Name: Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von Iris-Pigmentepithelzellen zur Untersuchung der Linsenregeneration bei Molchen. Diese Methode ermöglicht die Analyse dorsaler und ventraler Zellen sowie deren Regenerationspotenzial.

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Diese Arbeit wurde durch ein NIH Ey10540 zu PAT finanziert.

1. Iris Cell Culture <ol><li> Sammeln Augäpfel von 7 Molche (narkotisierten in 0,1% Ethyl-3-Aminobenzoesäure Methansulfonsäure in PBS) hergestellt und in Calcium-Magnesium-freier Hanks-Lösung (CMF). </li><li> Wechseln Sie die Handschuhe und die Arbeit in der Gewebekultur Kapuze. </li><li> Sterilisieren Augäpfel in Lugol-EtOH für 3 Sekunden. </li><li> Wash 2 Mal in CMF. </li><li> Transfer Augen Hanks und beginnen Dissektion. </li><li> Dissect Iris-Hornhaut-Komplex und entfernen neuronalen Netzhaut. </li><li> Transfer-Komplexe in ein neues Gericht von Hanks. </li><li> Mit Nr. 15 Skalpell, separate Komplexe in dorsalen und ventralen Hälften. </li><li> Entfernen Iris-Fragmente (ventral zuerst) und in eine Schüssel mit 1 ml L-15. </li><li> Fügen Sie 15% (150 ul) Volumen von Dispase (7,5 Einheiten / ml Konzentration). </li><li> Inkubation bei 27 ° C für 2 Stunden (wrap Schale mit Parafilm). </li><li> Isolieren IPE Zellen von Stroma (Place Trypsin-Lösung bei 27 ° C). </li><li> Sammeln IPE Zellen in ein 1,5 ml-Tube. </li><li> Zentrifugation bei 1000 rpm bei RT (Raumtemperatur) für 2 Minuten, entfernen Überstand. </li><li> Waschen mit 1 ml Hanks und Zentrifuge bei 1000 rpm bei RT für 2 Minuten, Überstand entfernen. </li><li> 1 ml Trypsin-Lösung; inkubieren für 2 Stunden bei 27 ° C. </li><li> Zentrifugation bei 1000 rpm bei RT für 2 Minuten, entfernen Trypsin. </li><li> 1 ml L-15 zu waschen, zentrifugieren bei 1000 rpm für 2 Minuten. </li><li> Add 800 ul L-15, Pipette langsam auf und ab ~ 10-mal (mehr als 12 Mal reduziert Haftung). </li><li> Platte der IPE Zellen auf einem 24-Well-Kollagen beschichtete Platte und inkubieren bei 27 ° C für 2 Wochen (in der Regel, 4 dorsalen und 4 ventralen Brunnen sind zwischen 7 und Molche erhalten). </li><li> In diesem Stadium Zellen eignen sich für die Gen-Transfektion oder die Behandlung mit Faktoren, um ihre Rolle bei der Induktion oder stören Objektiv Regeneration zu bestimmen. </li></ol> 2. Aggregation von Iris Cells <ol><li> Um die Platten mit Iris-Zellen add 20 &amp;mgr; l der Dispase-Lösung zu 400 ul Medium, vorsichtig schwenken. </li><li> Die Platten bei 27 ° C über Nacht. </li><li> Pipettieren vorsichtig nach oben und unten zu verdrängen Zellen </li><li> Legen Sie Zellen in Eppendorf-Röhrchen und Spin 2 Minuten bei 1000 rpm bei RT. </li><li> Nehmen Sie mittel-und waschen durch Zugabe von 1 ml komplette L-15, Spin 2 Minuten bei 1000 rpm bei RT, entfernen Medium. </li><li> Verwenden 2000-7000 Zellen pro Aggregat. Geben Sie 200 ul L-15 pro Aggregat in jedes Röhrchen. </li><li> Split-Zellen (200 ul) in neue Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Spin bei 1000 rpm für 2 min bei RT. </li><li> Inkubieren für 48 Stunden bei 27 ° C. </li></ol> 3. Die Implantation von Aggregrated Cells <ol><li> Machen Sie einen Schlitz in die Hornhaut des Auges newt und entfernen Sie die Linse. </li><li> Nach Linse entfernt, legen Sie die IPE Zellverbandes knapp unterhalb der Hornhaut auf der Bauchseite des Auges. </li><li> Die Molche sind für einen Monat aufbewahrt, damit sie regenerieren die Linse. </li></ol> 4. Einbettung von Newt Eye <ol><li> Entfernen Sie den Molch Augen mit dem Aggregat implantiert und legen Sie sie in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Fix in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für mindestens 4 Stunden oder über Nacht. </li><li> Wash in PBS, 4 ° C für 30 Minuten. </li><li> Behandeln Sie es mit 0,85% iger Kochsalzlösung: 4 ° C, 30 Minuten. </li><li> Wash