"Bioluminescent 'Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Yesinia Pestis und Bacillus Anthrax sind bakterielle Erreger der Kategorie A, die jeweils die Pest und Milzbrand verursachen. Obwohl das natürliche Auftreten beider Krankheiten heutzutage relativ selten ist, besteht die reale Möglichkeit, dass terroristische Gruppen diese Erreger als Biowaffe einsetzen. Dieses Video demonstriert eine Methode zum Nachweis und zur Identifizierung von Yersinia pestis.

Zunächst wird das Mikroorganismus auf Agarplatten und in flüssigen Medien kultiviert. Anschließend wird ein y pesti-spezifischer Reporter-pH zur Kultur gegeben. Der Reporter-pH enthält die Gene, die für die bakterielle Luciferase, luxE AB, in seinem Genom kodieren.

Wenn Y. pestis-Zellen vorhanden sind, bindet der Reportersphage spezifisch an die Zelle, injiziert seine rekombinante DNA, die die luxAB-Gene trägt, und nutzt die transkriptionellen und translationalen Mechanismen des Wirts, um die luxAB-Reportergene zu transkribieren und zu translatieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Proben ein biolumineszentes Phänotyp angenommen haben, was darauf hinweist, dass das unbekannte Mikroorganismus positiv als Yersinia pestis identifiziert wurde. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie dem traditionellen Phagenlyse-Assay, besteht darin, dass die zum Nachweis und zur Identifizierung von Yersinia pestis erforderliche Zeit Minuten statt Tage beträgt. Diese Methode kann helfen, das Vorhandensein von Yersinia pestis schnell zu identifizieren und nachzuweisen, und zwar entweder mit isolierten Kulturen oder direkt aus komplexen klinischen oder Umweltproben.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Diagnose der Pest, da die Krankheit in der Regel tödlich verläuft, wenn sie nicht innerhalb der ersten 24 Stunden nach Symptombeginn behandelt wird. Daher ist die rechtzeitige Identifizierung von Yesenia pestis für eine positive Prognose entscheidend. Da Phagen für nahezu alle bakteriellen Arten existieren, könnte die Methodik potenziell für jede Art angepasst werden, die medizinisch, ökologisch oder landwirtschaftlich wichtig ist, einschließlich Y. pestis.

A 1122 ist ein ausgeschlossener Selektagent der Biosicherheitsstufe zwei. Er besitzt weder das 75 Kilobasen große Perlo-Calcium-Response- oder LCR-Virulenzplasmid noch das PGM-Locus, die beide für die Virulenz erforderlich sind. Beginnen Sie dieses Verfahren in einem Sicherheitswerkbank der Klasse zwei Typ A unter Verwendung steriler Technik, indem Sie Y. pestis, A 1122, ausstricheln.

Stammkulturen auf LB-Agar wie hier gezeigt ansetzen. Die Platten verkehrt herum in einen statischen, temperaturgeregelten Luftinkubator bei 28 Grad Celsius für 48 Stunden stellen. Die Wachstumsrate von Y. pestis ist langsam, mit einer Generationszeit von 1,25 Stunden nach zwei Tagen.

Verwenden Sie eine sterile Metallinokulationschleife, um eine einzelne Y. pestis-Kolonie auszuwählen. Wählen Sie eine Kolonie, die in der Größe einheitlich ist, für die anderen Kolonien repräsentativ erscheint und deutlich von den übrigen Kolonien auf der Platte getrennt ist. Übertragen Sie die Kolonie in ein steriles Kulturrohr (17 × 100 mm), das zwei Milliliter LB-Brühe enthält.

Schließen Sie das Röhrchen und wirbeln Sie es kurz an, dann stellen Sie es für etwa 20 Stunden in einen schüttelnden Inkubator bei 225 U/min bei 28 Grad Celsius. Für diesen Assay sind aktiv wachsende Zellen zur Detektion bevorzugt. Da die Fähigkeit des Phagen zur Transduktion besteht, korreliert eine biolumineszente Reaktion mit der Vitalität und Fitness der Wirtsbakterien.

Trotzdem hat sich gezeigt, dass das Nachweissystem mit Zellen kompatibel ist, die in allen Phasen des Wachstumszyklus geerntet wurden. Verdünnen Sie die Y pestis-Kultur nach 20 Stunden Wachstum im Verhältnis 1 zu 20 in einem 50-Milliliter-Konischglas, indem Sie 500 Mikroliter Zellen zu 10 Milliliter LB-Brühe hinzufügen. Stellen Sie die Kultur anschließend wieder in den schüttelnden Inkubator bei 28 Grad Celsius.

