Aseptische Labortechnik: Volume Transfers mit serologischen Pipetten und Mikropipetten

Diese Demonstration stellt aseptische Laborverfahren bei Volumenübertragungen mit serologischen Pipetten und Mikropipettiergeräten am Laborarbeitsplatz vor. Arbeiten Sie innerhalb des sterilen Bereichs, der durch eine Bunsenbrennerflamme erzeugt wird. Wählen Sie das geeignete Volumenübertragungsinstrument für die jeweilige Anwendung aus.

Verwenden Sie sie anschließend sachgemäß, ohne ihre Sterilität zu beeinträchtigen, und halten Sie Kultur-Reagenzien und Materialien steril, indem Sie Flüssigkeiten präzise abpipettieren. Diese Verfahren sind entscheidend, um Kontaminationsquellen zu minimieren und Präzision bei grundlegenden Experimenten zu gewährleisten. Zu Beginn ist es schwierig, die Instrumente genau einzustellen und korrekt abzulesen sowie Bewegungen mit den Instrumenten und Laborgegenständen zu koordinieren, ohne die Sterilität der transferierten Flüssigkeiten zu gefährden.

Die Anwendung einer sterilen Technik im Labor ist unerlässlich für den experimentellen Erfolg bei der Arbeit mit lebenden Proben. Investieren Sie daher Zeit in das Erlernen dieser Verfahren, damit sie Ihnen zur zweiten Natur werden. Wenn Sie am Laborplatz arbeiten, wird Ihnen Dr. Chris Reddy, mein Laborleiter, die Protokolle demonstrieren. Waschen Sie die Hände stets gründlich mit antiseptischer Seife und warmem Wasser, bevor Sie mit irgendwelchen Laborarbeiten beginnen. Benetzen Sie die Hände zunächst mit fließendem warmem Wasser.

Anschließend Seife auftragen und kräftig und gründlich verteilen. Die Hände unter Bildung von Reibung an allen Flächen einschließlich Daumen, Fingerspitzenrücken, Handrücken und unter den Fingernägeln reiben. Danach gründlich abspülen, um restliche Seife zu entfernen, und mit aus einem Spender entnommenen Papiertüchern abtrocknen.

Schließlich mit einem frischen Papiertuch den Wasserhahn abstellen und den Arbeitsbereich der Laborbank freiräumen. Danach ein vorbefeuchtetes Desinfektionstuch aus dem Behälter entnehmen und die gesamte Fläche damit abwischen. Zulassen, dass das Desinfektionsmittel mit Hilfe eines Zündgeräts verdunstet.

Der Bunsenbrenner. Stellen Sie die Flamme so ein, dass der blaue Kegel in der Mitte sichtbar ist. Ordnen Sie alle für das Verfahren benötigten Materialien in der Nähe des sterilen Bereichs auf der Laborbank an.

Stellen Sie außerdem sicher, dass alle Materialien ordnungsgemäß beschriftet sind. Es gibt zahlreiche Varianten von Serologenpipetten, aus Kunststoff oder Glas, Einweg- oder Mehrwegpipetten, mit oder ohne Filter. Die verschiedenen Größen sind mit Kalibrierungen versehen, bei denen Stopfen als Barrieren gegen ein Überfüllen der Pipette fungieren.

Beachten Sie, dass serologische Pipetten ebenfalls auf zwei Arten kalibriert sind. TD-Pipetten, die mit Doppelringen an der Oberseite gekennzeichnet sind, sind so kalibriert, dass das Volumen der Spitze nicht abgegeben werden soll. Dies ist hier nicht dargestellt, aber die TC-Pipetten müssen ausgeblasen werden, da sie so kalibriert sind, dass das gesamte Volumen abgegeben wird. Verwenden Sie dazu eine aseptische Technik mit einer einzeln verpackten, sterilen Kunststoff-serologischen Pipette, beginnen Sie am verschlossenen Ende und lösen Sie vorsichtig das Papier ab.

Entfernen Sie nicht die gesamte Hülle. Schützen Sie stattdessen nur die Spitze des Pipettiergriffs und den oberen Teil der Pipette oberhalb der Eichmarkierungen, und befestigen Sie eine Pipettierhilfe wie einen Birnenbalg oder eine Pipettierpistole am oberen Ende der serologischen Pipette. Halten Sie die Pipettierhilfe mit einer Hand und ziehen Sie mit der anderen Hand die Papierhülle von der Kunststoffpipette ab.

