Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study
22. Juni 2011
In newt, regeneriert die Linse immer von der dorsalen Iris durch Transdifferenzierung der Iris pigmentierten Epithelzellen (IPE). Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kultur dorsalen und ventralen newt IPE Zellen und deren Implantation der Molch Auge. Die implantierten Zellen werden dann durch Gewebe Schnitte und Immunhistochemie untersucht.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, irisepitheliale Pigmentzellen zu kultivieren, um die Linsenregeneration bei Molchen zu untersuchen. Dazu wird zunächst ein Molch in einer Betäubungslösung betäubt und anschließend die Augen entfernt.
Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, pigmentierte Epithelzellen der Iris aus dem Augengewebe zu isolieren, indem zuerst das Netzhautgewebe entfernt wird, gefolgt vom Zerschneiden von irischen Hornhautfragmenten in dorsale und ventrale Hälften. Die Iriszellen werden anschließend vom Stromagewebe getrennt und zwei Wochen lang in vitro kultiviert. Nach zweiwöchiger Kultivierung werden die IPE-Zellen aggregiert und anschließend in einen Empfängerembryo implantiert, der zuvor optimiert wurde.
Nach einem Monat Heilung zeigt die Histologie das Linsenregenerationspotenzial der dorsalen und ventralen IPE-Zellen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend für die Zellkultur- und Implantationsschritte, die aufgrund der Notwendigkeit hunderter Fähigkeiten in Mikrodissektion und Chirurgie schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, mindestens sieben Nacktmäuse mit 0,1 % Ethylaminobenzoat-Methansulfonsäure zu anästhesieren, ihre Augen mittels Pinzette und chirurgischer Schere zu entfernen, wobei Sie das Augenlid zusammen mit der Bindehaut abschneiden. Danach durchtrennen Sie den Sehnerv.
Bringen Sie die präparierten Augen nun schnell in eine Sterilhaube und desinfizieren Sie sie drei Sekunden lang in Lugo-Ethanol. Anschließend waschen Sie die Augen zweimal in einer kalzium- und magnesiumfreien Hank-Lösung. Überführen Sie sie in frische Hank-Lösung und setzen Sie die Präparation fort.
Erstellen Sie mit einem Skalpell einen Einschnitt im Auge. Schneiden Sie dann mit einer Schere entlang des Hornhautrands. Entfernen Sie die Linse und schneiden Sie das verbleibende Netzhautgewebe zusammen mit der Sklera ab.
Überführen Sie die Iris-Cornea-Komplexe mit einem Skalpell der Größe 15 in eine Schale mit frischem Hank's. Trennen Sie die Komplexe in ihre dorsalen und ventralen Hälften. Die dorsale und ventrale Iris werden anhand der schwarzen Flecken auf der Sklera der dorsalen Seite sowie eines V-förmigen Einschnitts an der ventralen Iris identifiziert.
Trennen Sie die ventrale Iris von der dorsalen Iris. Sammeln Sie die Irisfragmente in einer 35-Millimeter-Schale, die ein Milliliter L-15-Lösung enthält. Bewahren Sie die dorsalen und ventralen Hälften in getrennten Schalen auf.
Geben Sie nun 150 Mikroliter Dispa-Lösung zu den Schalen hinzu und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei 27 Grad Celsius. Um IPE-Zellen aus dem Stroma zu gewinnen. Mit Hilfe einer Pinzette werden die IPE-Zellen vorsichtig von allen gesammelten Gewebefragmenten abgezogen.
Überführen Sie anschließend die IPE-Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie zwei Minuten bei Raumtemperatur mit 1000 RP M. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Hankslösung und wiederholen Sie die Zentrifugation, um die Zellen zu separieren. Entsorgen Sie den Hankslösung und resuspendieren Sie das Pellet erneut.
In einem Milliliter einer 1:250-Trypsinlösung zwei Stunden bei 27 Grad Celsius inkubieren, um die Zellen zu waschen; anschließend zentrifugieren und das Trypsin entfernen. Ein Milliliter L-15-Lösung hinzufügen und erneut zentrifugieren; den Waschschritt einmal wiederholen und mit 800 Mikrolitern frischer L-15-Lösung ersetzen; die Zellen vorsichtig in Lösung pipettieren. Die Zellen nun in 24-Well-Platten ausbringen, die mit Kollagen beschichtet sind.
Die übliche Ausbeute aus sieben Ns beträgt vier Vertiefungen mit dorsalen Zellen und vier Vertiefungen mit ventralen Zellen. Inkubieren Sie die Petrischale nach zwei Wochen für zwei Wochen bei 27 Grad Celsius. Hier gezeigt kann das IPE durch Gene transfiziert werden, um deren Funktion bei der Linsenregeneration zu untersuchen.
