Name: In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie die stabile In-vivo-Bildgebung des Mäuserückenmarks mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Diese Methode minimiert Bewegungsartefakte durch tiefe Anästhesie und ein spezielles Stabilisierungsgerät.

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Diese Arbeit wurde von der National Multiple Sclerosis Society unterstützt gewähren RG4595A1 / T auf DD und das NIH / NINDS gewährt NS051470, NS052189 und NS066361 zu KA Figuren und Filme angepasst und / oder nachgedruckt aus Davalos et al., J Neurosci Methods. 2008 Mär 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, mit Genehmigung von Elsevier.

1. Aufbau der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät <ol><li> Bestellen Sie die Narishige STS-A Compact Spinal Cord Klemmen und die Narishige MA-6N Head Holding-Adapter. </li><li> Individuelles Design und einen Edelstahl-Bodenplatte, die beiden Narishige Teile in Ausrichtung zu halten, so dass der Kopf des Tieres wird unterstützt, während die Wirbelsäule und Schwanz eingeklemmt sind. Denken Sie daran, dass das gesamte Gerät sollte unter dem Mikroskop-Objektiv in der Regel auf eine abgesenkte Mikroskoptisch fit. </li></ol> 2. Tierische Chirurgie <ol><li> Pre-heat dem Mikroskop Kammer mit einer Luftheizung Gerät und halten sie auf 37 ° C. </li><li> Wiegen Sie das Tier und stellen die Narkose-Mix mit 100 mg Ketamin, 15 mg Xylazin und 2,5 mg Acepromazin pro kg Körpergewicht, in 0,9% NaCl-Lösung unter sterilen Bedingungen verdünnt werden. </li><li> Anesthetize das Tier durch Injektion des Anästhetikums Mix (KXA) intraperitoneal. Regelmäßige Zeh kneifen sollte durchgeführt werden, um tiefe Narkose ganz sicher seindas Experiment. Supplement mit der Hälfte der ursprünglichen Dosis stündlich oder nach Bedarf. </li><li> Verwenden Sie ein kleines Tier Heizkissen zur thermischen Unterstützung während der Durchführung des chirurgischen Eingriffs. </li><li> Übernehmen künstliche Tränen Salbe über die Augen, um Hornhaut Austrocknung und Schäden zu vermeiden. </li><li> Shave dem Rücken des Tieres zunächst mit einem Besatz Gerät und dann mit einer scharfen Klinge vollständig zu entfernen Haare aus der Gegend um den Einschnitt. </li><li> Nehmen Sie rasierten Haaren und desinfizieren Sie die rasierte Haut Oberfläche mit einer Alkohol-Pad. </li><li> Führen Sie eine kleine (~ 1,5 cm) Längsschnitt der Haut über den gewünschten spinaler Ebene (Brustwirbel hier abgebildet). </li><li> Expose der Rückenmuskulatur durch vorsichtiges Zurückziehen des subkutanen Bindegewebes. </li><li> Sorgfältig trennen die paravertebralen Muskeln von der Wirbelsäule auf dem gewünschten Niveau. Führen Sie möglichst wenige Schnitte, um die Muskeln von beiden Seiten jeweils Dornfortsatz lösen und dann kratzen die abgelösten MuskelnWeg von der laminaren Oberfläche. </li><li> Wählen Sie die Lamina, die entfernt werden und bereiten den Standorten der Eintrag für die Wirbelsäulen-Klemmen auf jeder Seite der Wirbelsäule, sofort rostral und kaudal der Laminektomie. Sorgfältig verdrängen Muskelgewebe zu vier Taschen, in denen die Klammern eingefügt werden können. </li><li> Heben Sie die Wirbelsäule mit dem geraden Zahn-Spitze Pinzette sichere Einsetzen der gebogenen stumpfen Spitze Schere unter der Lamina ohne sie zu berühren das Rückenmark zu ermöglichen. Führen Sie die Laminektomie durch langsames Schneiden des Knochens auf der einen Seite und dann auf der anderen Seite. </li><li> Verwenden Sie ein Wattestäbchen oder legen vorgeschnitten kleinen Gelschaum resorbierbare Gelatineschwamm Stücke neben den Einschnitten auf kleinere Blutungen zu begrenzen. Mit einem kleinen Schiff cauterizer weitere Blutungen zu kontrollieren, wenn nötig. Verwenden Sie