Für Glasspipetten, die in Metallbehältern aufbewahrt werden, lockern Sie die Oberseite des Behälters und nehmen Sie die Kappe ab. Flämen Sie die offenen Enden von Kappe und Behälter ab. Legen Sie die Kappe dann seitlich auf die desinfizierte Arbeitsfläche. Halten Sie den Behälter horizontal und schütteln Sie ihn, sodass die Spitzen einer oder zwei Pipetten herausragen.

Etwa einen Zoll herausragen lassen. Legen Sie das Gefäß seitlich ab und entnehmen Sie eine Pipette, ohne die anderen Pipetten zu berühren. Achten Sie darauf, dass die untere Spitze der Pipette nicht mit den Händen oder nicht sterilen Oberflächen in Kontakt kommt.

Fahren Sie fort, indem Sie die Pipettierhilfe befestigen. Führen Sie danach das untere Drittel einer Glaspipette ein bis drei Sekunden lang durch die blaue Flamme des Bunsenbrenners. Entfernen Sie nun die Kappe der Flasche, die sterile Medien enthält.

Halten Sie es mit dem Ringfinger und der Handfläche der einen Hand, während Sie mit dem Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger derselben Hand das Pipettierhilfsmittel bedienen. Mit der anderen Hand halten Sie die Flasche in einem Winkel von 45 Grad und führen den Flaschenrand durch die Flamme des Bunsenbrenners. Setzen Sie die sterile Pipettenspitze in das Medium ein. Anschließend saugen Sie unter Verwendung des Pipettierhilfsmittels unter Kontrolle des Flusses anhand der Skalierungsmarkierungen auf.

Überwachen Sie das in die Pipette aufgenommene Volumen, um das Volumen genau ablesen zu können. Halten Sie die Pipette senkrecht und betrachten Sie den Flüssigkeitsmeniskus auf Augenhöhe genau von vorne. Führen Sie den Flaschenrand erneut durch die Flamme des Bunsenbrenners.

Dann verschließen Sie es. Stellen Sie die Mediumsflasche beiseite. Nehmen Sie dann ein steriles Röhrchen und arbeiten Sie aseptisch.

Entfernen Sie die Kappe wie zuvor beschrieben. Erstellen Sie ein steriles Feld, indem Sie den Rand des Reagenzglases abbrennen. Geben Sie das Medium mit der Pipette in das Reagenzglas ab, und kontrollieren Sie den Flüssigkeitsfluss, sodass es nicht spritzt.

Flammen Sie den Rand ab. Setzen Sie danach die Kappe erneut auf und stellen Sie das Röhrchen beiseite. Entfernen Sie nun die Pipettierhilfe, entsorgen Sie Plastikpipetten in einem dafür vorgesehenen Spitzenbehälter und tauchen Sie Glaspipetten in eine 10 %ige Bleichmittel-Lösung ein.

Ein Mikropipettierer ermöglicht präzises Messen und Dosieren geringer Volumina mit unterschiedlich großen Geräten für spezifische Volumenbereiche. Vorsterilisierte Röhrchen und Plastikspitzen. Verwenden Sie außerdem einen vorbefeuchteten Desinfektionstupfer, um die Mikropipettierer abzuwischen. Hinweis.

Der Volter zeigt drei Zahlen an, die in Bezug auf die Art der Mikropipette zu interpretieren sind, wobei die Genauigkeit sich nach der kleinsten Skaleneinteilung richtet. Markieren Sie beispielsweise, dass der P 20 für Volumina zwischen 2,0 und 20,0 Mikrolitern verwendet wird. Die obere Zahl in Schwarz steht für Zehntel von Mikrolitern.

Die zweite schwarze Zahl bezeichnet das Volumen in Mikrolitern. Die rote Zahl markiert Zehntel eines Mikroliters, sodass jeder Teilstrich einem Inkrement von 0,02 Mikrolitern entspricht. Drehen Sie zuerst den Einstellknopf, um das Dosierervolumen gemäß der Anzeige am numerischen Volter einzustellen.

Wenn Sie die Volumeneinstellung des Mikropipettiersystems verringern, drehen Sie das Daubenrad langsam bis zur gewünschten Skalenmarkierung herunter. Wenn Sie die Volumeneinstellung erhöhen, drehen Sie zunächst etwa ein Drittel einer Umdrehung über die gewünschte Skalenmarkierung hinaus. Danach drehen Sie das Daumenrad langsam zurück, um das gewünschte Volumen genau zu erreichen.