Diese zweiwöchige Kultur ventraler IPE-Zellen weist dieselbe Morphologie wie die dorsalen Zellen auf. Beachten Sie, dass die Pigmentierung in diesem Stadium sowohl in den dorsalen als auch in den ventralen Iriszellen erhalten bleibt. Vor der Implantation der IPE-Zellen müssen diese durch Zugabe von 20 Mikrolitern Dyse in 400 Mikroliter frisches Kulturmedium zu den Zellen aggregiert werden, die Platte vorsichtig geschwenkt und die Zellen über Nacht bei 27 Grad Celsius im Inkubator belassen werden.
Am nächsten Tag die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren lösen und anschließend in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Röhrchen zentrifugieren und den Überstand mit einem Milliliter L 15 ersetzen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Verwenden Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension, um die Zellzahl mit Standardmethoden zu berechnen.
Nach der Berechnung 3.000 bis 5.000 Zellen in 200 Mikrolitern L-15 pro Aggregat vorbereiten. Die Zellen nun abzentrifugieren und 48 Stunden lang inkubieren. Bei 27 Grad Celsius können die Zellen anschließend in ein Empfängertier implantiert werden.
Betäuben Sie zunächst ein erwachsenes Tier in der Schlafösung, bis es sich nicht mehr bewegt. Erzeugen Sie nun mit einer Rasierklinge einen Schlitz in der Hornhaut des Auges. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette die Linse.
Nachdem die Linse entfernt wurde, platzieren Sie das IPE-Zellaggregat direkt unterhalb des Hornhautgewebes auf der ventralen Seite des Auges. Bringen Sie den Mol jetzt in einen separaten Behälter zurück und lassen Sie ihn ausheilen. Vermeiden Sie währenddessen eine Beschädigung des heilenden Gewebes, indem Sie den Mol vorsichtig behandeln.
Die transplantierten Zellen benötigen einen Monat, um sich zu einer neuen Linse zu regenerieren. Nach Ablauf eines Monats entfernen Sie die neuen, mit den aggregierten Zellen implantierten Augen und fixieren das Gewebe. Mithilfe eines Standard-Dehydrierungsprotokolls kann das fixierte Gewebe in Einbettungsschablonen eingebettet werden, die zum Schneiden von 15 Mikrometer dicken Schnitten und deren geeigneter Färbung geeignet sind.
Nach der Implantation eines Aggregats in das linke neue Auge induziert das Aggregat aus den dorsalen IPE-Zellen die Bildung einer neuen Linse. Die Induktion einer Wirtslinse aus der dorsalen Iris wird ebenfalls im Auge mit der ventralen Implantation beobachtet. Keine Linseninduktion wird von dem Aggregat ausgehend beobachtet, das aus den ventralen IPE-Zellen hergestellt wurde, wenn das Gen six three überexprimiert wird; in Gegenwart von Retinsäure hingegen wird eine Linseninduktion aus dem ventralen Aggregat beobachtet.
Außerdem wird die Induktion einer Wirtslinse aus der dorsalen Iris des Auges nach ihrer Entwicklung beobachtet. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Linsenregeneration den Weg, um die Rolle verschiedener Gene in einem neuen Bereich zu untersuchen.
Übersicht
Diese Studie beschreibt eine Methode zur Kultivierung iris pigmentierter Epithelzellen (IPEs) aus Molchen, um die Linsenregeneration zu untersuchen. Das Verfahren beinhaltet die Isolierung und Implantation dieser Zellen in das Molchauge, gefolgt von einer histologischen Analyse zur Beurteilung der Linsenbildung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Regenerative Biologie
- Zellkultivierungstechniken
Hintergrund
- Neuwelten besitzen die Fähigkeit, Linsen aus dorsalen Iriszellen zu regenerieren.
- Die pigmentierten Epithelzellen der Iris (IPEs) spielen eine entscheidende Rolle bei diesem Regenerationsprozess.
- Das Verständnis der Mechanismen der Linsenregeneration kann Einblicke in die regenerative Medizin liefern.
- Frühere Studien haben das Potenzial der IPEs bei der Linsenbildung gezeigt.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Kultivierung dorsaler und ventraler IPEs von Molchen.
- Untersuchung der Linsenregenerationsfähigkeit dieser kultivierten Zellen.
- Visuelle Demonstration der Zellkultur- und Implantationstechniken.
Verwendete Methoden
- Anästhesie und chirurgische Entfernung von Molchaugen.
- Isolierung von IPE-Zellen aus dorsalen und ventralen Irisfragmenten.
- In-vitro-Kultur von IPE-Zellen für zwei Wochen.
- Implantation aggregierter IPE-Zellen in empfängliche Molchaugen.
Hauptergebnisse
- Die histologische Analyse zeigte eine erfolgreiche Linsenregeneration aus dorsalen IPE-Implantaten.
- Keine Linseninduktion wurde von ventralen IPE-Zellen beobachtet, es sei denn, bestimmte Gene wurden überexprimiert.
