Name: Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Leukozyten aus dem Gehirn TMEV-infizierter Mäuse mittels Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Immunzellphänotypen durch Durchflusszytometrie.

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Diese Arbeit wurde durch Grant NS64571 aus dem NINDS (CLH) unterstützt wird, durch eine frühzeitige Career Development Award von der Mayo Clinic (CLH), und durch ein großzügiges Geschenk von Donald und Frances Herdrich (CLH). Wir möchten die Mayo Clinic Durchflusszytometrie Core for Unterstützung danken.

1. Intrakranielle Virus Injektion: Das folgende Verfahren wurde geändert und weitgehend durch unser Labor und Kollegen genutzt. Kurz gesagt, intrakranieller Injektion des Daniel Stamm murinen Enzephalomyelitis Theiler ist Virus (TMEV) oder schein-Infektion (1, 10) ist auf junge Mäuse (vorzugsweise 5-6 Wochen alt) durchgeführt, um Gehirn infiltrieren Leukozyten (Bils) zu entlocken. Bitte beachten Sie, dass die Ergebnisse wird zwischen den Daniel Stamm, die Bean-Stamm, und der GDVII Belastung unterscheiden. Für die Zwecke der Ernte Bils, erhalten Mäusen 2x10 5 PFU von TMEV und sind für 24 Stunden infiziert. <ol><li> Bringen Sie die Injektionsnadel (27 Gauge, ¼ in, Kendall), eine automatische 1 ml Hamilton-Spritze und auf 10 ul des Virus liefern. </li><li> Erstellen Sie TMEV in 10 ul DMEM in die Spritze mit besonderer Aufmerksamkeit, um Luftblasen. Gegebenenfalls erhalten sham infizierten Mäusen 10 ul virenfrei DMEM. </li><li> Unmittelbar vor der Injektion, pour etwa 1 mL von Isofluran in einer Glasglocke, dass ein Drahtgitter mit Baumwolle Substrat unterhalb enthält. </li><li> Legen Sie einfach direkt auf Mäuse Drahtgitter in der Glocke, bis sie leicht narkotisiert werden, unempfindlich gegen toe-kneifen und immobilisiert durch die Inhalations-Anästhetika, ca. 10-15 Sekunden. Mäuse sollten nicht in direkten Kontakt mit Isofluran kommen, als Substanz kann irritierend sein und ätzend. </li><li> Während der Narkose, bereiten Mäuse für die Injektion von schnellen Auffinden geeigneter Koordinaten im frontalen Kortex Region auf dem Schädel mit Rasier-und Farbgebung. Die allgemeine Lage für die Injektion ist 1 mm anterior zu Bregma und 1 mm seitlich der Sagittalnaht auf der rechten Seite (Abbildung 1). Während stereotaktische Injektion kann sinnvoll sein für einige experimentelle Situationen haben wir festgestellt, dass freie Hand Injektion ohne Rasieren oder Einfärben geeignet für die Mehrzahl der Experimente ist. Das Fell mit der Nadelspitze an beiden Achsen eignet sich für die Injektion. </li><li> Um eine Injektion zu machen, richten Sie die Nadel senkrecht auf den Schädel, und drücken durch den Knochen auf ca. 3 mm Tiefe. </li><li> Express-Virus in das Gehirn, indem Sie die Hamilton-Spritze gedrückt und wartet 2 Sekunden für das Virus auf das Gehirn vor Aberkennung geben. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Nadel und die Maus in einem sauberen, trockenen Käfig. Mäuse aus der Narkose erwachen und schnell wieder normale Funktion innerhalb weniger Minuten. Give gebührende Aufmerksamkeit zu Mäusen, die anormale Symptome aufweisen, wie zB starke Blutungen an der Injektionsstelle, wie Euthanasie der Tiere angemessen sein. Richtiger Umgang mit Tier 6 und die Einhaltung der National Institutes of Health and Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Richtlinien müssen befolgt werden. </li></ol> 2. Brain-infiltrierenden Leukozyten Zellpräparation: <ol><li> Bereiten Rundboden-Oak Ridge Zentrifugenröhrchen mit einer Kapazität von 30 ml mit 