in Saline / Ethanol (1:1): RT für 15 Minuten. </li><li> Wash in 70% Ethanol: RT, 15 Minuten. Wiederholen Sie es einmal. </li><li> Wash in 85% Ethanol und 95% Ethanol bei RT, 30 Minuten </li><li> Wash in 100% Ethanol: RT, 30 Minuten. Wiederholen Sie es einmal. </li><li> Lagerung bei 4 ° C oder fortzusetzen. </li><li> Wash in 100% Xylol: RT, 30 Minuten. Wiederholen Sie es einmal. </li><li> Behandeln Sie mit Xylol / Paraffin (1:1): 60 ° C, 45 Minuten. </li><li> Behandeln Sie mit 100% Paraffin: 60 ° C, 20 Minuten. Wiederholen Sie es noch zwei weitere Male. </li><li> Embed in Einbettformen. </li></ol> 5. Sectioning <ol><li> Bereiten 15 um Abschnitte der embedded Auge mit Hilfe eines Mikrotoms. </li><li> Legen Sie das Auge Abschnitte auf einer Gelatine beschichtete Folie und lassen Sie es auf einer Folie wärmer. </li></ol> 6. Die Färbung <ol><li> Die Objektträger in Xylol für 10 Minuten. Wiederholen Sie es noch einmal. </li><li> Hydrate in: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% Ethanol für jeweils 1 Minute </li><li> Spülen in DI-Wasser für eine Minute. </li><li> Wash in PBS für 15 Minuten. </li><li> Wash in PBST (0,2% Triton-X 100 in PBS) für 15 Minuten. </li><li> Wash in PBS für 15 Minuten. </li><li> Legen Sie in Blocking-Lösung (10% Ziegenmilch sekundärer Antikörper) für eine Stunde. </li><li> Legen Sie in primärer Antikörper zur Übernachtung. </li><li> Wash primärer Antikörper in PBS für 15 Minuten. </li><li> Wash in PBST für 15 Minuten. </li><li> Wash in PBS für 15 Minuten. </li><li> Legen Sie in sekundären Antikörper für 2 Stunden in dunklen (1:100 Verdünnung in PBS). </li><li> Wash in PBS, PBST und PBS für jeweils 15 Minuten und dann montieren. </li><li> Den Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Dieses Verfahren zur Kultivierung newt irist Zellen wurde verwendet, um die Regenerationsfähigkeit der dorsalen und der ventralen IPE Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus ist es auch möglich, spezielle Gene, die in Richtung des Objektivs Regeneration Mechanismus in newt Auge beitragen zu studieren. Wenn die Zellen für 2 Wochen kultiviert wurden (Abbildung 1) können sie von den Genen transfiziert werden, um ihre Funktion in der Linse Regeneration zu untersuchen. Von besonderem Interesse sind Gene, die die ventralen Iris induzieren könnte. Da die ventralen Iris Zellen können nicht auf die Linse transdifferenzieren (Abbildung 2) die induktive Funktion eines Kandidatengen untersucht werden können. In der Vergangenheit mit dieser Technik haben wir gezeigt, dass, wenn sechs-3 über wurde in Anwesenheit von Retinsäure Objektiv Induktion exprimiert wurde von der ventralen Iris 6 beobachtet. In Abbildung 3 sehen wir, dass der ventralen Iris aggregierten Anstieg gab ein ausgewachsener und differenzierte Linse (Pfeilspitze), nicht anders als die Host-Objektiv aus dem dorsalen Iris (Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. a) Dorsal Iris pigmentierten Epithelzellen in vitro für einen Zeitraum von 2 Wochen kultiviert. b) Ventrale Iris pigmentierten Epithelzellen in vitro für einen Zeitraum von 2 Wochen kultiviert. Beachten Sie, dass Pigmentierung dieser Phase besteht in beiden dorsalen und ventralen Iris-Zellen. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Regenerationsfähigkeit von kultivierten IPE Zellen. a) Objektiv Induktion von dorsal IPE Zellverband (Pfeilspitze). Host-Objektiv Induktion von dorsal Iris (Pfeil), di: dorsale Iris, vi: ventral Iris le: Linsenepithel, lf: Linsenfasern. b) Fehlen der Linse Induktion von ventral IPE Zellverband (Pfeilspitze). Host-Objektiv Induktion von dorsal Iris (Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Objektiv Induktion von ventral Aggregat mit sechs-3 transfiziert und mit Retinsäure. Host-Objektiv Induktion von dorsal Iris (Pfeil). Objektiv Induktion von ventral Aggregat (Pfeilspitze).