Lassen Sie die Kultur wachsen, bis eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,2 erreicht ist. Dies sollte ungefähr fünf Stunden dauern, um das Substrat für die Biolumineszenzreaktion zu erzeugen. Bereiten Sie eine 2 %ige N-Decanal-Lösung zu, indem Sie 200 Mikroliter N-Decanal mit 9,8 Millilitern LB-Brühe kombinieren.

Schwenken Sie kräftig für fünf Sekunden. Danach bereiten Sie den Injektor des Mikroplatten-Luminometers vor. Führen Sie ein Ende des Injektor-Schlauchs und ein 13-Milliliter-Gefäß mit 2%iger Decal-Lösung zusammen, und geben Sie das andere Ende des Injektor-Schlauchs in einen Abfallbehälter.

Verwenden Sie die Gerätesoftware, um die Maschine anzuweisen, die Injektorleitung mit zwei Millilitern der Decanallösung zu spülen. Nach Abschluss des Vorgangs sollte die Leitung mit einem Substrat gefüllt sein; setzen Sie das Ende der Injektorleitung wieder in ihre vorgesehene Position zurück, sodass sie bereit ist, in die Vertiefungen zu injizieren. Anschließend weisen Sie das Luminometer an, automatisch 67 Mikroliter der Decanallösung in jede Mikroplatte zu injizieren.

Danach sofort die Stärke der Biolumineszenz über einen Zeitraum von 10 Sekunden messen. Als Nächstes für jede Probe und jede dreifache Beschriftung drei Kulturröhrchen für jede Bedingung vorbereiten. Hier werden zusätzlich zu einer Testprobe jeweils eine Kontrolle ohne Zusatz und eine Kontrolle mit nur Zellen vorbereitet.

Es werden also neun Reagenzgläser benötigt, um Kontrollproben mit Phagen allein vorzubereiten; geben Sie je ein Milliliter-Aliquot von LB-Brühe in drei Kulturgefäße. Geben Sie 20 Mikroliter des Reportersphagen hinzu. Stammlösung mit fünf mal 10 hoch neun Plaque-bildenden Einheiten oder PFU pro Milliliter zu jedem Gefäß.

Bei Abwesenheit von Y pesti-Zellen sollte die Zugabe des Reporters des Phagen keine biolumineszente Reaktion hervorrufen. Als Nächstes bereiten Sie die Testproben vor, indem Sie je einen Milliliter Aliquot der Y pesti-Kultur auf drei Kulturröhrchen verteilen. Geben Sie 20 Mikroliter des Reporters-Phagen-Stamms zu drei der Kulturen hinzu.

Vermischen Sie die Kulturen durch kurzes Vortexen, um allein die Zellen vorzubereiten. Für die Negativkontrollen, die zur Bestimmung der Hintergrund-Autolumineszenz dienen, pipettieren Sie je ein Milliliter-Aliquot der Y. pestis-Kultur in drei zusätzliche Kulturröhrchen. Nach der Probenvorbereitung übertragen Sie 200 Mikroliter von jeder Kultur in die Vertiefungen einer weißen 96-Well-Mikrotiterplatte für die Messung zum Zeitpunkt null.

Stellen Sie den Rest jeder Kultur bei 28 Grad Celsius in den Schüttler und messen Sie die Zeit mit einem Mikroplatten-Luminometer. Nullen Sie die Proben für Biolumineszenz oder relative Lichteinheiten.

Nehmen Sie Biolumineszenzmessungen vor, indem Sie 200 Mikroliter aus jeder Kultur entnehmen und die Messungen im Mikroplatten-Luminometer nach 20, 30, 40 und 60 Minuten durchführen. Nachdem Sie den Reportervirus hinzugefügt haben, um den Nachweisprozess ohne die Notwendigkeit eines Y. pestis-Auswachsens zu beschleunigen, überführen Sie eine Kolonie von einer frisch angezüchteten Platte in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern LB, das den Reportervirus enthält. Mischen Sie die Probe durch Vortexen und geben Sie dann das Zell-Virus-Gemisch in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte.

Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte bei 28 Grad Celsius für 60 Minuten. Anschließend messen Sie die Probe auf Biolumineszenz. Der in diesem Video dargestellte Test weist das Vorhandensein von Y pestis-Zellen nach, wie in der Einleitung beschrieben.

