Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer
17. Februar 2011
Diese Mitteilung enthält Daten über die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der BioSpec-nano UV-VIS Spektralphotometer für dsDNA-und Protein-Quantifizierung. Selbst bei extrem kleinen Volumina (1 bis 2 L), ist die Reproduzierbarkeit ausgezeichnet, während die automatische Wisch-Funktion verbessert den Durchsatz und die Ergebnisse in minimaler Verschleppung für genauere Ergebnisse.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Konzentrationen von Nukleinsäuren und Proteinen mithilfe eines Mikrovolumen-Spektrophotometers genau und reproduzierbar zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die geeignete Messweglänge für die zu analysierende Probe ausgewählt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Blindprobe zu messen.
Als Nächstes wird die DNA- oder Proteinprobe gemessen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Daten im PDF- oder CSV-Format zu speichern. Letztendlich liegen hochgradig reproduzierbare Ergebnisse für DNA und Protein vor.
Die Quantifizierung kann mit dieser Methode schnell und genau durchgeführt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Schnelligkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit. Um mit der DNA-Quantifizierung zu beginnen, schalten Sie das BIOSpec-nano-Spektrophotometer ein.
Öffnen Sie die BIOS spec nano-Software auf dem PC-Desktop. Klicken Sie auf den Reiter für einfache nukleinsaurehaltige D-S-D-N-A. Die Software stellt eine Verbindung zum Gerät her und führt eine Initialisierungssequenz aus.
Dies bestätigt, dass das Instrument gemäß den Spezifikationen funktioniert. Wählen Sie als Nächstes die Weglänge am Schieberegler für die Weglänge.
Für Proben im Mikroliterbereich stehen drei Optionen zur Verfügung. Es können 0,2 Millimeter oder 0,7 Millimeter verwendet werden. Und für verdünnte Proben gibt es die Möglichkeit, eine Küvette mit einer Pfadlänge von fünf Millimetern zu verwenden.
In dieser Demonstration werden 0,7 Millimeter zur Messung einer zweimikroliter-Probe ausgewählt. Alle Berechnungen basieren auf der gewählten Weglänge. Klicken Sie danach in der Software auf den Reiter „Setup“ und wählen Sie die automatische Abwischfunktion aus.
Wählen Sie einen für einen Abstrich. Vor der Probenmessung oder jedes Mal, wenn eine neue Weglänge ausgewählt wird, ist eine Blindmessung erforderlich. Für eine Weglänge von 0,7 Millimetern pipettieren Sie zwei Mikroliter Wasser oder Puffer auf das Podest. Klicken Sie auf „Blank“, um die Blindmessung durchzuführen.
Das obere Fenster bewegt sich, um Kontakt mit dem Proben-Tropfen herzustellen, und Xenon-Blitze können beobachtet werden. Wenn die Messung abgeschlossen ist, wischt der Abstreifer automatisch die Probe ab. Nun kann die Probe gemessen werden.
Es ist wichtig, eine homogene Probelösung zu verwenden, da das Vorhandensein von ungelösten Partikeln zu irreproduzierbaren Daten führt. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, saugen Sie vorsichtig zwei Mikroliter der Probe auf und pipettieren Sie die Probe dann gleichmäßig von der Pipettenspitze auf das Podest.
Drücken Sie die Starttaste am Gerät. Wie zuvor bewegt sich das obere Fenster, um Kontakt mit dem Proben-Tropfen herzustellen, und Xenonblitze können beobachtet werden. Um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen, wiederholen Sie die Messung derselben Probe dreimal. Alle aufgezeichneten Daten werden automatisch als A BUD-Datei gespeichert. Um die Daten als PDF- oder CCSV-Datei zu speichern, klicken Sie auf Speichern P-D-F-C-S-V.
Die Ergebnisse können auch als CSV-Datei gespeichert werden, indem die entsprechende Auswahl im Register „Speichern“ getroffen wird. Die Proteinquantifizierung kann mithilfe der Absorptionsmethode bei 280 nm durchgeführt werden. Wählen Sie dazu das Register „Proteinquantifizierung“ aus.
Geben Sie den Extinktionskoeffizienten ε 280 ein, falls bekannt. Falls ε 280 nicht bekannt ist, berechnen Sie ihn mithilfe von ε 280 calc. Wählen Sie auf dem Pfadlängenregler 0,2 Millimeter, um eine 3-Mikroliter-Probe zu messen. Gehen Sie danach in der Software auf den Reiter „Setup“ und wählen Sie „Auto Wiping Setup“. Wählen Sie zwei für zwei Abwischvorgänge, um eine Probentransferierung zu verhindern und eine genaue Messung sicherzustellen.