vorgewärmte sterile künstliche Liquor (ACSF), um Gewebe zu waschen. </li></ol> 3. Die Stabilisierung der Wirbelsäule und der Vorbereitung auf in-vivo-Bildgebung <ol><li> Plac e das Tier auf einer Anhöhe Pad auf der Grundplatte der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät und sichern den Kopf in den Kopf halten Adapter. </li><li> Legen Sie die Wirbelsäule Klemmen des STS-A-Gerät entlang der anterior-posterioren Achse des Tieres in die vorbereiteten Taschen flankierenden Laminektomie (Abbildung 1). Die beiden Klemmen sollten in einem Winkel von ~ 45 platziert werden ° gegenüber dem Tier rostro-kaudalen Achse, um genügend Platz für das Absenken eines Wasser Immersionslinse über die freiliegende Rückenmark (Abbildung 1) zu ermöglichen. </li><li> Setzen Sie die dritte Klammer der STS-A-Gerät an der Basis des Schwanzes so dem Körper des Tieres in der Luft kann nach Entfernen der Erhebung Pad für die Dauer der bildgebenden Untersuchungen (Abbildung 1) ausgesetzt werden. </li><li> Bauen Sie ein kleines und von Gelseal (Amersham Biosciences Corp) um den freigelegten Rückenmark zur Aufrechterhaltung des Rückenmarks in ACSF und das Eintauchen des Mikroskop-Objektiv in dieser Lösung in-vivo-Bildgebung zu erleichtern. </li></ol>jove_title "&gt; 4. In-vivo-Bildgebung der Maus Rückenmark mit Zwei-Photonen-Mikroskopie <ol><li> Übertragen Sie die Tiere auf der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät in den vorgeheizten Kammer für das Mikroskop und sichern Sie sie auf eine abgesenkte Mikroskoptisch Platzierung des Laminektomie direkt unter dem Objektiv (Abbildung 1). </li><li> Lower eine Wasser-Immersions-Objektiv vorsichtig in das ACSF-Lösung dafür sorgen, dass sie nicht berühren das Rückenmark Klammern oder Gelseal. </li><li> Verwenden Sie Epifluoreszenz, um den Bereich von Interesse zu identifizieren und sich auf sie. Switch to Laser-Scanning-Modus und führen in-vivo-Bildgebung mit den entsprechenden Zwei-Photonen-Laser-Anregungswellenlänge dichroics und Bandpass-Filter für die Fluorophore in dem abgebildeten Gewebe. </li></ol> 5. Repetitive Bildgebung und post-operative Betreuung <ol><li> Am Ende der bildgebenden Untersuchungen, entfernen Sie die Maus aus dem Rückenmark Stabilisierung Gerät und wischen die Gelseal aus der Gegend um die Laminektomie.Reinigen Sie den Bereich gut. </li><li> Wiederherstellen und Naht der Rückenmuskulatur über die Laminektomie. </li><li> Wiederherstellen und Naht der Haut über der Laminektomie, Tupfer mit betadine. </li><li> Geben Sie 1 ml Ringer-Laktat-Lösung (Baxter Healthcare) als Nährstoff-und Flüssigkeitszufuhr zu ergänzen, sowie analgetische Behandlung subkutan (0,1 mg / kg Buprenorphin). </li><li> Verwalten antiseptische Behandlung intraperitoneal (0,03 ml pro Maus, 2,27% Enrofloxacin injizierbaren antibakteriellen Lösung). </li><li> Legen Tier auf einem Heizkissen bis zur vollständigen Erholung aus der Narkose und anschließend Haus ist individuell. </li><li> Wiederholen Sie die antiseptische Verwaltung täglich für die ersten 3-5 Tage nach der Operation und analgetische Behandlung alle 8-12 Stunden für 2-3 Tage nach der Operation. Monitor Tier täglich zum normalen Verhalten und vollständige Genesung zu gewährleisten. </li><li> Für Re-Imaging durch die gleiche Laminektomie, öffnen Sie die Naht der Haut und Muskeln und wiederholen Sie die Schritte in den Abschnitten 2 - 4 beschrieben. </li><li> Re-locate dem Vorjahrously abgebildeten Bereich durch das Blut Blutgefäße als eine Karte, wie oben beschrieben 10. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Alle tierischen Verfahren wurden nach den Richtlinien von institutionellen Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der University of California, San Francisco Set durchgeführt und sind in Übereinstimmung mit behördlichen Vorschriften. Ein Bild der spinalen Stabilisierung Gerät und eine schematische Darstellung der Positionierung der Maus auf dem Gerät unter einem Mikroskop-Objektiv ist in Abbildung 1 dargestellt. Unter Berücksichtigung adäquater Raum zum Atmen Bewegungen unter dem Körper des Tieres gewährleistet in-vivo-Bildgebung im Rückenmark stabil. Abbildung 2 zeigt die enge Beziehung zwischen Mikroglia und das Gefäßsystem, wie es war in vivo in das Rückenmark von CX3CR1 GFP / + transgenen Mäusen 18 abgebildet, in die Mikrogliazellen sind endogen mit GFP-markierten. Abbildung 3 zeigt Beispiele für repetitivein-vivo-Bildgebung, wie sie in der gleichen Rückenmarks Bereiche in Mäusen, die ein fluoreszierendes Protein in der Wirbelsäule Axone (YFP-H-Linie 3) und Mikroglia (in der CX3CR1 GFP / + Mäusen) durchgeführt wurde. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Stabilisierung der Maus Wirbelsäule in-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. (A) Eine maßgeschneiderte Grundplatte aus Stahl wird verwendet, um die Unterstützung und Ausrichtung der STS-A Narishige kompakte Rückenmark Schraubzwingen und MA-6N Narishige Kopf hält Adapter wie hier gezeigt. (B) Die richtige Positionierung der erwachsenen transgenen Mäuse betäubt mit einer KXA Narkose an der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät. Der Einschub zeigt die Platzierung der Wirbelsäule Klammern unmittelbar rostral und kaudal auf die Laminektomie und die freigelegten Rückenmark. &lt;img alt = "Bild 2" src = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" /&gt; Abbildung 2. In-vivo-Bildgebung mit hoher Dichte Mikroglia-Zellen und Blutgefäßen in das Rückenmark von narkotisierten Mäusen. Projizierte aber blockfreien z-Stapel (A) sehr dicht GFP-positive Mikroglia (grün) in das Rückenmark eines CX3CR1 GFP / + Maus in der Nähe von Blutgefäßen (rot, beschriftet mit iv-Injektion von Rhodamin Dextran). (B) Hohe Vergrößerung Bild wie in (A) aus einem einzigen Mikrogliazellen an der Wand eines Blutgefäßes mit Prozessen rund um das Schiff verlängert und in Richtung des Rückenmarks Parenchym bezeichnet. Scale-Bars, 10 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Repetitive in-vivo-Bildgebung des gleichen axonalen Segmenten und Mikroglia, wie sie verlegt wurden und reimaged in das Rückenmark von anästhesierten Mäusen an verschiedenen Tagen. (A) YFP-lab ELED Axone an den Tagen 0 und 5. (B). Das gleiche vaskuläre Strukturen und Mikroglia-Zellen um sie herum abgebildet in vivo in das Rückenmark von CX3CR1 GFP / + Mäusen an den Tagen 0 und 1. Scale-Bars, 10 um. Movie 1. Representative Zeitraffer-Sequenz in vivo von der Maus Rückenmark erworben. Diese Sequenz zeigt im Detail fein Mikroglia Prozessdynamik (grün) und ihre Wechselwirkungen mit dem Gefäßsystem (rot, beschriftet mit iv-Injektion von Rhodamin Dextran) im Laufe der Zeit innerhalb eines Gewebes dicht mit fluoreszierender Strukturen besiedelt. Die RAW-Bilder waren nur für Hintergrundgeräusche, Helligkeit und Kontrast korrigiert und die Zeitraffer Film wurde von z-Projektion nacheinander erworben Bildstapeln gebaut, ohne Bildausrichtung, durchschnittlich oder z-Auswahl der einzelnen Ebenen. Blutgefäße durchlaufen eine ähnliche Reihe von z Ebenen wie die Bilder von Mikroglia. Z-Ebene Tiefe: 38 um.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "&gt; Klicken Sie hier, um den Film zu sehen. Movie 2. Timelapse-Sequenz zeigt die rohe Stabilität der bildgebenden Verfahren auf der Ebene eines einzelnen z-Ebene. Schnelle Erfassung der gleichen einfachen z-Ebene in das Rückenmark von CX3CR1 GFP / + Mäuse an der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät unter KXA Narkose gelegt, zeigt minimal image Verschiebung zwischen aufeinander folgenden Frames bei einer Abtastrate von 1 Bild / s, die schneller ist als die Atemfrequenz der Maus. Der kleine Rest-Verschiebung ist wahrscheinlich auf Herzschlag. <a alt="Movie 2" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.</a>