<ol><li>Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration in vertebrates.</a> Dev Biol. 221, 273-284 (2000).</li>
<li>Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newt%27s+eye+view+of+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A newt's eye view of lens regeneration.</a> Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).</li>
<li>Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+regeneration+at+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Eye regeneration at the molecular age.</a> Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).</li>
<li>Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+between+dorsal+and+ventral+iris+in+lens+producing+potency+in+normal+lens+regeneration+is+maintained+after+dissociation+and+reaggregation+of+cells+from+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).</li>
<li>Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+system+for+functional+gene+analysis+in+adult+amphibian+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration.</a> Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).</li>
<li>Grogg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+inhibition-driven+regulation+of+six-3+underlies+induction+of+newt+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration.</a> Nature. 438, 858-862 (2005).</li>
<li>Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+Newt+Lens+Regeneration%3A+Specific+Control+of+Proliferation+and+Evidence+for+miRNA+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking.</a> PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).</li>
<li>Madhavan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Maki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-type+linker+histone+B4+is+required+for+transdifferentiation+of+somatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo.</a> FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).</li>
</ol>

Dieses Protokoll wurde ein in vitro System zur Linse Regeneration Mechanismen in Molche Studie etabliert. Da die Aggregate (entweder dorsal oder ventral treu zu folgen ihren in vivo-Verhalten während der Regeneration dieser Technik kann der enorme Aufwand für Transgenese in Molche erforderlich und kann für gain of function sowie Verlust der Funktion Experimente 7,8,9 verwendet werden zu lindern. Auch können die Aggregate oder die Iris als Ganzes leicht mit Wachstumsfaktoren behandelt und untersucht deren Auswirkungen, wie in diesem Protokoll beschrieben. Zum Beispiel die Rolle der BMP-Weg wurde untersucht mit dieser Technik 6.

<table><tbody><tr><td>Lösung von Lugol&amp;rsquo;s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6146</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>L-15 (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4386</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin-Sulfat</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>100x, 15160</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (Lösung von Amphotericin B)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>24-Loch-Platte mit Kollagen-Beschichtung</td><td>BD Biosciences</td><td>354408</td><td></td></tr></tbody></table>

ein system zur kultivierung iris pigmentepithelzellen nach lens regeneration in newt study

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamander wie Newt Axolotl besitzen die Fähigkeit, viele seiner verlorenen Körperteile wie Beine, der Schwanz mit Rückenmark, Augen, Gehirn, Herz, die Backe 1 regenerieren. Insbesondere sind Molche einzigartig für seine Linse Regenerationsfähigkeit. Nach Linse entfernt, IPE Zellen der dorsalen Iris-Objektiv Zellen transdifferenzieren und bilden schließlich eine neue Linse in etwa einem Monat 2,3. Diese Eigenschaft der Regeneration wird nie von der ventralen Iris Zellen zeigten. Die Regenerationsfähigkeit der Iris-Zellen können, indem Transplantation von in vitro kultivierten Zellen IPE untersucht werden. Für die Kultur sind die dorsalen und ventralen Iris Zellen zunächst aus dem Auge isoliert und separat für einen Zeitraum von 2 Wochen (Abbildung 1) kultiviert. Diese gezüchteten Zellen werden neu zusammengefügt und wieder auf das Newt Auge implantiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass die dorsale reaggregieren seiner Linse bilden Kapazität behält, während die ventralen Aggregat der keinen Linse, rekapitulieren, damit die in vivo-Verfahren (Abb. 2) 4,5. Dieses System zur Bestimmung Regenerationsfähigkeit der dorsalen und ventralen Iris-Zellen ist sehr nützlich bei der Untersuchung der Rolle von Genen und Proteinen in der Linse Regeneration beteiligt.

