Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer
February 17th, 2011
Diese Mitteilung enthält Daten über die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der BioSpec-nano UV-VIS Spektralphotometer für dsDNA-und Protein-Quantifizierung. Selbst bei extrem kleinen Volumina (1 bis 2 L), ist die Reproduzierbarkeit ausgezeichnet, während die automatische Wisch-Funktion verbessert den Durchsatz und die Ergebnisse in minimaler Verschleppung für genauere Ergebnisse.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Konzentrationen von Nukleinsäuren und Proteinen mit Hilfe eines Mikrovolumen-Spektrophotometers genau und reproduzierbar zu bestimmen. Dazu wird zunächst die geeignete Weglänge für die zu messende Probe ausgewählt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Rohling zu messen.
Als nächstes wird die DNA- oder Proteinprobe vermessen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Daten im PDF- oder CSV-Format zu speichern. Letztendlich hoch reproduzierbare Ergebnisse für DNA und Proteine.
Die Quantifizierung kann mit dieser Methode schnell und genau erfolgen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schnell, präzise und reproduzierbar ist. Um den Vorgang für die DNA-Quantifizierung zu starten, schalten Sie das Nano-Spektralphotometer der BIOS-Spezifikation ein.
Öffnen Sie die BIOS-Spezifikations-Nano-Software auf dem PC-Desktop. Klicken Sie auf die einfache Nukleinsäure-Registerkarte D-S-D-N-A. Die Software stellt die Kommunikation mit dem Gerät her und führt eine Initialisierungssequenz aus.
Dadurch wird überprüft, ob das Gerät gemäß den Spezifikationen funktioniert. Wählen Sie als Nächstes die Pfadlänge aus. Auf dem Schieberegler für die Pfadlänge.
Für Proben mit Mikrolitervolumen stehen drei Optionen zur Verfügung: Es können 0,2 Millimeter oder 0,7 Millimeter verwendet werden. Und für verdünnte Proben gibt es die Möglichkeit, ein Vete mit einer Schichtdicke von fünf Millimetern zu verwenden.
In dieser Demonstration werden 0,7 Millimeter für die Messung einer Probe von zwei Mikrolitern ausgewählt. Alle Berechnungen basieren auf der gewählten Pfadlänge. Klicken Sie anschließend in der Software auf die Registerkarte "Setup" und wählen Sie "Setup für automatisches Löschen".
Wählen Sie eine für einen Wisch aus. Vor der Probenmessung oder jedes Mal, wenn eine neue Schichtdicke ausgewählt wird, ist eine Blindmessung erforderlich. Für eine Pipette mit einer Schichtdicke von 0,7 Millimetern werden zwei Mikroliter Wasser oder Puffer auf den Sockel gegeben. Klicken Sie auf Leerdruck für eine leere Messung.
Das obere Fenster bewegt sich, um Kontakt mit dem Probentröpfchen aufzunehmen, und es können Xenonblitze beobachtet werden. Wenn die Messung abgeschlossen ist, wischt der Wischer die Probe automatisch ab. Nun kann die Probe vermessen werden.
Es ist wichtig, eine homogene Probenlösung zu verwenden, da ungelöste Partikel vorhanden sind. Probenpartikel führen zu nicht reproduzierbaren Daten. Um das Eindringen von Luftblasen zu vermeiden, aspirieren Sie vorsichtig zwei Mikroliter der Probe und pipettieren Sie die Probe dann gleichmäßig aus der Pipettenspitze auf den Sockel.
Drücken Sie den Startknopf am Instrument. Wie zuvor bewegt sich das obere Fenster, um Kontakt mit dem Probentröpfchen aufzunehmen, und Xenonblitze können beobachtet werden, um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen: Wiederholen Sie die Messung derselben Probe dreimal, alle aufgezeichneten Daten werden automatisch als A-BUD-Datei gespeichert. Um als PDF- oder CCSV-Datei zu speichern, klicken Sie auf "P-D-F-C-S-V SPEICHERN".