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll und 1 ml 10X PBS und Rohre sollten bei RT auf der Bank sitzen während des Gehirns Löschvorgang halten kann. </li><li> Bringen Ficoll-Paque Plus Raumtemperatur (RT). </li><li> Euthanize Tier durch veränderte Isofluran Überdosierung 5 und schnell zu entfernen, das Gehirn mit einem Edelstahl-Gewebe Spachtel und in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml RPMI auf Eis. Unter bestimmten Umständen kann PBS-Perfusion angemessen zu entfernen zirkulierenden peripheren Blutzellen aus dem Bils Vorbereitung. Mäuse sollten vollständig und ordnungsgemäß betäubt vor PBS-Perfusion. </li><li> Transfer-Hirn-und RPMI-Lösung zu einem 7 ml Glas Pyrex Marke Tenbroeck Gewebe Mühle und sanft mit 10-15 Schlägen zu homogenisieren. </li><li> Pipet weitere 5 ml RPMI in den Homogenisator und Pipette nach oben und unten zweimal. Transfer Hirnhomogenat (ca. 10 ml) auf den vorbereiteten Rundboden-Röhrchen und vorsichtig umdrehen 2-3 mal zu mischen. </li><li> Spin Hirnhomogenat bei 7800g ave für 30 min bei RT in einer F0360 Festwinkelrotor in einem Beckman Allegra X-22R klinischen Zentrifuge. </li><li> Nach dem Zentrifugieren zu entfernen Myelin Trümmer, schwebte auf der Oberseite der Steigung hat. Sammeln Sie die Leukozyten-Schicht, die oberhalb der roten Blutkörperchen Pellet (Abbildung 2) schwebt. </li><li> Der Stamm Leukozyten Schicht durch ein 40 um Zellsieb in einen 50 ml konisch. Bringen Lösung bis zu 50 ml Volumen mit RMPI. </li><li> Spin Röhrchen mit verdünnten Zellsuspension in einer klinischen Zentrifuge bei 1500 rpm (600g ave) für 5 min bei RT. </li><li> Den Überstand aspirieren und sammeln das Zellpellet. Das Pellet in 1 ml FACS-Puffer (1% Rinderserumalbumin, 0,02% Natriumazid in Calcium-und Magnesium-freiem PBS) und übertragen Sie die Zellsuspension 5 ml Rundboden FACS-Röhrchen. </li><li> Sorgfältig Unterlage Aufhängung mit 1 ml Ficoll-Paque Plus. </li><li> Spin Röhrchen bei 2500 rpm (1400 gab) in klinischen Zentrifuge für 25 min bei RT ohne Bremse. </li><li> Entfernen weißen, flauschigen Schicht an der Oberfläche (Abb. 2) mit 1 ml Pipette und Übertragung auf neue 5 ml FACS-Röhrchen. Wash cEllen mit 4 ml FACS-Puffer. </li><li> Spin Röhrchen bei 1500 rpm (600g ave) für 5 min bei RT in klinischen Zentrifuge zur Pellet-Zellen. </li><li> Saugen Sie den Überstand und sammeln Zellpellet. Resuspendieren Leukozyten Pellet in geeigneten Puffer und halten auf dem Eis in neuen FACS-Röhrchen. </li><li> Zählen von Zellen, beurteilen die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss und zu analysieren, mittels Durchflusszytometrie. Im Allgemeinen können die Ermittler erwarten, ca. 5 x 10 5 Zellen / Tier zu erwerben. </li></ol> 3. Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung <ol><li> Nach Isolierung und Zählung der Leukozyten, Spin die Zellen für 3 Minuten bei 1500 rpm (600 gab) in einer klinischen Zentrifuge. </li><li> Das Pellet in Blocking-Puffer mit folgendem Inhalt: FACS-Puffer, Überstand aus 2.4G2 Hybridom (Fc block; anti-CD16/32) und fötalem Rinderserum bei einem Verhältnis von 10.05.01 und inkubieren für 30 Minuten bei 4 ° C . </li><li> Bereiten Sie und fügen konjugierte Antikörper gegen extrazelluläre Antigene, um die blockierten Zellen bei einer Konzentration von 1:200 und Inkubation für 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. Stain und inkubieren Zellen in 200 ul in einem 96-Loch-V-Bodenplatte. Entsprechende Kontrollen sind ungefärbte Zellen und Fluorochrom Entschädigung Proben, wie nötig. </li><li> Drehen Sie die gefärbten Zellen bei RT für 3 Minuten bei 1500 rpm (600 gab) in