit verbesserter Auflösung unter Verwendung von Routinemikroskopiegeräten ermöglicht.

Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

Erfahren Sie die bioorthogonale Click-Chemie zur schnellen Markierung von Glykanen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht dynamische In-vivo-Bildgebung fucosylierter Glykane während der Entwicklung.

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

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