Die Ergebnisse können auch als CSV-Datei gespeichert werden, indem Sie die entsprechende Auswahl auf der Registerkarte "Speichern" verwenden. Die Proteinquantifizierung kann mit der Methode der Absorption zwei 80 erfolgen. Wählen Sie für die Proteinquantifizierung die Registerkarte Proteinquantifizierung aus.
Geben Sie den Extinktionskoeffizienten epsilon zwei 80 ein, falls bekannt, wenn Epsilon zwei 80 nicht bekannt ist, berechnen Sie ihn mit Epsilon zwei 80 calc 0,2 Millimeter auf dem Weglängenschieber, um eine Probe von drei Mikrolitern zu messen. Klicken Sie anschließend in der Software auf die Registerkarte "Setup" und wählen Sie "Setup für automatisches Löschen". Wählen Sie zwei für zwei Tücher, um eine Verschleppung der Probe zu verhindern und eine genaue Ablesung zu gewährleisten.
Um eine leere Pipette zu messen, geben Sie drei Mikroliter Wasser oder Puffer auf den Sockel, klicken Sie auf "Leer für leere Messung". Pipettieren Sie anschließend vorsichtig drei Mikroliter Proteinprobe auf den Sockel. Ohne Luftblasen einzuführen, um mit der Messung der Probe zu beginnen, klicken Sie in der Software auf Start oder drücken Sie die Starttaste am Gerät.
Wiederholen Sie die Messung derselben Probe dreimal, um die gezeigte Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Hier sind Daten von Messungen an einer typischen doppelsträngigen DNA-Probe. Die Formel zur Berechnung der DNA-Konzentration lautet: Die Probenkonzentration ist gleich DF mal der Menge von OD zwei 60 minus OD drei 20 mal NACF, wobei DF gleich dem Probenverdünnungsfaktor und NACF gleich dem Nukleinsäurekonzentrationsfaktor ist.
Der Nukleinsäurekonzentrationsfaktor wird entsprechend dem ausgewählten Analyten eingestellt. Die berechnete Nukleinsäurekonzentration und das Verhältnis OD 2 62 80 sind angegeben. Diese Tabelle enthält die Ergebnisse von Reproduzierbarkeitstests für die DNA-Quantifizierung.
Zusammengenommen zeigen die Daten Ergebnisse, die sehr gut reproduzierbar sind, wie die niedrige relative Standardabweichung von 0,26 % zeigt. Repräsentative Ergebnisse einer Proteinkonzentrationsanalyse für BSA sind hier dargestellt. Die Proteinkonzentration von Mikrogramm pro Milliliter basiert auf dem Epsilon two 80 Wert. Abschließend zeigt diese Tabelle eine Reproduzierbarkeitsanalyse der Proteinquantifizierung.
Die relative Standardabweichung von 0,51 % zeigt an, dass das BIOS spec nano nicht nur die DNA, sondern auch die Proteine genau misst. Einmal gemeistert, können mehrere Proben in einer Minute analysiert werden.
Übersicht
Diese Studie bewertet die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des BioSpec-nano UV-VIS-Spektrophotometers zur Quantifizierung von dsDNA und Proteinen. Die Methode zeigt eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit selbst bei ultrakleinen Probenvolumina und erhöht den Durchsatz bei minimalem Übertrag.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Analytische Chemie
- Biotechnologie
Hintergrund
- Die genaue Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen ist in der biologischen Forschung entscheidend.
- Die Mikrovolumen-Spektrophotometrie ermöglicht eine Analyse mit minimalen Probenanforderungen.
- Automatisierte Funktionen können die Messgenauigkeit und Effizienz verbessern.
- Reproduzierbarkeit ist für zuverlässige experimentelle Ergebnisse unerlässlich.
Zweck der Studie
- Um die Leistung des BioSpec-nano Spektrophotometers für die Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen zu bewerten.
- Um ein Protokoll für genaue Messungen mit kleinen Probenvolumina zu etablieren.
- Um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse durch wiederholte Messungen zu demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Auswahl der geeigneten Messweglänge für die Probenmessung.