einer klinischen Zentrifuge mit einem Rotor geeignet für 96-Well-Platten. </li><li> Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Zellen mit 200 ul FACS-Puffer durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren 3 mal. </li><li> Wiederholen Sie die obigen Waschtechnik zweimal. </li><li> Nach dem Waschen die Zellen in 2% Paraformaldehyd und Transfer zum FACS-Röhrchen. Fixation ist für den durchflusszytometrischen Analyse von Zellen des Biosafety Level 2 Reagenzien infiziert erforderlich. </li><li> Führen Sie den fixierten Zellen auf einer BD FACS Calibur nach einer modifizierten Durchflusszytometrie Methode 8 und analysieren Dateien offline mit FlowJo, WinMDI oder anderen verfügbaren Durchflusszytometrie-Analyse-Software. </li><li> Die Analyse der 50-100,000 Ereignisse pro Probe ist in der Regel für eine angemessene Immunphänotypisierung erforderlich. </li></ol> Direkt konjugierte Antikörper in diesem Experiment verwendet: CD45 wurde mit Klon 30-F11 erkannt. Ly6C / G wurde mit Klon Gr1, RB6-8C5 erkannt. CD11b wurde mit Klon M1/70 erkannt. F4/80 wurde mit Klon BM8 erkannt. 4. Repräsentative Ergebnisse: Wir zeigen Zelle Phänotypisierung Ergebnisse für Maus Bils 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 3). Leukozyten mit PerCP-konjugiertem anti-Maus CD45 gefärbt wurden, um Immunzellen erkennen, PE-konjugierten Anti-Maus Ly6C / G zu erkennen inflammatorischen Monozyten, APC-konjugierten Anti-Maus-CD11b und APC-konjugierten Anti-Maus F4/80, um Zellen zu erkennen von Monozyten Linie. Die Analyse wurde mit einem BD FACS Calibur Gerät durchgeführt. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Anatomische Lokalisation der Injektionsstelle. Die Injektionsstelle ist 1 mm anterior zu Bregma und 1 mm seitlich der Sagittalnaht auf der rechten Seite befindet. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Illustration von Gradienten Trennung von Leukozyten und Bils. Leukozyten werden zunächst direkt unterhalb des Myelin Trümmer Schicht und vor der RBC Pellet im Percoll-Gradienten gesammelt. Der weiße, flauschige Schicht (Bils) an der Schnittstelle von der Ficoll-Gradienten gesammelt. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Immunophänotyp von Gehirn-infilatrating Leukozyten bei 24 Stunden nach der Infektion. Maus Leukozyten wurden aus dem Gehirn durch Differential Dichtezentrifugation von Gewebehomogenaten von Tieren bei 24 Stunden nach der intrakraniellen Infektion vorbereitet isoliert. Die Zellen wurden mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörper gegen Maus CD45 gefärbt, Ly6C / G, CD11b und F4/80. Initial-Gating wurde durch Auftragen CD45, einem Marker für Immunzellen gegen Vorwärtsstreuung (FSC), ein Indikator für die Größe der Zellen (C) durchgeführt. Die CD45 hallo (A, D), CD45 lo (B, E) und CD45 neg (F, G) Populationen wurden dann für die relative Expression der Monozyten und Makrophagen Marker Ly6C / G, F4/80 (A, B analysiert , F) und CD11b (D, E, G). Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflammatorischen Monozyten wurden fast ausschließlich in der CD45 hallo Bevölkerung (A, D), im Einklang mit der Infiltration dieser Zellen aus der Peripherie. Im Gegensatz dazu waren Ly6C/G-F4/80 lo CD11b + Makrophagen fast ausschließlich in der CD45 lo (B, E) und CD45 neg (G) Populationen, im Einklang mit einem Wohnsitz Phänotyp gefunden. In zahlreichen Versuchen haben wir noch nie CD45 hallo Zellen oder Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflammatorischen Monozyten in das Gehirn der infizierten oder schein-Infektion beobachtetTed Mäusen (Daten nicht gezeigt).