In newt, regeneriert die Linse immer von der dorsalen Iris durch Transdifferenzierung der Iris pigmentierten Epithelzellen (IPE). Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kultur dorsalen und ventralen newt IPE Zellen und deren Implantation der Molch Auge. Die implantierten Zellen werden dann durch Gewebe Schnitte und Immunhistochemie untersucht.

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamander wie Molche und Axolotl besitzen die Fähigkeit, viele ihrer verlorenen Körperteile zu regenerieren, wie zum Beispiel Gliedmaßen, den Schwanz mit dem Rückenmark, das Auge, das Gehirn, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, irisepitheliale Pigmentzellen zu kultivieren, um die Linsenregeneration bei Molchen zu untersuchen. Dazu wird zunächst ein Molch in einer Betäubungslösung betäubt und anschließend die Augen entfernt.Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, pigmentierte Epithelzellen der Iris aus dem Augengewebe zu isolieren, indem zuerst das Netzhautgewebe entfernt wird, gefolgt vom Zerschneiden von irischen Hornhautfragmenten in dorsale und ventrale Hälften. Die Iriszellen werden anschließend vom Stromagewebe getrennt und zwei Wochen lang in vitro kultiviert. Nach zweiwöchiger Kultivierung werden die IPE-Zellen aggregiert und anschließend in einen Empfängerembryo implantiert, der zuvor optimiert wurde.Nach einem Monat Heilung zeigt die Histologie das Linsenregenerationspotenzial der dorsalen und ventralen IPE-Zellen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend für die Zellkultur- und Implantationsschritte, die aufgrund der Notwendigkeit hunderter Fähigkeiten in Mikrodissektion und Chirurgie schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, mindestens sieben Nacktmäuse mit 0,1 % Ethylaminobenzoat-Methansulfonsäure zu anästhesieren, ihre Augen mittels Pinzette und chirurgischer Schere zu entfernen, wobei Sie das Augenlid zusammen mit der Bindehaut abschneiden. Danach durchtrennen Sie den Sehnerv.Bringen Sie die präparierten Augen nun schnell in eine Sterilhaube und desinfizieren Sie sie drei Sekunden lang in Lugo-Ethanol. Anschließend waschen Sie die Augen zweimal in einer kalzium- und magnesiumfreien Hank-Lösung. Überführen Sie sie in frische Hank-Lösung und setzen Sie die Präparation fort.Erstellen Sie mit einem Skalpell einen Einschnitt im Auge. Schneiden Sie dann mit einer Schere entlang des Hornhautrands. Entfernen Sie die Linse und schneiden Sie das verbleibende Netzhautgewebe zusammen mit der Sklera ab.Überführen Sie die Iris-Cornea-Komplexe mit einem Skalpell der Größe 15 in eine Schale mit frischem Hank's. Trennen Sie die Komplexe in ihre dorsalen und ventralen Hälften. Die dorsale und ventrale Iris werden anhand der schwarzen Flecken auf der Sklera der dorsalen Seite sowie eines V-förmigen Einschnitts an der ventralen Iris identifiziert.Trennen Sie die ventrale Iris von der dorsalen Iris. Sammeln Sie die Irisfragmente in einer 35-Millimeter-Schale, die ein Milliliter L-15-Lösung enthält. Bewahren Sie die dorsalen und ventralen Hälften in getrennten Schalen auf.Geben Sie nun 150 Mikroliter Dispa-Lösung zu den Schalen hinzu und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei 27 Grad Celsius. Um IPE-Zellen aus dem Stroma zu gewinnen. Mit Hilfe einer Pinzette werden die IPE-Zellen vorsichtig von allen gesammelten Gewebefragmenten abgezogen.Überführen Sie anschließend die IPE-Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie zwei Minuten bei Raumtemperatur mit 1000 RP M. