Ein Calcium Biolumineszenzassay für die funktionelle Analyse von Mosquito ( Aedes aegypti) Und Tick ( Rhipicephalus microplus) G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Struktur-Wirkungs-Beziehungen synthetisierter Arthropoden-Neuropeptide an ihren jeweiligen GPCRs zu analysieren. Dies wird erreicht, indem chinesische Hamsterovar-Zellen, K1-Empty-Zellen, mit dem gewünschten GPCR-Expressionsvektor transfiziert werden, um stabil transformierte Zelllinien, die von einer einzelnen Zelle abstammen, zu erhalten. Im zweiten Schritt wird die stabile Zelllinie mit dem Quaran-Plasmid transfiziert, das den Reporter Gina Quaran trägt, um die intrazelluläre Biolumineszenz im Calcium-Biolumineszenz-Plattenassay zu messen. Anschließend wird der Calcium-Biolumineszenz-Plattenassay durchgeführt, um die zytoplasmatischen Calciumspiegel nach Applikation des Peptidliganden auf diese rekombinanten Zellen zu bestimmen.

Es werden Ergebnisse erhalten, die Unterschiede in Biolumineszenz-Einheiten nach Applikation strukturell unterschiedlicher Peptide oder verschiedener Peptidkonzentrationen auf rekombinante Zellen zeigen, basierend auf der ausgelösten intrazellulären Kalziumfreisetzung, wie sie im Plattenassay durch den Reporter a corrin nachgewiesen wird. Der Hauptvorteil der Verwendung stabil transformierter, klonaler Zelllinien, die rekombinante GPCRs exprimieren, gegenüber Trends und Expressionsprotokollen liegt darin, dass die Rezeptor-Expressionsniveaus gleichmäßiger sind, was Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ermöglicht. Außerdem erlaubt die gezielte Lokalisierung des Aquarium-Proteins in den Mitochondrien empfindliche Kalziummessungen mittels Biolumineszenz, was das Experiment verdeutlicht. Heute werden zwei Doktoranden, lie und Simon Kersch, sowie ein Postdoktorand aus meinem Labor teilnehmen.

Um stabile Zelllinien zu etablieren, beginnen Sie mit dem Kultivieren von Chinese-hamster-ovary-K1-leeren Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Pflegen Sie die leeren Zellen in Wachstumsmedium mit 1× Antibiotikum-Antimykotikum, sobald die Zellen gesund wachsen. Säen Sie die Chinese-hamster-ovary-K1-Zellen in T-25-Zellkulturgefäße aus und kultivieren Sie die Zellen über Nacht in Wachstumsmedium ohne Antibiotika, bis sie etwa 30 % konfluent sind.

Vor der Transfektion: Bereiten Sie einen DNA-Expressionsvektor vor, der den gewünschten GPCR enthält, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Kombinieren Sie die DNA mit 100 µL Optum-Medium mit reduziertem Serum.

Mischen Sie sechs Mikroliter Lipofektionsreagenz in 100 Mikroliter F12K-Medium ohne Serum und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 30 bis 45 Minuten. Nach der Inkubation mischen Sie vorsichtig die DNA- und Lipofektionsreagenzlösungen tropfenweise. Lassen Sie das Gemisch 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem 15-Milliliter-Röhrchen stehen.

Mischen Sie das Transfektionsgemisch tropfenweise vorsichtig in 1,8 Milliliter frisches F 12 K-Medium ein. Waschen Sie dann die Zellen mit PBS und geben Sie diese neue Transfektionslösung zu den Zellen hinzu. Anschließend 18 Stunden inkubieren.

Wechseln Sie das Medium zu F 12 K, Medium mit 10 % FBS ohne Antibiotika, und inkubieren Sie über Nacht am folgenden Tag. Teilen Sie die Zellen wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben in zwei T-25-Flaschen mit F 12 K, Medium mit 10 % FBS ohne Antibiotika auf. Inkubieren Sie weitere 18 Stunden.

Ersetzen Sie das Medium durch ein selektives Medium. Kultivieren Sie die Zellen anschließend über einen Zeitraum von drei bis vier Wochen in diesem selektiven Medium. Dadurch werden Zellen selektiert, die das Plasmid stabil in ihre genomische DNA eingebaut haben.

Setzen Sie die Kultivierung der Zellen mit Erhaltungsmedium fort und frieren Sie die Zelllinien regelmäßig ein, um einen Verlust im Falle einer unerwarteten Kontamination zu verhindern. Um für klonale Zelllinien zu selektieren, verdauen Sie zunächst die Zellen mit Trypsin und zentrifugieren Sie die Zellen mit Erhaltungsmedium gemäß dem schriftlichen Protokoll. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter Erhaltungsmedium.