<ol><li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picornaviruses+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li>
<li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li>
<li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropath.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li>
<li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li>
<li>Donovan, J., &amp, P. B. rown, , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+%26+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Handling & restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenteral+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li>
<li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li>
<li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
</ol>

Wir verwenden routinemäßig Durchflusszytometrie, um sowohl die Qualität des Gehirns infiltriert Zellpräparation zu bestimmen und verschiedene Populationen von Immunzellen 2, 9 zu unterscheiden. Bei akuten Zeit-Punkte, ergibt unsere Bils Methode ein hoher Prozentsatz der inflammatorischen Monozyten in der CD45hi Bevölkerung sowie ein hoher Prozentsatz der Makrophagen in der CD45lo Bevölkerung. Dies deutet darauf hin, dass eine reproduzierbare Immunantwort im Gehirn robust können mit unserer Methode charakteris...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> Howe Lab </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Daniel Stamm </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> Rundboden-Oak Ridge Zentrifugenröhrchen </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Roche </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus- </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau 0,4% (w / v) </td><td> Mediatech </td><td> 25 bis 900-CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konische Röhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 ml Glas Pyrex Marke Tenbroeck Gewebe grinder </td><td> Fischer </td><td> 08 bis 414-10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 um Zellsieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konischen </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21 bis 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS-Röhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Sigma </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 Hybridom </td><td> ATCC </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar V-Bodenplatte </td><td> Corning </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra X-22R Zentrifuge oder eine gleichwertige </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-Platte Eimer und Rotor </td><td> Beckman </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> Festwinkelrotor </td><td> Beckman </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7,5 </td><td> Baum Star, Inc. </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> Klon: 30-F11 </td></tr><tr><td> Gr1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> Klon: RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> Klon: M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> Klon: BM8 </td></tr></tbody></table>

isolierung von brain-infiltrierenden leukozyten

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung Gehirn infiltrieren Leukozyten (Bils) von Mäusen. Wir zeigen, wie man Mäuse mit Mäuse-Enzephalomyelitis Theiler ist Virus (TMEV) infizieren über eine schnelle intrakraniellen Injektionstechnik und wie man eine Leukocyten-angereicherte Population von infiltrierenden Zellen aus ganzen Gehirn zu reinigen. Kurz gesagt, werden die Mäuse mit Isofluran in einer geschlossenen Kammer und sind frei Hand injiziert mit einer Hamilton-Spritze in den frontalen Kortex. Mäuse werden dann zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion mit Isofluran Überdosierung und ganze Gehirn getötet werden extrahiert und in RPMI homogenisiert mit einem Tenbroeck Gewebe Mahlwerk. Hirnhomogenaten werden durch eine kontinuierliche 30% Percoll-Gradienten zentrifugiert, um das Myelin und andere Zelltrümmer zu entfernen. Die Zellsuspension wird dann bei 40 um angespannt, gewaschen und zentrifugiert auf eine diskontinuierliche Ficoll-Paque Plus-Gradienten zu wählen und reinigen die Leukozyten. Die Leukozyten werden dann gewaschen und in entsprechenden Puffern für Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie. Durchflusszytometrie zeigt eine Bevölkerung von angeborenen Immunzellen in den frühen Stadien der Infektion in C57BL / 6 Mäusen. Nach 24 Stunden nach der Infektion, werden mehrere Untergruppen von Immunzellen in der Bils, mit einer angereicherten Population von Gr1 +, CD11b + und F4/80 + Zellen. Daher ist diese Methode zur Charakterisierung der Immunantwort auf eine akute Infektion in das Gehirn.

