In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

Ziel dieses Verfahrens ist es, eine stabile in vivo Bildgebung im Rückenmark der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie durchzuführen. Dies wird erreicht, indem das Tier zunächst mit einer Betäubungsmischung betäubt wird, die einen gleichmäßigen und dennoch ruhigen Atemrhythmus erreicht. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Wirbelsäule auf der gewünschten Höhe freizulegen und dann eine Laminektomie durchzuführen, um das darunter liegende Rückenmark freizulegen, damit es in vivo abgebildet werden kann.

Der dritte Schritt besteht darin, das Tier auf das Wirbelsäulenstabilisierungsgerät zu setzen. Der letzte Schritt ist die Isolierung des freiliegenden Rückenmarkssegments. In Vorbereitung auf die in vivo-Bildgebung können schließlich Ergebnisse erzielt werden, die das dynamische Verhalten von Zellen und ihre Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen oder Strukturen im lebenden Rückenmark durch Zeitraffer-in-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie detailliert beschreiben.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber früheren Versuchen, das Rückenmark in vivo abzubilden, besteht darin, dass sie in vivo-Bildgebungsdaten erzeugt, die keine Nachbearbeitung erfordern und sofort ausgewertet und für weitere Analysen verwendet werden können. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung nach einer Rückenmarksverletzung oder -erkrankung, da sie es uns beispielsweise ermöglicht, das Fortschreiten der axonalen Degeneration oder Regeneration nach beispielsweise einer Verletzung neben einer Rückenmarksverletzung in Echtzeit zu untersuchen. Diese Technik kann verwendet werden, um das Fortschreiten entzündlicher oder neurodegenerativer Prozesse in Tiermodellen von Krankheiten wie Multipler Sklerose oder Amyotropher Lateralsklerose zu untersuchen, bei denen die Krankheitspathologie im Rückenmark ausgeprägt ist.

Beginnen Sie den Vorgang mit dem Wiegen des Tieres. Als nächstes betäuben Sie das Tier, indem Sie die Anästhesiemischung intraperitoneal injizieren. Führen Sie regelmäßiges Einklemmen der Zehen durch, um eine tiefe Anästhesie des Tieres während des gesamten Versuchs zu gewährleisten, und ergänzen Sie es mit der Hälfte der ursprünglichen Dosis des Anästhetikums, stündlich oder nach Bedarf.

Tragen Sie dann die künstliche Tränensalbe auf die Augen auf, um eine Austrocknung und Schädigung der Hornhaut zu verhindern. Schneiden Sie die Haare auf dem Rücken des Tieres mit einem Trimmgerät ab und rasieren Sie die restlichen Haare mit einer scharfen Klinge. Nachdem Sie den rasierten Bereich desinfiziert haben, legen Sie das Tier unter ein Mikroskop und beginnen Sie den Eingriff, indem Sie einen kleinen Längsschnitt etwa 1,5 Zentimeter über der gewünschten Wirbelsäulenhöhe vornehmen.

Legen Sie die Rückenmuskulatur frei, indem Sie das Unterhautbindegewebe vorsichtig zurückziehen. Trennen Sie dann vorsichtig die paravertebralen Muskeln von der Wirbelsäule auf der gewünschten Höhe. Machen Sie so wenig Schnitte wie möglich, um die Muskeln von beiden Seiten jedes Dornfortsatzes zu lösen.

Kratzen Sie anschließend die abgelösten Muskeln von der Laminatoberfläche ab. Verwenden Sie bei Bedarf einen Kauterisierer für kleine Gefäße, um kleinere Blutungen zu kontrollieren. Kratzen Sie weiter an den Muskeln, bis Sie das darunter liegende Laminat ausreichend freigelegt haben und Sie dasjenige, das Sie entfernen möchten, eindeutig identifizieren können.

Um die Eintrittsstellen für die Wirbelsäulenklemmen auf jeder Seite der Wirbelsäule vorzubereiten, führen Sie die Spitzen einer gebogenen Schere zwischen die paravertebralen Muskeln ein und verschieben Sie das Muskelgewebe vorsichtig, um vier Taschen zu schaffen, in die die Klemmen eingeführt werden. Heben Sie die Wirbelsäule mit der geraden Zahnzange an, um ein sicheres Einführen der gebogenen Schere mit stumpfer Spitze unter die Lamina zu ermöglichen, ohne das Rückenmark zu berühren. Führen Sie dann die Laminektomie durch, indem Sie den Knochen auf einer Seite langsam durchtrennen und dann auf der anderen Seite ein Wattestäbchen verwenden oder ein vorgeschnittenes, kleines, resorbierbares Gelschaum-Gelatineschwammstück neben den Schnitt legen, um kleinere Blutungen zu begrenzen.

Verwenden Sie danach die vorgewärmte sterile künstliche Gehirnmarksflüssigkeit, um das Gewebe zu waschen. Eine Wirbelsäulenstabilisierungsvorrichtung wurde speziell mit den Hauptkomponenten der komplexen Nagate STSA-Rückenmarksklemmen und dem Nagate MA six N Kopfhalteadapter entwickelt. Eine Grundplatte aus Edelstahl wurde hergestellt, um zwei Naga-Teile in einer Linie zu halten, so dass der Kopf des Tieres gestützt wird, während seine Wirbelsäule und sein Schwanz festgeklemmt werden.