Entnehmen Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension und geben Sie 4,5 Milliliter frisches Erhaltungsmedium hinzu, um eine 10×-Verdünnung herzustellen. Überführen Sie 100 Mikroliter der 10×-Verdünnung in 12 Vertiefungen einer 96-Loch-Platte, um die Selektion einzelner Zellen zu ermöglichen. Führen Sie anschließend etwa 19-mal eine serielle 10×-Verdünnung dieser Zellen durch, um theoretisch eine Endverdünnung von einer Zelle pro 100 Mikroliter zu erreichen, und überführen Sie jeweils 100 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung in 12 Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Nach 18 Stunden Inkubation untersuchen Sie die 96-Loch-Platten unter einem invertierten Licht- oder Fluoreszenzmikroskop und markieren die Vertiefungen, die offensichtlich nur eine einzelne Zelle oder zwei Zellen enthalten, die sich eindeutig von einer einzigen Zelle geteilt haben.

Beobachten Sie die Platten täglich und wechseln Sie das Medium alle drei Tage. Lassen Sie die Zellen eine Woche lang wachsen, bis sie etwa zu 80 % konfluent sind. Spülen Sie dann die markierten Vertiefungen mit 200 Mikrolitern PBS und Trypsin ab.

Spülen Sie sie mit 100 Mikrolitern PBS-Tripsin-EDTA-Lösung aus. Entfernen Sie die PBS-Tripsin-EDTA-Lösung. Geben Sie 100 Mikroliter Pflegemedium hinzu und überführen Sie die Zellen aus jedem markierten Wells in ein Wells einer sechs-Well-Platte mit einem Milliliter Pflegemedium.

Nachdem die Zellen drei Tage lang in der 6-Loch-Platte kultiviert wurden, überführen Sie die Zellen in einzelne T25-Flaschen. Gefrieren Sie die Zelllinie regelmäßig ein, damit sie wiederbeschafft werden kann, falls die Zellen nicht mehr gleichmäßig ansprechen. Um die Zelllinie mit der höchsten Antwort zu bestimmen, testen Sie die überführten Zellen mithilfe des Kalzium-Biolumineszenz-Assays mit einem aktiven Liganden wie dem Rezeptor, Peptid, Liganden oder einem anderen positiven Kontroll-Agonisten.

Der Kalzium-Biolumineszenz-Assay wird später in diesem Video ausführlich demonstriert. Führen Sie die Einzelzellselektion ein zweites Mal durch, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren. Wenn klonale Zelllinien für Assays ausgewählt und im Kulturmedium gehalten werden, ist es entscheidend, die Passagezahlen zu dokumentieren, da Zellen mit hoher Passagezahl möglicherweise nicht mehr in einem T-25-Fläschchen funktionieren.

Befinden Sie Zelllinien, die den gewünschten Rezeptor exprimieren, in Erhaltungsmedium bis zu einer Konfluenz von etwa 90 %. Nachdem Sie die Zellen abgenommen und zentrifugiert haben, suspendieren Sie sie in Erhaltungsmedium, verdünnen die Zellen etwa 10-fach mit Erhaltungsmedium und bestimmen die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Anschließend stellen Sie die Zellzahl auf etwa zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter ein, geben zwei Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte und inkubieren die Platte 24 Stunden lang, sodass die Zellen zum Beginn des Kalzium-Biolumineszenz-Plattenassays etwa 60 % konfluent sein sollten.

Bereiten Sie das Reporter-Gen der Wahl im Expressionsvektor-Konstrukt vor. Hier wird ein in den Mitochondrien exprimierter Quorum-Reporter verwendet. Transfizieren Sie anschließend die Zellen mit einem Mikrogramm dieses Reporter-Plasmids, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Nachdem die Zellen 24 Stunden in einer 6-Loch-Platte inkubiert wurden, werden sie mit Trypsin behandelt, zentrifugiert und resuspendiert. Anschließend wird die Zellanzahl auf 400.000 Zellen pro Milliliter eingestellt und 100 Mikroliter dieser Suspension in jedes Loch einer 96-Loch-weißen Mikrotiterplatte mit dünnem Boden überführt. Die Platte wird weitere 24 Stunden inkubiert, bis eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht ist. Diese Zelldichte ist optimal für den Biolumineszenz-Assay. Die folgenden Schritte sollten im Dunkeln durchgeführt werden, sind hier jedoch zur Veranschaulichung im Licht dargestellt.