Um eine Blindmessung durchzuführen, pipettieren Sie drei Mikroliter Wasser oder Puffer auf das Prüffläschchen und klicken Sie auf „Blank“ für die Blindmessung. Danach pipettieren Sie vorsichtig drei Mikroliter der Proteinprobe auf das Prüffläschchen. Ohne Luftblasen einzuschließen, klicken Sie in der Software auf „Start“ oder drücken Sie die Starttaste am Gerät, um die Messung der Probe zu beginnen.
Wiederholen Sie die Messung derselben Probe dreimal, um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Hier sind Daten aus Messungen an einer typischen doppelsträngigen DNA-Probe. Die Formel zur Berechnung der DNA-Konzentration lautet: Probenkonzentration gleich DF mal der Menge von OD 260 minus OD 320 mal NACF, wobei DF gleich dem Probenverdünnungsfaktor und NACF gleich dem Nukleinsäure-Konzentrationsfaktor ist.
Der Nukleinsäure-Konzentrationsfaktor wird entsprechend dem ausgewählten Analyten eingestellt. Die berechnete Nukleinsäurekonzentration und das OD260/280-Verhältnis werden angegeben. Diese Tabelle enthält Reproduzierbarkeits-Testergebnisse zur DNA-Quantifizierung.
Zusammen zeigen die Daten Ergebnisse, die aufgrund der geringen relativen Standardabweichung von 0,26 % hochgradig reproduzierbar sind. Hier sind repräsentative Ergebnisse einer Protein-Konzentrationsanalyse für BSA dargestellt. Die Protein-Konzentration in Mikrogramm pro Milliliter basiert auf dem Epsilon-280-Wert. Abschließend zeigt diese Tabelle eine Reproduzierbarkeitsanalyse der Proteinquantifizierung.
Die relative Standardabweichung von 0,51 % zeigt, dass das BIOS spec nano die OD nicht nur für DNA, sondern auch für Proteine genau misst. Sobald die Methode beherrscht ist, können mehrere Proben innerhalb einer Minute analysiert werden.
Übersicht
Diese Studie bewertet die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des BioSpec-nano UV-VIS-Spektrophotometers zur Quantifizierung von dsDNA und Proteinen. Die Methode zeigt eine hervorragende Reproduzierbarkeit, selbst bei extrem geringen Probenvolumina, und erhöht den Durchsatz bei minimalem Carry-over.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biochemie
- Analytische Chemie
- Biotechnologie
Hintergrund
- Eine genaue Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen ist in der biologischen Forschung von entscheidender Bedeutung.
- Mikrovolumen-Spektrophotometrie ermöglicht die Analyse mit minimalem Probenbedarf.
- Automatisierte Funktionen können die Messgenauigkeit und Effizienz verbessern.
- Die Reproduzierbarkeit ist für verlässliche experimentelle Ergebnisse unerlässlich.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Leistung des BioSpec-nano-Spektrophotometers zur Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen.
- Entwicklung eines Protokolls für genaue Messungen unter Verwendung geringer Probenmengen.
- Nachweis der Zuverlässigkeit der Ergebnisse durch wiederholte Messungen.
Verwendete Methoden
- Auswahl der geeigneten Weglänge für die Probenmessung.
- Leermessung vor der Probenanalyse.
- Automatisches Abwischen, um eine Übertragung zwischen Proben zu verhindern.
- Speicherung der Daten im PDF- oder CSV-Format für die weitere Analyse.
Hauptergebnisse
- Sehr reproduzierbare Ergebnisse bei der DNA-Quantifizierung mit einer relativen Standardabweichung von 0,26 %.
- Die Proteinquantifizierung zeigte ebenfalls eine hohe Genauigkeit mit einer relativen Standardabweichung von 0,51 %.
- Schnelle und präzise Messungen können mit dem BioSpec-nano durchgeführt werden.
- Mehrere Proben können schnell analysiert werden, wodurch der Durchsatz erhöht wird.
Schlussfolgerungen
- Das BioSpec-nano-Spektrophotometer liefert zuverlässige Quantifizierungen sowohl für dsDNA als auch für Proteine.
- Automatisierte Funktionen verbessern die Mess-Effizienz erheblich.