- Blindmessung vor der Probenanalyse.
- Automatisiertes Abwischen zur Verhinderung von Überträgen zwischen den Proben.
- Datenspeicherung in PDF- oder CSV-Formaten für weitere Analysen.
Hauptergebnisse
- Hoch reproduzierbare Ergebnisse für die DNA-Quantifizierung mit einer relativen Standardabweichung von 0,26%.
- Die Proteinquantifizierung zeigte ebenfalls eine hohe Genauigkeit mit einer relativen Standardabweichung von 0,51%.
- Schnelle und präzise Messungen können mit dem BioSpec-nano erreicht werden.
- Mehrere Proben können schnell analysiert werden, was den Durchsatz erhöht.
Schlussfolgerungen
- Der BioSpec-nano Spektrophotometer bietet eine zuverlässige Quantifizierung sowohl für dsDNA als auch für Proteine.
- Automatisierte Funktionen verbessern die Messeffizient deutlich.
- Diese Methode eignet sich für Hochdurchsatzanwendungen in der biologischen Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Accurate and reproducible quantification of nucleic acids and proteins is essential for target validation and assay development in early drug discovery. The BioSpec-nano micro-volume spectrophotometer enables high-throughput, low-sample-consumption measurements with automated sample handling, reducing variability and improving data reliability for lead identification workflows. Its rapid measurement cycle and low relative standard deviation support predictive confidence in downstream screening and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise quantification of nucleic acid and protein samples to support target expression analysis and pathway interrogation.
- Operational Value: Reduces sample consumption and manual handling steps, increasing throughput for hypothesis testing in discovery biology.
- Predictive Value: Low relative standard deviation (0.26% for DNA, 0.51% for protein) enhances confidence in quantitative data used for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible absorbance measurements (OD260-OD320 for DNA, OD280 for protein) suitable for assay standardization and reagent qualification.
- Operational Value: Automated wiping and blanking minimize carryover and ensure measurement consistency across plates or batches.
- Scalability: Three-second measurement time enables rapid screening of sample libraries or fractionation outputs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker quantification and pharmacokinetic sample analysis where low-volume, high-precision detection is required.
- Mechanistic De-risking: Accurate protein concentration data (via ε280 calculation from Trp, Tyr, Cys-S-S residues) enables correct dosing in functional assays.
- Workflow Integration: Outputs in PDF/CSV format facilitate data tracking and cross-functional sharing between discovery and preclinical teams.
Pipeline & Workflow Integration
The BioSpec-nano fits within the discovery continuum from initial target validation through assay development and into preclinical sample analysis, particularly where sample conservation and measurement reproducibility are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven quantification of nucleic acids (e.g., gene expression constructs) and proteins (e.g., purified targets, antibodies) for target validation.
- Screening: Enables QC of sample inputs and reaction outputs in biochemical or cell-based assays with minimal volume requirements.
- Analytics: Delivers quantitative OD-based readouts with automated pathlength correction and extinction coefficient calculation for proteins.
- Translational Research: Compatible with low-volume preclinical samples (e.g., plasma, tissue lysates) requiring accurate concentration normalization.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared core lab resource for standardized quantitation across multiple projects and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves data quality and reproducibility in nucleic acid and protein quantitation, reducing false negatives/positives in early screening.
- Operational Value: Automation of sample contact, measurement, and cleaning reduces user variability and increases lab efficiency.
- Strategic Value: Enables faster iteration in lead optimization by providing reliable quantification for structure-activity relationship (SAR) studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted resource allocation by delivering trustworthy quantitative data for target prioritization.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with spectrophotometer principles and pathlength selection based on sample concentration.
- Needs access to a PC with BioSpec-nano software and periodic maintenance of optical surfaces.
- Benefits from standardized SOPs for blanking, wiping, and sample application to ensure cross-user consistency.
- Adaptable to various sample types (DNA, protein, other analytes) via software configuration and pathlength adjustment.
- Limited to absorbance-based quantification; not suitable for fluorescent or luminescent assays without additional instrumentation.