Wenn Y. pestis vorhanden ist, bindet der Reportervirus an einen spezifischen Rezeptor auf der Zelle, injiziert seine DNA und nutzt die transkriptionellen und translationalen Maschinerien des Wirts, um das luxE-Gen, ein Reportergen, zu transkribieren und zu translatieren. Die Signalstärke und die Reaktionszeit des Signals sind proportional zur Anzahl der vorhandenen Zellen bei hohen Zellkonzentrationen, 10⁵ bis 10⁸ KBE pro Milliliter.

Eine signifikante Zunahme der RLU im Vergleich zu den Kontrollen sollte innerhalb von 20 Minuten bei niedrigeren Zellkonzentrationen, 10 hoch zwei bis 10 hoch vier KBE pro Milliliter, erkennbar sein. Eine signifikante Zunahme der RLU sollte innerhalb von 40 bis 60 Minuten erkennbar sein. Ein repräsentatives Zeitverlaufs-Experiment zur Reporter-Phagen-vermittelten Detektion von Y. pestis ist hier zu den Zeitpunkten null dargestellt.

Reporter-Phagen und Zellen wurden gemischt, bei 28 Grad Celsius inkubiert und die Biolumineszenz in RLU über die Zeit hinweg überwacht. Ein Anstieg der RLU war innerhalb von 12 Minuten erkennbar und signifikant mit einem P-Wert von P < 0,05. Die negativen Kontrollen mit ausschließlich Phagen oder Zellen zeigten während der 60-minütigen Inkubation einen Grundwert der Biolumineszenz von etwa 20 RLU. Beachten Sie, dass die Grundwerte gerätespezifisch sind.

Im Gegensatz dazu ist bei den Testproben ein Anstieg der Biolumineszenz der Reporter-Phagenzellen 12 Minuten nach der Phagenzugabe deutlich erkennbar. Die Signalmessung sollte über einen Zeitraum von 50 Minuten stetig ansteigen, wobei Inkubationen über einen Zeitraum von mehr als 80 Minuten – hier nicht dargestellt – zu einem Rückgang des Signals von seinem Maximalwert führen, bedingt durch phagenvermittelte Lyse der Wirtszellen. Ähnliche Ergebnisse werden bei Inkubationstemperaturen von 37 Grad Celsius erzielt, obwohl die optimale Wachstumstemperatur für Y. pestis 28 Grad Celsius beträgt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der rekombinante Reportergebrauch für die Detektion angewendet wird. Sobald die Identifizierung von Yesenia Pestis beherrscht ist, kann diese Technik innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden, wobei S Golden Colonies als initialer Inokulum verwendet werden. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen und Phagen im Labor verwenden, ist es wichtig zu bedenken, dass Ihre bakteriellen Stammsorten sehr leicht mit dem Phagen kontaminiert werden können; achten Sie daher darauf, die Möglichkeit einer Kontamination zu verringern.

Verwenden Sie Einweg-Kunststoffschutzausrüstung mit Pipettenspitzen und wechseln Sie regelmäßig die Handschuhe. Die Fähigkeit des Reportagenkonstrukts, eine Blum-Reaktion auszulösen, korreliert mit der Fitness der Zelle. Nach der Identifizierung von Yesenia Pesta kann die Reportage daher verwendet werden, um die Antibiotikasuszeptibilität des Isolats zu bestimmen.

Beispielsweise sind Yesenia pesta-Zellen, die mit einer inhibitorischen Konzentration des Antibiotikums inkubiert werden, entweder vollständig unfähig oder stark in ihrer Fähigkeit eingeschränkt, ein biolumineszentes Signal zu erzeugen. Im Gegensatz dazu werden Yesenia pesta-Zellen, die antibiotikaresistent sind, durch das Vorhandensein des Antibiotikums nicht beeinträchtigt und können eine biolumineszente Reaktion hervorrufen, die jener ungebremster Zellen entspricht. Auf diese Weise lässt sich ein Profil der Empfindlichkeit des Erregers gegenüber Antibiotika rasch bestimmen.

Zu Illustrationszwecken verwendeten wir einen abgeschwächten Yesenia-Pest-Stamm. In diesem Experiment ist Yesenia-Pest eine Kategorie, ein bakterieller Krankheitserreger. Bei der Durchführung dieser Technik mit Proben, die darauf untersucht werden, Yesenia Pestis zu enthalten, müssen angemessene Bio-Sicherheits- und Bio-Gefahrenschutzmaßnahmen eingehalten werden.