Name: Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Erfahren Sie die präzise Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit dem BioSpec-nano-Spektralphotometer. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Messungen mit minimalen Probenmengen für biochemische Analysen.

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1. Verfahren zur DNA-Quantifizierung <ol><li> Schalten Sie das Gerät. </li><li> Öffnen Sie die BioSpec-nano-Software aus dem PC-Desktop. </li><li> Klicken Sie auf das Einfache Nucleic Acid-dsDNA Registerkarte (Abbildung 1). </li><li> Die Software wird die Kommunikation mit dem Gerät herzustellen und führen eine Initialisierung Sequenz. Dies bestätigt, dass das Gerät nach Angaben der Durchführung. </li><li> Wählen Sie 0,7 oder 0,2 mm über die Weglänge Schieberegler. Diese wählt die Weglänge und alle Berechnungen basieren auf der Weglänge ausgewählt wurden. </li><li> Next in BioSpec-nano-Software klicken Sie auf Setup-Autowiping Setup. Wählen Sie 1 oder 2. </li><li> Pipette 2 ul (für 0,7 mm) H 2 O oder Puffer auf dem Podest. </li><li> Klicken Sie auf leere oder F6 für Blank-Messung. Jedes Mal, wenn eine neue Schichtdicke gewählt wird, ist es notwendig, um einen leeren Datensatz. </li><li> Pipette 2 ul der Probe auf dem Podest. </li><li> Klicken Sie auf Start in der Software oder drücken Sie den Startknopf auf dem Instrument. Das obere Fenster bewegt, den Kontakt mit der Probe Tropfen zu machen. Xenon-Blitze beobachtet werden können. </li><li> Wiederholen Sie die gleiche Probe 3 mal um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen. </li><li> Alle aufgezeichneten Daten ist. Bud-Datei gespeichert. </li><li> Zum Speichern als. Pdf oder. Csv-Datei klicken Sie auf Speichern pdf / csv oder F9. Die Ergebnisse können auch als. Csv-Datei, indem Sie die entsprechende Auswahl in der Registerkarte Speichern gespeichert werden. </li></ol> 2. Protokoll für Protein Quantifizierung <ol><li> Wählen Protein Quantifizierung Registerkarte (Abbildung 2). </li><li> Geben Sie den Extinktionskoeffizienten e280, falls bekannt. </li><li> Wenn e280 nicht bekannt ist, berechnen sie mit e280Calc. </li><li> Wählen Sie 0,7 oder 0,2 mm über die Weglänge Schieberegler. </li><li> Klicken Sie auf Setup-Autowiping Setup. Wählen Sie 2 oder höher. </li><li> Pipette 3 ul (für 0,2 mm) H 2 O oder Puffer auf dem Podest. </li><li> Klicken Sie auf leere oder F6 für Blank-Messung. </li><li> Pipette 3 ul der Proteinprobe auf dem Podest. </li><li> Klicken Sie auf Start in der Software oder drücken Sie den Startknopf auf dem Instrument. </li><li> Wiederholen Sie die gleiche Probe 3 mal um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen. </li><li> Alle aufgezeichneten Daten ist. Bud-Datei gespeichert </li><li> Zum Speichern als. Pdf oder. Csv-Datei klicken Sie auf Speichern pdf / csv oder F9. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: 1. Ergebnisse für die DNA-Quantifizierung Abbildung 3 zeigt die Daten aus Messungen an einem typischen doppelsträngige DNA-Probe. Die Konzentration und OD 260/280 Ratio berechnet werden ebenfalls gezeigt. Abbildung 4 enthält die Reproduzierbarkeit Testergebnisse für DNA-Quantifizierung. Die Daten in den Abbildungen 3 und 4 zeigt die Ergebnisse sind sehr gut reproduzierbar, wie aus den niedrigen relativen Standardabweichung von 0,26%. Hinweis 1: Ungenauigkeit in der DNA-Quantifizierung kann durch die Anwesenheit von Puffer-Komponenten, die im UV-Bereich absorbieren entstehen können. Es ist auch notwendig, um eine homogene Probe-Lösung verwenden. Da die Höhe der Probe pipettiert nur 1-2 ul, vorsichtiges Pipettieren von genauen Mengen ohne Einführung von Blasen ist nicht erforderlich. 2. Ergebnisse für Protein Quantifizierung Abbildung 5 zeigt Proteinkonzentration Analyse für BSA. Die ug / ml Proteinkonzentration ist auf der e280-Wert. Abbildung 6 zeigt die Reproduzierbarkeit Analyse. Daraus ist ersichtlich, dass die relative Standardabweichung von 0,51%, dass die BioSpec-nano-Konzentration misst präzise - nicht nur für DNA, sondern auch für Proteine. Hinweis 2: Faktoren, die die Protein-Konzentration Genaue Konzentration Bestimmung von Protein ist machbar, wenn es mindestens Effekte aus Instabilität, die durch pH, ​​Puffer, Temperatur oder Zusätze verursacht. Die meisten gereinigtes Protein durchläuft verschiedene Stufen der Verarbeitung, daher ist es möglich, dass das Protein Tenside oder andere Zusatzstoffe, die mit Tropfenbildung stören kann. Für solche Proben, mit dem 5 mm Schichtdicke Quarzküvette wird dringend empfohlen. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Analyte Auswahlfenster für doppelsträngige DNA-Quantifizierung <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Analyte Auswahlfenster für nicht markiertes Protein-Quantifizierung <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Repräsentative Daten zur DNA-Quantifizierung <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Reproduzierbarkeit von Daten für die DNA-Quantifizierung <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Repräsentative Daten für die Protein-Quantifizierung <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt='"Bild'> Abbildung 6. Reproduzierbarkeit von Daten für die Protein-Quantifizierung