Ein schnelles Verfahren zur Infiltration von Leukozyten aus dem murinen Gehirns zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode verwendet einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Ficollgradienten auszuwählen und zu reinigen, die Leukocyten-angereicherte Schicht. Isolierte Leukozyten kann dann durch durchflusszytometrische Messungen charakterisiert werden.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

Wir beschreiben eine Methode zur Gewinnung von hirninfiltrierenden Leukozyten (BILs) aus Mäusen. Wir demonstrieren, wie Mäuse mit dem Theiler-Murinen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine aus Leukozyten angereicherte Population angeborener Immunzellen aus dem Gehirn von Mäusen zu gewinnen, die akut mit dem Theiler-Virus (TMEV) infiziert wurden, das eine Enzephalomyelitis hervorruft. Dazu werden zunächst Mäuse intrazerebral mit TMEV infiziert. Anschließend wird das Gehirn 24 Stunden nach der Infektion entnommen und vorsichtig homogenisiert. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, mithilfe eines kontinuierlichen Percoll- und diskontinuierlichen Ficoll-Gradienten die leukocytenangereicherte Zellschicht selektiv zu reinigen. Letztendlich kann das Phänotyp der in das Gehirn eindringenden Leukozytenpopulation, die an der Immunantwort auf die akute Gehirninfektion beteiligt ist, mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Hallo, mein Name ist Dr. Charles Howe.Die Methode, die wir heute demonstrieren werden, kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neuroimmunologie zu beantworten. Zum Beispiel: Welche Immunzellen dringen während einer akuten Infektion in das Gehirn ein? Die Methode demonstriert heute Reagan, la France.Corey, ein leitender Forschungstechnologe in meinem Labor, um ins Gehirn eindringende Leukozyten hervorzurufen. Befestigen Sie eine 27-Gauge-Nadel an einer automatischen Hamilton-Spritze mit einem Volumen von einem Milliliter und stellen Sie die Spritze auf 10 Mikroliter ein. Ziehen Sie 10 Mikroliter DMEM, infiziert mit zwei mal 10 hoch fünf PFU des Daniel-Stamms von TMEV, oder 10 Mikroliter sham-infiziertes DMEM vorsichtig unter Beachtung von Luftblasen in die Spritze auf.Narkotisieren Sie eine fünf bis sechs Wochen alte Maus und überprüfen Sie die Sedierung durch Zehenquetschung während der Anästhesie. Bereiten Sie die Maus für die Injektion vor, indem Sie schnell die entsprechenden Koordinaten im frontalen Kortexbereich am Schädelteil lokalisieren, das Mausfell mit der Nadelspitze entlang beider AE so anordnen, dass die Injektion die Nadel senkrecht zum Schädel ausrichtet, und die Nadel bis zu einer Tiefe von etwa drei Millimetern durch die Knochenbedeckung drücken. Um das virusinfizierte DMEM oder das placebobehandelte DMEM in das Gehirn zu injizieren, drücken Sie den Knopf der Hamilton-Spritze nach unten und warten Sie zwei Sekunden, bis das Medium in das Gehirn eingedrungen ist, bevor Sie die Nadel zurückziehen.Entfernen Sie vorsichtig die Nadel und stellen Sie die Maus in einen sauberen, trockenen Käfig. Die Mäuse erwachen schnell aus der Anästhesie und nehmen innerhalb einer Minute nach intrazerebraler Virus- oder Scheininfektion nach 24 Stunden wieder normale Funktionen auf. Und vor der Isolierung der ins Gehirn eindringenden Leukozyten füllen Sie ein Rundboden-Oakridge-Zentrifugenröhrchen mit 10 Milliliter RPMI 1640 Milliliter pro Zelle und einem Milliliter 10 XPBS und lagern Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur.Bringen Sie das FI-Rufpack plus auf Raumtemperatur und füllen Sie ein 15-Milliliter-Konischgefäß mit fünf Milliliter RPMI, das Sie ebenfalls sofort auf Eis stellen. Nach der Tötung des Tieres durch eine modifizierte Isofluran-Überdosis entfernen Sie schnell das Gehirn und geben es in das 15-Milliliter-Konischgefäß, das die fünf Milliliter RPMI enthält. Überführen Sie anschließend das Gehirn und die RPMI-Lösung in einen sieben Milliliter fassenden Glas-Mörser der Marke Pyrex, Typ 10 Brook, und homogenisieren Sie das Gehirn vorsichtig mit 10 bis 15 Stößen.Pipettieren