Denken Sie daran, dass das gesamte Gerät unter die Mikroskoplinse auf einen abgesenkten Mikroskoptisch passen sollte, um das Tier zu stabilisieren. Legen Sie es zunächst auf ein Elevationspad auf der Grundplatte des Wirbelsäulenstabilisierungsgeräts. Nachdem Sie den Kopf im Kopfhalteadapter befestigt haben, platzieren Sie die Wirbelsäulenklemme des SDSA-Geräts entlang der vorderen hinteren Achse des Tieres in den vorbereiteten Taschen und flankieren Sie die Laminektomie.

Platzieren Sie die beiden Klemmen in einem Winkel von etwa 45 Grad relativ zur ROS-Cordalachse des Tieres, um genügend Platz für das Absenken der Wasserimmersionslinse über dem freiliegenden Rückenmark zu haben. Platzieren Sie dann die dritte Klemme an der Basis des Schwanzes, so dass der Körper des Tieres nach dem Entfernen des Elevationskissens im bildgebenden Experiment aufgehängt werden kann. Bauen Sie als Nächstes eine kleine Vertiefung aus Geldichtung um das freiliegende Rückenmark, um die Pflege des Rückenmarks in A CSF zu erleichtern.

Entfernen Sie dann das Elevationspad, wenn Sie bereit sind, mit der In-vivo-Bildgebung zu beginnen, bringen Sie das Stabilisierungsgerät in die vorgeheizte Mikroskopkammer und platzieren Sie es auf dem abgesenkten Mikroskoptisch. Stellen Sie sicher, dass die Laminektomie mit der Linse ausgerichtet ist. Senken Sie die Wasserimmersionslinse vorsichtig in die A-Liquor-Lösung und achten Sie darauf, dass sie weder die Wirbelsäulenklemmen noch die Geldichtung berührt.

Verwenden Sie Epi-Fluoreszenz, um den interessierenden Bereich zu identifizieren und anschließend darauf zu fokussieren. Wechseln Sie in den Laserscanning-Modus und führen Sie eine In-vivo-Bildgebung mit den entsprechenden Zwei-Photonen-Laseranregungs-, Wellenlängen-, dichroitischen und Bandpassfiltern für die im Bildgewebe vorhandenen Fluore durch. Entfernen Sie das Tier am Ende der bildgebenden Versuche aus der Wirbelsäulenstabilisierungsvorrichtung.

Wischen Sie die Geldichtung vorsichtig aus dem Bereich um die Laminektomie ab und reinigen Sie sie. Naven Sie die Rückenmuskulatur gut über die Laminektomie. Dann wird der Hautschnitt vernäht und mit Betadin abgestrichen, hier als Projektion von Zack-Bildern, wie sie in vivo benötigt wurden, und anschließend entlang der Z-Achse ohne Bildausrichtung projiziert.

Das Bild zeigt hochdichte GFP-positive Mikrogliazellen in grüner, geschlossener Nähe zu Blutgefäßen in Rot im Rückenmark. Hier ist ein Bild mit hoher Vergrößerung einer einzelnen Mikrogliazelle, die an der Wand eines Blutgefäßes befestigt ist, das im Detail einige ihrer Fortsätze zeigt, die sich um das Gefäß herum und andere in Richtung des Rückenmarksparenchyms erstrecken. Hier ist ein Beispiel für eine repetitive In-vivo-Bildgebung der gleichen YFP-markierten axonalen Segmente, wie sie in zwei verschiedenen Sitzungen im Rückenmark derselben YFPH-Linienmaus verschoben und erneut abgebildet wurden im Abstand von fünf Tagen. Dies ist ein weiteres Beispiel für repetitive Bildgebung, die dieselben Gefäßstrukturen und Mikrogliazellen zeigt, die an zwei aufeinanderfolgenden Tagen in vivo im Rückenmark abgebildet wurden.

Hier ist eine repräsentative Zeitraffersequenz, die in vivo aus dem Rückenmark gewonnen wurde. Diese Sequenz zeigt im Detail das dynamische Verhalten der feineren Prozesse von Mikrogliazellen in Grün und ihre Wechselwirkungen mit dem Gefäßsystem in Rot. Im Laufe der Zeit wurden die Rohbilder nur um Hintergrundrauschen, Helligkeit und Kontrast korrigiert, und der Zeitrafferfilm wurde erstellt, indem sequenziell Bildstapel ohne Bildausrichtung abgelehnt wurden.

Betrachtet man die australische Auswahl einzelner Ebenen, so durchlaufen die Blutgefäße einen ähnlichen Bereich von Z-Ebenen wie die Bilder von Mikroglia. Die Tiefe des Bildvolumens beträgt 38 Mikrometer. Dabei handelt es sich um eine Zeitraffersequenz, die die Stabilität des bildgebenden Verfahrens auf der Ebene einer einzelnen Z-Ebene zeigt.

Die schnelle Erfassung derselben einzelnen Z-Ebene im Rückenmark einer heterozygoten Maus mit CX mit drei, CR und GFP, die mit dem KXA-Mix anästhesiert und auf dem Wirbelsäulenstabilisierungsgerät platziert wurde, zeigt eine minimale Bildverschiebung zwischen aufeinanderfolgenden Bildern. Bemerkenswert ist, dass die Rate dieser Sequenz ein Bild pro Sekunde betrug, was schneller ist als die Atemfrequenz der Maus. Die geringe Restverdrängung ist wahrscheinlich auf den Herzschlag des Tieres zurückzuführen.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Anzahl der Schnitte auf ein Minimum zu beschränken und zu versuchen, kleinere Blutungen so schnell wie möglich zu begrenzen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit Hilfe von zwei Fotomikroskopien eine stabile In-vivo-Bildgebung im Netzkabel der Maus durchführen können.