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Hankslösung und wiederholen Sie die Zentrifugation, um die Zellen zu separieren. Entsorgen Sie den Hankslösung und resuspendieren Sie das Pellet erneut.In einem Milliliter einer 1:250-Trypsinlösung zwei Stunden bei 27 Grad Celsius inkubieren, um die Zellen zu waschen; anschließend zentrifugieren und das Trypsin entfernen. Ein Milliliter L-15-Lösung hinzufügen und erneut zentrifugieren; den Waschschritt einmal wiederholen und mit 800 Mikrolitern frischer L-15-Lösung ersetzen; die Zellen vorsichtig in Lösung pipettieren. Die Zellen nun in 24-Well-Platten ausbringen, die mit Kollagen beschichtet sind.Die übliche Ausbeute aus sieben Ns beträgt vier Vertiefungen mit dorsalen Zellen und vier Vertiefungen mit ventralen Zellen. Inkubieren Sie die Petrischale nach zwei Wochen für zwei Wochen bei 27 Grad Celsius. Hier gezeigt kann das IPE durch Gene transfiziert werden, um deren Funktion bei der Linsenregeneration zu untersuchen.Diese zweiw&ouml;chige Kultur ventraler IPE-Zellen weist dieselbe Morphologie wie die dorsalen Zellen auf. Beachten Sie, dass die Pigmentierung in diesem Stadium sowohl in den dorsalen als auch in den ventralen Iriszellen erhalten bleibt. Vor der Implantation der IPE-Zellen m&uuml;ssen diese durch Zugabe von 20 Mikrolitern Dyse in 400 Mikroliter frisches Kulturmedium zu den Zellen aggregiert werden, die Platte vorsichtig geschwenkt und die Zellen &uuml;ber Nacht bei 27 Grad Celsius im Inkubator belassen werden.Am nächsten Tag die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren lösen und anschließend in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Röhrchen zentrifugieren und den Überstand mit einem Milliliter L 15 ersetzen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Verwenden Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension, um die Zellzahl mit Standardmethoden zu berechnen.Nach der Berechnung 3.000 bis 5.000 Zellen in 200 Mikrolitern L-15 pro Aggregat vorbereiten. Die Zellen nun abzentrifugieren und 48 Stunden lang inkubieren. Bei 27 Grad Celsius können die Zellen anschließend in ein Empfängertier implantiert werden.Betäuben Sie zunächst ein erwachsenes Tier in der Schlafösung, bis es sich nicht mehr bewegt. Erzeugen Sie nun mit einer Rasierklinge einen Schlitz in der Hornhaut des Auges. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette die Linse.Nachdem die Linse entfernt wurde, platzieren Sie das IPE-Zellaggregat direkt unterhalb des Hornhautgewebes auf der ventralen Seite des Auges. Bringen Sie den Mol jetzt in einen separaten Behälter zurück und lassen Sie ihn ausheilen. Vermeiden Sie währenddessen eine Beschädigung des heilenden Gewebes, indem Sie den Mol vorsichtig behandeln.Die transplantierten Zellen benötigen einen Monat, um sich zu einer neuen Linse zu regenerieren. Nach Ablauf eines Monats entfernen Sie die neuen, mit den aggregierten Zellen implantierten Augen und fixieren das Gewebe. Mithilfe eines Standard-Dehydrierungsprotokolls kann das fixierte Gewebe in Einbettungsschablonen eingebettet werden, die zum Schneiden von 15 Mikrometer dicken Schnitten und deren geeigneter Färbung geeignet sind.Nach der Implantation eines Aggregats in das linke neue Auge induziert das Aggregat aus den dorsalen IPE-Zellen die Bildung einer neuen Linse. Die Induktion einer Wirtslinse aus der dorsalen Iris wird ebenfalls im Auge mit der ventralen Implantation beobachtet. Keine Linseninduktion wird von dem Aggregat ausgehend beobachtet, das aus den ventralen IPE-Zellen hergestellt wurde, wenn das Gen six three überexprimiert wird; in Gegenwart von Retinsäure hingegen wird eine Linseninduktion aus dem ventralen Aggregat beobachtet.Außerdem wird die Induktion einer Wirtslinse aus der dorsalen Iris des Auges nach ihrer Entwicklung beobachtet. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Linsenregeneration den Weg, um die Rolle verschiedener Gene in einem neuen Bereich zu untersuchen.

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Forschung

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