- Die Studie demonstrierte die Bedeutung dorsaler IPEs für die Linsenbildung.
- Transfizierte IPE-Zellen behielten während der Kultur ihre Morphologie und Pigmentierung bei.
Schlussfolgerungen
- Die etablierte Methode eignet sich zur Untersuchung der Linsenregeneration bei Molchen.
- Weitere Forschungsarbeiten können die genetischen Faktoren untersuchen, die die Linsenregeneration beeinflussen.
- Diese Technik könnte zum Verständnis regenerativer Prozesse bei anderen Arten beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die mechanistische Absicherung von Linsenregenerationswegen, indem sie ein reproduzierbares In-vitro-System bereitstellt, um die Funktion dorsaler gegenüber ventraler iris-pigmentepithelialer Zellen zu untersuchen. Sie unterstützt die Zielvalidierung in der regenerativen Biologie, indem sie Variablen isoliert, die die Transdifferenzierungskapazität bestimmen. Das System bietet eine Vorhersagekraft zur Priorisierung genetischer und molekularer Zielstrukturen in präklinischen Entdeckungsplattformen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Linsenbildungs-Kapazität kultivierter dorsaler und ventraler IPE-Zellen getestet wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht biologisches De-Risiko durch Reaggregations- und Implantationsassays, die das Regenerationspotenzial in vivo nachbilden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem identifiziert wird, welche genetischen Modifikationen die regenerative Funktion in ventralen IPE-Aggregaten wiederherstellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte IPE-Aggregate, die für die nachgeschaltete Untersuchung von Verbindungen oder genetischen Faktoren in einem krankheitsrelevanten System geeignet sind.
- Quantifizierbare Ausgabe: Ermöglicht die Messung der Linseninduktion als funktionellen Endpunkt nach Implantation und Abheilung.
- Skalierbarkeit: Unterstützt die Plattenbeprobung in Mehrfachbrunnen und Aggregationsabläufe zur parallelen Prüfung experimenteller Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert einen regenerativen Prozess mit klarer dorsoventraler Polarität und liefert Erkenntnisse zu positionsabhängigen Signalen bei der Gewebereparatur.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Ergebnisse aus In-vitro-Kulturen mit In-vivo-Ergebnissen durch histologische Validierung der Linsenbildung.
- Mechanistische Ent风险reduktion: Klärt die gen-spezifischen Beiträge zur Regeneration, wie beispielsweise die Rolle von six3 und Retinsäure bei der Umprogrammierung des ventralen IPE.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase ein, indem sie eine hypothesengetriebene Validierung von Regenerationszielen ermöglicht, bevor man sich auf die Optimierung von Leitstrukturen oder präklinische Wirksamkeitsstudien festlegt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen durch die Isolierung von IPE-Zellen, um das Transdifferenzierungspotenzial unter kontrollierten Bedingungen zu testen.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Aggregate zur Bewertung genetischer oder pharmakologischer Modulatoren der Linsenregeneration.
- Analytik: Erzeugt histologische Endpunkte, die den Vergleich der regenerativen Kapazität zwischen experimentellen Gruppen erlauben.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Phänotypen mit der in-vivo-Geweberegeneration und unterstützt so risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung von Regenerationsmechanismen unter verschiedenen genetischen oder umweltbedingten Störungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Einblicke in die Mechanismen der Plastizität von Iriszellen und verringert die Uneindeutigkeit bei der Zielvalidierung für die Regeneration.
- Operativer Wert: Bietet standardisierte, skalierbare Zellkultur- und Implantationsverfahren mit definierten Zeitrahmen von zweiwöchiger Kultur und einmonatiger Heilphase.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch die Bestätigung, ob molekulare Interventionen die regenerativen Funktionen in nicht-permissiven Zelltypen wiederherstellen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf ihrer Fähigkeit, die Linsenbildung in ventralen IPE-Aggregaten zu induzieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrochirurgie, Gewebedissektion und steriler Zellhandhabung zur Isolierung und Aggregation der Regenbogenhaut.
- Abhängig von kollagenbeschichteten Kulturgefäßen, L15-Medium, Trypsin und Dissoziationsreagenzien für eine gleichmäßige Gewinnung von IPE-Zellen.
- Benötigt standardisierte Aggregationsprotokolle unter Verwendung von Farbstoff und kontrollierter Inkubation, um reproduzierbare Pelletbildung sicherzustellen.
- Setzt Kenntnisse in histologischer Aufarbeitung und Schnitttechnik voraus, um die Linsenregenerationsresultate einen Monat nach der Implantation zu bewerten.
- Eingeschränkt durch die Verfügbarkeit von Molchexemplaren und die technische Schwierigkeit, die dorsale und ventrale Regenbogenhaut anhand anatomischer Landmarken zu trennen.
