Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Proteinen nach Wachstumsfaktor-Signalgebung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Animalblaster von Xenopus-Frühembryonen mit RNAs injiziert werden, die für verschiedene Proteine in RFP und den Signalmembranrezeptor FRIZZLED acht kodieren. Anschließend werden elektroporierte Implantate und/oder Embryoschnitte durch Kryosektion hergestellt und immunhistochemisch gefärbt.

Schließlich werden die immunogefärbten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die zeigen, wie die subzelluläre Lokalisation spezifischer Proteine von embryonalen Signalwegen abhängt. Als Beispiel zeigen wir, dass Diversin vom Zentrosom an die Zellmembran durch den FRIZZLED-acht-Rezeptor rekrutiert wird.

Mithilfe dieser Methode können Forscher die subzelluläre Lokalisation von Signalproteinen in vivo unter Verwendung von Xenopus-Embryonen sichtbar machen. Dies kann helfen, grundlegende Fragen der Entwicklungs- und Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise Untersuchungen zur räumlichen Regulation von Signalwegen und Zellprioritätsmechanismen. Um den Prozess der In-vitro-Befruchtung zu beginnen, gewinnen Sie Eier von weiblichen Fröschen, die mit humanem Choriongonadotropin injiziert wurden.

12 Stunden vor dem Experiment 0,5 bis ein Milliliter 1 X Marx-modifizierter Ringer-Lösung zu den Eiern geben und sie in vitro mit einem kleinen Stück des dissezierten Hodens befruchten. Nach zwei bis drei Minuten die Salzkonzentration mit 0,1 XMMR senken, um die Spermienmotilität zu aktivieren. 20 Minuten inkubieren.

Nach der Befruchtung orientieren sich die Eier mit ihren animalen Polen nach oben. Entfernen Sie die Eigeleinhülle, indem Sie die MMR-Lösung fünf Minuten lang durch eine 3%ige Cysteinlösung in Wasser ersetzen. Waschen Sie die Eier dreimal mit 0,1 XMMR.

Inkubieren Sie bei 13 Grad Celsius bis zum Zwei- bis Vier-Zell-Stadium. Danach überführen Sie die Embryonen in 3 % fi. Legen Sie in 0,5 XMMR für die Mikroinjektion an.

Synthetisieren Sie RNAs aus linearisierten DNA-Vorlagen unter Verwendung des M message M machine-Kits und verdünnen Sie diese mit RNA-freiem Wasser auf eine Konzentration von 0,1 bis 1 Mikrogramm pro Mikroliter. Für verschiedene in RFP, den Membranmarker GFP CX und FRIZZLED acht verwendete RNAs werden 0,1 bis 1 Nanogramm pro Injektion eingesetzt. Bereiten Sie Injektionsnadeln aus Kapillarrohren unter Verwendung eines Nadelziehers und einer Nadelschleifvorrichtung vor der Injektion vor.

Kalibrieren Sie jede Nadel mit Wasser, um pro Injektion 10 Liter Flüssigkeit auszustoßen. Legen Sie die Embryonen auf eine Plastikschale in einen großen Tropfen mit 3 % Fial 0,5 XMMR. Ziehen Sie eine Mikroliter RNA-Lösung mit einem engen Shige-Mikroinjektor in eine Injektionsnadel auf.

Injizieren Sie 10 Nanoliter RNA in jeweils zwei tierische Blastomeren von Zweizellen-Embryonen. Überführen Sie die injizierten Embryonen in eine Vertiefung einer 12-Loch-Platte und inkubieren Sie sie bei 13 °C, bis sie das frühe Gastrula-Stadium erreichen.

Überführen Sie die Gastro-Stage-Embryonen in eine 0,6 XMMR-Lösung in einer sechs Zentimeter großen Kunststoffschale, die mit 1 % Aeros beschichtet ist. Entfernen Sie die Vitellinmembran manuell mit einer Pinzette. Verwenden Sie anschließend eine Tsun-Nadel und eine Haarschleife, um ekto dermale Explantate aus den Embryonen auszuschneiden.

Fixieren Sie sie in 3,7 % Formaldehyd in PBS für 30 Minuten. Waschen Sie das X explan dreimal je 10 Minuten in PBS. Um die Kerne anzufärben, geben Sie davi zum dritten Waschschritt hinzu.

Als Nächstes montieren Sie das X-Explan auf einem Objektträger, indem Sie es zwischen zwei Streifen Klebeband platzieren, wobei die innere unpigmentierte Seite des X-Explans zum Objektiv weist. Geben Sie zwei bis drei Tropfen der Montierlösung à 20 µL hinzu. Legen Sie einen Deckgläser darauf.

Die injizierten Embryonen können kryoseziiert werden, um die Verteilung fluoreszierender Proteine in der Zelle sichtbar zu machen und mit spezifischen Antikörpern zu kontrastfärben. Fixieren Sie die Embryonen im Stadium 10 für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur mit einem dichten Fixansatz in einem vier Milliliter fassenden Glasfläschchen. Danach, nach dem Waschen in PBS, werden die Embryonen in einer Lösung aus 15 % Fischgelatine und 15 % Saccharose im selben Fläschchen eingebettet.

Am nächsten Tag überführen Sie die eingebetteten Embryonen in eine Kunststoffform. Gefrieren Sie die eingebetteten Embryonen rasch auf Trockeneis ein. Bereiten Sie anschließend Kryoschnitte mit einem Kryostaten vor.

Führen Sie eine immunfluoreszenzchemische Färbung der Schnitte durch, montieren Sie die Objektträger und nehmen Sie Querschnitte von Embryonen mit derselben Methode auf, die bereits für Ektoderm-Implantate beschrieben wurde. Sammeln Sie die Bilder mithilfe eines Zes Axio Plan-Fluoreszenzmikroskops mit den geeigneten Filtern und einemome, um spezifische Z-Ebenen innerhalb des X-Explan zu identifizieren und abzubilden. In dieser Abbildung lokalisiert sich Ersin im Centrosom der ektodermalen Zellen, ist jedoch in die Zellmembran translokalisiert.

Auf Frizzled Acht reagierend markiert cex GFP die Zellmembran grün. Diverse in RFP erscheint rot, und DPI-markierte Kerne sind hier blau. Diverse in RFP wird durch Frizzled Acht in Kryoschnitten von Embryonen an die Zellmembran rekrutiert.

Gamma-Tubulin ist ein zentrosomaler Marker. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis für die Nützlichkeit von XUS-Embryonen und embryonalen Zellen für Untersuchungen der Protein-Dock-Autorisierung und Signalisierungsvorgänge bei untergeordneter Auflösung haben.