<ol><li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAisubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th edition, WILEY. (1999).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.</li>
</ol>

Suja Sukumaran ist PhD Mitarbeiter von Shimadzu, der das Instrument in diesem Artikel vorgestellten macht.

Die BioSpec-nano wurde entwickelt, um aktuelle Themen innewohnenden DNA-Quantifizierung Methoden, wie inkonsistente Ergebnisse und mühsame Handarbeit zu lösen. Jede Messung dauert nur 3 Sekunden, so dass ein erfahrener Molekularbiologe ungefähr 3-6 mehrere Proben in einer Minute zu analysieren. Die einzigartige Scheibenwischer-Funktion verbessert nicht nur den Durchsatz der Messung, es entfällt auch die Notwendigkeit für die manuelle Reinigung der Container, die sich in vernachlässigbaren Verschleppung zwischen den Messungen. Darüber hinaus gaben Tests unter Verwendung von nur 2 Tücher für die DNA-Proben mit 1000 ng / ul, Verschleppung von weniger als 2 ng / ul. Die Verfügbarkeit einer 5 mm Schichtdicke Zelle enthält eine Option zum verdünnen Nukleinsäure-und Protein-Proben analysieren und erweitert den Einsatz dieses Instruments für andere Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>BioSpec-nano</td><td>Shimadzu Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalbs-Thymus-DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

konzentrationsbestimmung von nukleinsäuren und proteinen mit dem micro-volumen bio-spec nano-spektralphotometer