- Diese Methode eignet sich für Hochdurchsatzanwendungen in der biologischen Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die genaue und reproduzierbare Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen ist für die Zielvalidierung und die Entwicklung von Assays im frühen Stadium der Arzneimittelforschung unerlässlich. Der BioSpec-nano Mikrovolumen-Spektrophotometer ermöglicht hochdurchsatzfähige Messungen mit geringem Probenverbrauch und automatisierter Probenaufbereitung, wodurch die Variabilität verringert und die Datenzuverlässigkeit für Workflows zur Identifizierung von Leitstrukturen verbessert wird. Sein schneller Messzyklus und die geringe relative Standardabweichung tragen zu einer verlässlichen Vorhersagekraft bei nachgeschalteten Screening- und translationsmedizinischen Anwendungen bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die präzise Quantifizierung von Nukleinsäure- und Proteinproben zur Unterstützung der Analyse der Zielexpression und Untersuchung von Signalwegen.
- Operationaler Wert: Verringert den Probenverbrauch und die manuellen Arbeitsschritte und erhöht so den Durchsatz für Hypothesentests in der Entdeckungsbiologie.
- Prädiktiver Wert: Eine geringe relative Standardabweichung (0,26 % für DNA, 0,51 % für Protein) erhöht das Vertrauen in quantitative Daten, die für Go/No-Go-Entscheidungen verwendet werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert reproduzierbare Absorptionsmessungen (OD260-OD320 für DNA, OD280 für Protein), die für die Standardisierung von Assays und die Qualifizierung von Reagenzien geeignet sind.
- Operativer Wert: Automatisches Abwischen und Nullstellen minimieren Übertrag und gewährleisten die Messkonsistenz über Platten oder Chargen hinweg.
- Skalierbarkeit: Die dreisecündige Messdauer ermöglicht die schnelle Durchmusterung von Probenbibliotheken oder Fraktionierungsprodukten.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Unterstützt die Quantifizierung von Biomarkern und die pharmakokinetische Probenauswertung, bei denen eine hochpräzise Detektion geringer Probenvolumina erforderlich ist.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Exakte Protein-Konzentrationsdaten (über die ε280-Berechnung aus Trp-, Tyr-, Cys-S-S-Resten) ermöglichen eine korrekte Dosierung in Funktionsassays.
- Workflow-Integration: Die Ausgabe im PDF- bzw. CSV-Format erleichtert die Datennachverfolgung und den Austausch zwischen Entdeckungs- und präklinischen Teams.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der BioSpec-nano passt in die Entdeckungskette von der anfänglichen Target-Validierung über die Assay-Entwicklung bis hin zur präklinischen Probenauswertung, insbesondere dort, wo Probenerhaltung und Messwiederholbarkeit entscheidend sind.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die hypothesengetriebene Quantifizierung von Nukleinsäuren (z. B. Genexpressionskonstrukte) und Proteinen (z. B. gereinigte Zielstrukturen, Antikörper) zur Zielvalidierung.
- Screening: Ermöglicht die Qualitätskontrolle von Probeneingaben und Reaktionsausgaben in biochemischen oder zellbasierten Assays mit minimalem Volumenbedarf.
- Analytik: Liefert quantitative, auf dem optischen Dichtewert basierende Messergebnisse mit automatischer Pfadlängenkorrektur und Berechnung des Extinktionskoeffizienten für Proteine.
- Translationale Forschung: Kompatibel mit Proben geringer Menge aus präklinischen Studien (z. B. Plasma, Gewebelysate), die eine genaue Konzentrationsnormalisierung erfordern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als gemeinsam genutzte Ressource eines zentralen Labors zur standardisierten Quantifizierung über mehrere Projekte und Methoden hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Datenqualität und Reproduzierbarkeit bei der Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen und verringert falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse bei der frühen Screening-Phase.
- Operationaler Wert: Die Automatisierung von Probenkontakt, Messung und Reinigung reduziert die Variabilität durch den Anwender und erhöht die Laboreffizienz.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Iterationen in der Lead-Optimierung, indem zuverlässige Quantifizierungsdaten für Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR-Studien) bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Ressourcenallokation, indem verlässliche quantitative Daten für die Priorisierung von Zielstrukturen bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Vertrautheit mit den Prinzipien des Spektrophotometers und der Auswahl der Lichtweglänge basierend auf der Probenkonzentration.
- Benötigt Zugang zu einem PC mit BioSpec-nano-Software und regelmäßige Wartung der optischen Oberflächen.
- Profitiert von standardisierten Arbeitsanweisungen (SOPs) für das Nullabgleichen, Abwischen und die Probenapplikation, um eine Konsistenz zwischen verschiedenen Anwendern sicherzustellen.
- Anpassbar an verschiedene Probentypen (DNA, Protein, andere Analyten) durch Softwarekonfiguration und Anpassung der Lichtweglänge.
- Auf die absorbanzbasierte Quantifizierung beschränkt; nicht geeignet für fluoreszierende oder lumineszierende Assays ohne zusätzliche Instrumentierung.