Sie anschließend weitere fünf Milliliter RPMI in den Homogenisator und pipettieren Sie die Lösung zweimal auf und ab. Überführen Sie die etwa 10 Milliliter des Gehirnhomogenats in die zuvor vorbereitete zentrifugierfähige Rundbodengefäßröhre und kippen Sie das Röhrchen vorsichtig zwei bis drei Mal, um es zu mischen. Zentrifugieren Sie das Gehirnhomogenat nun 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 7.800 × g in einer Zentrifuge mit feststehendem Winkelrotor.Nach der Zentrifugation entfernen Sie die Myelin-Trümmer, die an die Oberfläche der Gradientenlösung aufgestiegen sind. Die Leukozytenschicht schwimmt über dem Erythrozyten-Pellet. Filtern Sie die Leukozytenschicht durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konischglas.Bringen Sie die Lösung auf ein Volumen von 50 Milliliter. Mit unserem PMI zentrifugieren Sie das Röhrchen mit der verdünnten Zellsuspension in einer klinischen Zentrifuge bei 600 Gs für fünf Minuten. Aspirieren Sie bei Raumtemperatur den Überstand und sammeln Sie das Zellpellet.Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Fax-Puffer und geben Sie die Zellsuspension in eine fünf Milliliter fassende Rundboden-Fax-Röhre. Unterlagern Sie die Suspension vorsichtig mit einem Milliliter des Raumtemperatur-haltigen Fi-Call-Pack und zentrifugieren Sie die Fax-Röhren 25 Minuten lang bei 800&nbsp;G im Klinikzentrifugen. Entfernen Sie bei Raumtemperatur ohne Unterbrechung die weiße, flaumige Schicht an der Grenzfläche mit einer Ein-Milliliter-Pipette und überführen Sie die Schicht in ein neues Fünf-Milliliter-Faxröhrchen. Waschen Sie die Zellen mit vier Millilitern Faxpuffer. Zentrifugieren Sie nun das Röhrchen erneut im Klinikzentrifugen, um die Zellen zu pelletieren.Anschießend den Überstand abpipettieren und das Zellpellet sammeln. Das Leukozyten-Pellet in Blockierpuffer resuspendieren und auf Eis stellen. Anschließend die Zellen zählen.Nach der Isolierung und Zählung der ins Gehirn eingewanderten Leukozyten die Zellen in einer V-Boden-Platte für die Durchflusszytometrie zur Immunphänotypisierung auftragen. Anschließend die Zellen in einer klinischen Zentrifuge zentrifugieren.Suspendieren Sie das Pellet erneut in 200 Mikrolitern Blockpuffer und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten auf Eis. Fügen Sie anschließend Antikörper in einer Konzentration von 1 zu 200 hinzu und inkubieren Sie die Zellen weitere 30 Minuten auf Eis, diesmal im Dunkeln. Zentrifugieren Sie dann die gefärbten Zellen im Klinikzentrifugen und aspirieren Sie anschließend den Überstand.Fügen Sie 200 Mikroliter Fax-Puffer zum Pellet hinzu und pipettieren Sie vorsichtig dreimal auf und ab. Waschen Sie die Zellen anschließend im Zentrifugalmoment noch zweimal auf die gleiche Weise. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie die Zellen in einer Endkonzentration von 2 % Paraformaldehyd und überführen die gefärbten Zellen in Fax-Röhrchen. Geben Sie die fixierten Zellen abschließend zur Durchflusszytometrie und analysieren Sie die Dateien offline mithilfe eines Fax-Analyseprogramms.Maus-Leukozyten wurden aus dem Gehirn durch differentielle Dichtezentrifugation von Gewebeshomogenaten isoliert, die 24 Stunden nach intrakranieller Infektion aus Tieren gewonnen wurden. Wie in diesen beiden Dotplots zu sehen ist, fanden sich LY6C^G-positive, F4/80-positive, CD11b-positive inflammatorische Monocyten nahezu ausschließlich in der CD45^high-Population, was mit der Einwanderung dieser Zellen aus der Peripherie übereinstimmt. Im Gegensatz dazu wurden LY6C^G-negative, F4/80-low, CD11b-positive Makrophagen nahezu ausschließlich in den CD45^low-Populationen (linke beiden Felder) und der CD45-negativen Population (äußerstes rechtes Feld) nachgewiesen, was mit einem residenten Phänotyp vereinbar ist.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Leukozyten aus dem Gehirn akut infizierter Tiere gewinnt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video zeigen wir, wie man mononukleären Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis isolieren.