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid Quantifizierung Verfahren haben sich in den letzten drei Jahrzehnten fortgeschritten. Mehr und mehr verlangen Molekularbiologen konsequent kleinvolumigen Analyse von Nukleinsäure-Proben für ihre Experimente. Die BioSpec-nano bietet eine mögliche Lösung für die Probleme der ungenauen, nicht reproduzierbare Ergebnisse, inhärent aktuellen DNA-Quantifizierung Methoden, über spezialisierte Optik und ein sensibles PDA-Detektor. Die BioSpec-nano hat auch automatisierte Funktionen, so dass Montage, Messung und Reinigung durch das Instrument fertig sind, wodurch langwierige, sich wiederholende und inkonsistent Platzierung der LWL-Element und manuelle Reinigung. In dieser Studie werden die Daten auf die Quantifizierung von DNA und Protein, sowie Mess-Genauigkeit und Reproduzierbarkeit vorgestellt. Automatisierte Probenvorbereitung Kontakt und schnelle Abtastung ermöglicht die Messung in 3 Sekunden, was zu einer hervorragenden Durchsatz. Die Datenanalyse erfolgt über die integrierten Funktionen der Software durchgeführt. Die Formel zur Berechnung DNA-Konzentration verwendet wird: Probenkonzentration = DF · (OD260-OD320) · NACF (1) Wo DF = Probe Verdünnungsfaktor und NACF = Nukleinsäure-Konzentration Faktor. Die Nukleinsäure-Konzentration Faktor ist in Übereinstimmung mit dem Analyten gewählt 1 gesetzt. Protein-Konzentration Ergebnisse können als pg / mL oder als mol / L durch Eingabe e280 und dem Molekulargewicht Werte ausgedrückt werden. Wenn Rückstände Werte für Tyr, Trp und Cystein (SS-Bindung) in der e280Calc Registerkarte eingegeben werden, sind die Extinktionskoeffizienten Werte wie e280 berechnet = 5500 x (Trp-Reste) + 1490 x (Tyr-Reste) + 125 x (Cystein SS-Bindung) . Die e280-Wert wird durch die Software für die Berechnung der Konzentration verwendet. Neben Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen, kann die BioSpec-nano als ultra micro-Volumen Spektralphotometer für viele andere Analyten oder als Standard-Spektralphotometer mit 5 mm Schichtdicke Zellen verwendet werden.