Zur Demonstration bereiten Sie genügend kalziumfreies DME-Medium mit fünf Mikromolar CHO Terezin für 90 Mikroliter pro Vertiefung vor. Entfernen Sie das alte Medium von der Platte und geben Sie 90 Mikroliter in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten drei Stunden lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, danach sind die Zellen bereit für die Untersuchung.

Dieses Experiment wird mit einem Nova-Star-Plattenreader im Biolumineszenzmodus durchgeführt. Um den Spülvorgang zu starten, sollte die Platte im Dunkeln in den Plattenhalter eingelegt werden, während die Maschine pumpt. Lösen Sie die Peptide in einem 1,5-Milliliter-EOR-Röhrchen auf.

Verwenden Sie ausreichend kalziumfreies DME und Medium für 10 Mikroliter einer 10× Peptidlösung pro Mulde. Stellen Sie vor der Anwendung die Aspirattiefe und die Positionsermittlung der Peptidlösung ein. Reizen Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern des Peptids und beginnen Sie unmittelbar mit der Aufzeichnung der Lichtemission.

In dieser Demonstration wird das Gerät so eingestellt, dass es für jede Vertiefung alle zwei Sekunden die Lichtemission bei 465 Nanometern über einen Gesamtzeitraum von 50 Sekunden aufzeichnet. Nach Abschluss des Durchlaufs spülen Sie die Gerätepumpen. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Peptidprobe, speichern Sie die Daten und spülen Sie die Gerätepumpen erneut nach dem Assay.

Die Daten zur Lichtemission aus jedem Well werden automatisch vom Softwareprogramm in ein Microsoft Excel-Datenblatt übertragen. Fügen Sie die Daten aus Excel in die Prism-Software 4.0 ein. Erstellen Sie ein Diagramm mit den verschiedenen Peptidkonzentrationen auf der x-Achse und den Biolumineszenzeinheiten.

Auf der Y-Achse wählen Sie eine nichtlineare Regressionskurvenanpassung, um Konzentrations-Antwort-Kurven für jedes Peptid und deren entsprechende EC50-Werte zu erhalten. Jedes Experiment sollte dreimal zur Datenanalyse wiederholt werden. Wenn in chinesischen Hamstereierstockzellen, K1-Zellen, exprimiert, verhielt sich der Kininrezeptor aus Aedes aegypti als Multiligandenrezeptor und reagierte funktionell bereits auf Konzentrationen von einem Nanomol.

Für die drei endogenen Aedes-Kinine, die einzeln mittels des Calcium-Biolumineszenz-Plattenassays getestet wurden, wurden statistisch unterschiedliche EC50-Werte von etwa 16 Nanomolar für Aedes aegypti Kinin 3, 26 Nanomolar für Aedes aegypti Kinin 2 und 49 Nanomolar für Aedes aegypti Kinin 1 bestimmt, was zu einer Rangfolge der Wirksamkeit führte, wobei Aedes-Kinin 3 als das wirksamste und Aedes-Kinin 1 als das am wenigsten wirksame wirkte. Hier ist der Aktivitätsvergleich von sechs α-Aminoisobuttersäure-Kinin-Analoga an der Zecken-Kinin-Rezeptor-exprimierenden Chinese-Hamster-Ovary-K1-Zelllinie mittels eines Calcium-Biolumineszenz-Plattenassays dargestellt.

Die Y-Achse stellt die prozentuale maximale Biolumineszenz-Einheiten für jedes Analogon dar, ausgedrückt als Prozentsatz der Biolumineszenz bei einer Konzentration im Vergleich zur maximalen Reaktion bei allen getesteten Konzentrationen für jedes Analogon. Das Hexapeptid-Analogon KININE F-F-F-S-W-G Amid dient als positiver Kontrollstoff für die Rezeptoraktivität. Das Kinin-Analogon mit einer einzigen Substitution, Doppel-F-Aminoisobuttersäure-WG-Amid, war aktiver als das positive Kontroll-Hexapeptid-Analogon KININE; das Kinin-Analogon mit zwei Aminobuttersäure-Substitutionen, Aminobuttersäure-FF-Aminobuttersäure-WG-Amid, erwies sich als das wirksamste unter den getesteten Doppelsubstitutions-Analoga. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man A-G-P-C-R exprimiert und klonale Zelllinien erhält, um Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Liganden an Rezeptoren mittels eines Calcium-Biolumineszenz-Assays zu analysieren.