Isolierung von mononukleären Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten mit EAE

Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für den durchflusszytometrischen Analysen genutzt werden können.

Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

In diesem Video führen wir die Isolierung von mononukleären Zellen aus dem Gehirn einer Maus mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation durch. Die isolierte mononukleäre Zellsuspension kann für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Isolierung mononukleärer Zellen aus dem Gehirn von Mäusen: Eine Dichtegradienten-Zentrifugationstechnik zur Isolierung von im Gehirn ansässigen mononukleären Zellen

Das Video zeigt die Isolierung von tumorinfiltrierenden mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus einem Mäusegehirn durch mechanische Dissoziation und enzymatische Verdauung. Daran schließt sich eine Dichtegradientenzentrifugation an, um die Immunzellen für die weitere Analyse zu sammeln.

Isolierung tumorinfiltrierender Immunzellen aus einem Gehirn von Mäusen

Verfahren zur Isolierung von adhärenten entzündliche Leukozyten aus dem Gehirn...

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

Gehirn Myeloidzellen Charakterisierung nach Schlaganfall kann durch Stereologie unter Verwendung des optischen Fraktionator Verfahren durchgeführt werden, oder durch eine durchflusszytometrische Analyse von Gehirn Leukozyten Suspensionen. Beide sind nützliche Techniken, um eine genaue phänotypische Unterscheidung der Haupt myeloischen Zellen-Untergruppen in der ischämischen Gehirn führen.

Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

Entzündung spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass es wie ein zweischneidiges Schwert wirkt, das frühe Hirnverletzungen verschlimmert, aber auch zur späteren Reparatur beiträgt. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn und ihre anschließende durchflusszytometrische Phänotypisierung.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

In dieser Arbeit werden zwei optimierte Protokolle für die Untersuchung von residenten und peripher abgeleiteten Immunzellen innerhalb des zentralen Nervensystems, einschließlich des Gehirns, des Rückenmarks und der Hirnhäute, vorgestellt. Jedes dieser Protokolle trägt dazu bei, die Funktion und Zusammensetzung der Zellen zu bestimmen, die diese Kompartimente unter stationären und entzündlichen Bedingungen besetzen.

Isolierung von Geweben des Zentralnervensystems und zugehörigen Hirnhäuten für die nachgeschaltete Analyse von Immunzellen

Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie und zwei verschiedene Gating-Strategien an isolierten perfundierten Mäusen Gehirn-Aderhautplexus; Dieses Protokoll identifiziert die wichtigsten Untergruppen von Immunzellen, die diese Gehirnstruktur bevölkern.

Isolierung und Charakterisierung der Immunzellen aus mikrodissektierten Maus-Aderhautplexus

Um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen, ist ein gängiger Ansatz die Analyse von Veränderungen in Immunzellen. Hier werden zwei einfache und effektive Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus murinem Hirngewebe und Schädelknochenmark bereitgestellt.

Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädel von Mäusen

Lernen Sie die Isolierung von Leukozyten aus dem Gehirn TMEV-infizierter Mäuse mittels Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Immunzellphänotypen durch Durchflusszytometrie.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

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