Diese Mitteilung enthält Daten über die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der BioSpec-nano UV-VIS Spektralphotometer für dsDNA-und Protein-Quantifizierung. Selbst bei extrem kleinen Volumina (1 bis 2 L), ist die Reproduzierbarkeit ausgezeichnet, während die automatische Wisch-Funktion verbessert den Durchsatz und die Ergebnisse in minimaler Verschleppung für genauere Ergebnisse.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Die Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäuren haben in den letzten drei Jahrzehnten bedeutende Fortschritte gemacht. Immer häufiger benötigen Molekularbiologen konsistente ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Konzentrationen von Nukleinsäuren und Proteinen mithilfe eines Mikrovolumen-Spektrophotometers genau und reproduzierbar zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die geeignete Messweglänge für die zu analysierende Probe ausgewählt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Blindprobe zu messen.Als Nächstes wird die DNA- oder Proteinprobe gemessen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Daten im PDF- oder CSV-Format zu speichern. Letztendlich liegen hochgradig reproduzierbare Ergebnisse für DNA und Protein vor.Die Quantifizierung kann mit dieser Methode schnell und genau durchgeführt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Schnelligkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit. Um mit der DNA-Quantifizierung zu beginnen, schalten Sie das BIOSpec-nano-Spektrophotometer ein.Öffnen Sie die BIOS spec nano-Software auf dem PC-Desktop. Klicken Sie auf den Reiter für einfache nukleinsaurehaltige D-S-D-N-A. Die Software stellt eine Verbindung zum Gerät her und führt eine Initialisierungssequenz aus.Dies bestätigt, dass das Instrument gemäß den Spezifikationen funktioniert. Wählen Sie als Nächstes die Weglänge am Schieberegler für die Weglänge.Für Proben im Mikroliterbereich stehen drei Optionen zur Verfügung. Es können 0,2 Millimeter oder 0,7 Millimeter verwendet werden. Und für verdünnte Proben gibt es die Möglichkeit, eine Küvette mit einer Pfadlänge von fünf Millimetern zu verwenden.In dieser Demonstration werden 0,7 Millimeter zur Messung einer zweimikroliter-Probe ausgewählt. Alle Berechnungen basieren auf der gewählten Weglänge. Klicken Sie danach in der Software auf den Reiter „Setup“ und wählen Sie die automatische Abwischfunktion aus.Wählen Sie einen für einen Abstrich. Vor der Probenmessung oder jedes Mal, wenn eine neue Weglänge ausgewählt wird, ist eine Blindmessung erforderlich. Für eine Weglänge von 0,7 Millimetern pipettieren Sie zwei Mikroliter Wasser oder Puffer auf das Podest. Klicken Sie auf „Blank“, um die Blindmessung durchzuführen.Das obere Fenster bewegt sich, um Kontakt mit dem Proben-Tropfen herzustellen, und Xenon-Blitze können beobachtet werden. Wenn die Messung abgeschlossen ist, wischt der Abstreifer automatisch die Probe ab. Nun kann die Probe gemessen werden.Es ist wichtig, eine homogene Probelösung zu verwenden, da das Vorhandensein von ungelösten Partikeln zu irreproduzierbaren Daten führt. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, saugen Sie vorsichtig zwei Mikroliter der Probe auf und pipettieren Sie die Probe dann gleichmäßig von der Pipettenspitze auf das Podest. Drücken Sie die Starttaste am Gerät. Wie zuvor bewegt sich das obere Fenster, um Kontakt mit dem Proben-Tropfen herzustellen, und Xenonblitze können beobachtet werden. Um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen, wiederholen Sie die Messung derselben Probe dreimal. Alle aufgezeichneten Daten werden automatisch als A BUD-Datei gespeichert. Um die Daten als PDF- oder CCSV-Datei zu speichern, klicken Sie auf Speichern P-D-F-C-S-V.Die Ergebnisse können auch als CSV-Datei gespeichert werden, indem die entsprechende Auswahl im Register „Speichern“ getroffen wird. Die Proteinquantifizierung kann mithilfe der Absorptionsmethode bei 280 nm durchgeführt werden. Wählen Sie dazu das Register „Proteinquantifizierung“ aus.Geben Sie den Extinktionskoeffizienten ε 280 ein, falls bekannt. Falls ε 280 nicht bekannt ist, berechnen Sie ihn mithilfe von ε 280 calc. Wählen Sie auf dem Pfadlängenregler 0,2 Millimeter, um eine 3-Mikroliter-Probe zu messen. Gehen Sie danach in der Software auf den Reiter „Setup“ und wählen Sie „Auto Wiping Setup“. Wählen Sie zwei für zwei Abwischvorgänge, um eine Probentransferierung zu verhindern und eine genaue Messung sicherzustellen.Um eine Blindmessung durchzuführen, pipettieren Sie drei Mikroliter Wasser oder Puffer auf das Prüffläschchen und klicken Sie auf „Blank“ für die Blindmessung. Danach pipettieren Sie vorsichtig drei Mikroliter der Proteinprobe auf das Prüffläschchen. Ohne Luftblasen einzuschließen, klicken Sie in der Software auf „Start“ oder drücken Sie die Starttaste am Gerät, um die Messung der Probe zu beginnen.Wiederholen Sie die Messung derselben Probe dreimal, um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Hier sind Daten aus Messungen an einer typischen doppelsträngigen DNA-Probe. Die Formel zur Berechnung der DNA-Konzentration lautet: Probenkonzentration gleich DF mal der Menge von OD 260 minus OD 320 mal NACF, wobei DF gleich dem Probenverdünnungsfaktor und NACF gleich dem Nukleinsäure-Konzentrationsfaktor ist.Der Nukleinsäure-Konzentrationsfaktor wird entsprechend dem ausgewählten Analyten eingestellt. Die berechnete Nukleinsäurekonzentration und das OD260/280-Verhältnis werden angegeben. Diese Tabelle enthält Reproduzierbarkeits-Testergebnisse zur DNA-Quantifizierung.Zusammen zeigen die Daten Ergebnisse, die aufgrund der geringen relativen Standardabweichung von 0,26 % hochgradig reproduzierbar sind. Hier sind repräsentative Ergebnisse einer Protein-Konzentrationsanalyse für BSA dargestellt. Die Protein-Konzentration in Mikrogramm pro Milliliter basiert auf dem Epsilon-280-Wert. Abschließend zeigt diese Tabelle eine Reproduzierbarkeitsanalyse der Proteinquantifizierung.Die relative Standardabweichung von 0,51 % zeigt, dass das BIOS spec nano die OD nicht nur für DNA, sondern auch für Proteine genau misst. Sobald die Methode beherrscht ist, können mehrere Proben innerhalb einer Minute analysiert werden.

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Biologie

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