Verwenden Sie stets sterile, plastische Einwegspitzen. Befestigen Sie eine Spitze fest am Ende des Kolbens des Mikropipettiergeräts. Drücken Sie nach unten und drehen Sie leicht, um eine luftdichte Abdichtung sicherzustellen.

Halten Sie den Mikropipettierer in vertikaler Position. Beachten Sie, dass der Mikropipettierer drei Positionen hat: Ruheposition, erster Anschlag und zweiter Anschlag.

Drücken Sie die Drucktaste am Kolben von der Ruheposition bis zum ersten Anschlag, um Luft zu verdrängen, die dem eingestellten Volumen entspricht. Tauchen Sie nun die Spitze in die Flüssigkeit ein, während Sie die Drucktaste bis zum ersten Anschlag gedrückt halten. Lassen Sie die Drucktaste langsam los, um die Flüssigkeit in die Spitze aufzusaugen.

Wenn der Druckknopf die Ruheposition erreicht, warten Sie, bis die Flüssigkeit in die Spitze gezogen wurde. Entfernen Sie dann die Spitze von der Flüssigkeit. Überprüfen Sie visuell, wie weit die Flüssigkeit in die Spitze aufgestiegen ist, und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen befinden.

Bringen Sie die Spitze in einem Winkel von 10 bis 45 Grad an der Wand des Gefäßes an, das die Flüssigkeit aufnehmen soll. Drücken Sie nun langsam den Druckknopf am Kolben bis zum ersten Anschlag. Dadurch wird die Flüssigkeit ausgepresst.

Nach einer kurzen Pause drücken Sie den Druckknopf bis zum zweiten Anschlag, um verbleibende Flüssigkeit vollständig auszustoßen. Ziehen Sie die Pipettenspitze anschließend aus der Flüssigkeit und lassen Sie den Kolben in die Ausgangsposition zurückkehren. Entsorgen Sie die Spitzen schließlich im vorgesehenen Behälter für scharfe Abfälle, indem Sie die Auswurftaste am Mikropipettiergerät betätigen.

Schalten Sie zuerst den Brenner aus. Nachdem Sie alle Materialien und Reagenzien verstaut haben, wischen Sie die Außenflächen des LabWare mit einem Desinfektionstuch ab, bevor Sie sie an ihren Lagerplatz bringen. Anschließend entsorgen Sie kontaminiertes Glaswerk und gefährliche Abfälle in der dafür vorgesehenen Weise.

Reinigen Sie anschließend den gesamten Arbeitsbereich erneut und lassen Sie das Desinfektionsmittel verdunsten. Waschen Sie Ihre Hände abschließend gründlich mit antiseptischer Seife und warmem Wasser. Ohne eine sterile Technik können Kulturen verunreinigt werden und die Experimente verzögern.

Die sterile Übertragung von Flüssigkeiten mithilfe von serologischen Pipetten ist entscheidend für die Vermehrung reiner Bakterienkulturen wie dieser 25-Milliliter-E.-coli-Präparation. Außerdem ermöglichen serologische Pipetten die sterile Übertragung von Flüssigkeiten in sterile Reagenzgläser. Dieses Beispiel zeigt eine reine im Vergleich zu einer kontaminierten E.-coli-Kultur bei der punktgenauen Übertragung von Nährmedium in die Gläser.

Manchmal sind genaue Volumina erforderlich. In diesem Fall erfolgt offensichtlich eine ungenaue Übertragung des Mediums. Dieses Beispiel zeigt ein falsches übertragenes Puffervolumen.

Statt 12,5 Mikroliter abzugeben, pipettierte der Student 125 Mikroliter. Obwohl die Zahlen am Einstellrad identisch eingestellt waren, wurde der falsche Mikropipettierer für den Vorgang ausgewählt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie wissen, wie man eine sterile Technik bei routinemäßigen Laborverfahren anwendet, beispielsweise beim Übertragen von Lösungen und Kulturen mit serologischen Pipetten und Mikropipettierern, ohne deren Sterilität zu beeinträchtigen.

Das Ziel besteht darin, dass vorbeugende Verfahren wie das Flammen von Glas, Pipettenspitzen, Kulturröhrchen und Kolben sowie das Arbeiten innerhalb der Grenzen eines sterilen Bereichs am Laborarbeitsplatz bei jedem Experiment zur Gewohnheit werden. Es ist außerdem entscheidend, dass bei der Durchführung von Experimenten präzise und genaue Volumina gemessen und abgegeben werden. Das Erlernen der korrekten Anwendung dieser Volumenübertragungsinstrumente verbessert die Zuverlässigkeit der experimentellen Ergebnisse.