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<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li>
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<li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht einen stabilen und repetitive in vivo Bildgebung von dicht besiedelten fluoreszierende zellulären Strukturen in das Rückenmark von anästhesierten Mäusen mit zwei-Photonen-Mikroskopie. Die erreichte Stabilität ist das Ergebnis einer maßgeschneiderten Wirbelsäulenstabilisierung Gerät und ein Anästhetikum Regime, Atemwegs-induzierte Bewegung Artefakt reduziert. Die Wirbelsäule Stabilisierung Gerät ermöglicht Atempause der Unterseite der Maus Körper und kann mithilfe von kom...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Rhodamin B Dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 kDa, verdünnt in ACSF (3% w / v) </td></tr><tr><td> Ketamin HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC No: 67457-001-10 </td><td> Injizierbare, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Labs </td><td> NADA No: 139-236 </td><td> Xylazin injizierbare, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> NADA No: 117-531 </td><td> Injizierbare, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Künstliche Tränen Salbe </td><td> Phönix Pharma- </td><td> NDC No: 57319-760 - 25 </td><td> Schmiermittel </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Fischer </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson-Westcott Schere </td><td> World Precision Instruments </td><td> 555500S </td><td> Gebogen, stumpf-Spitze Schere </td></tr><tr><td> Gerade Pinzette </td><td> World Precision Instruments </td><td> 555047FT </td><td> Zahnriemen Spitze Pinzette </td></tr><tr><td> Kleine Schiffe cauterize </td><td> Feine Science Tools </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, Pfizer Inc. </td><td> Schwingmühle MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Compact Rückenmark Klemmen </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Head Holding-Adapter </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Laktat- </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. </td><td> NDC No: 12496 - 6757-1 </td><td> Buprenorphin, injizierbare </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> NADA 140-913 </td><td> Enrofloxacin, antibakterielle injizierbaren 2,27% (20ml) </td></tr><tr><td> Heizkissen - Large </td><td> Feine Science Tools </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

in-vivo-imaging von der maus spinal cord mit zwei-photonen-mikroskopie

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie 1 in Mäusen, die gentechnisch verändert wurden, um fluoreszierende Proteine ​​in bestimmten Zelltypen 2-3 hat unsere Kenntnis der physiologischen und pathologischen Prozessen in zahlreichen Geweben in vivo 4-7 erweitert auszudrücken. In Studien des zentralen Nervensystems (ZNS), hat es eine breite Anwendung der in-vivo-Bildgebung des Gehirns, die eine Vielzahl von neuartigen und oft unerwartete Erkenntnisse über das Verhalten der Zellen wie Neuronen, Astrozyten, Mikroglia unter produziert wurde physiologische oder pathologische Zustände 8-17. Allerdings haben vor allem die technischen Komplikationen der Umsetzung der in-vivo-Bildgebung in Studien der lebenden Maus Rückenmark beschränkt. Insbesondere erzeugt die anatomische Nähe des Rückenmarks in die Lunge und das Herz signifikante Bewegung Artefakt, das zur Bildgebung im lebenden Rückenmark eine anspruchsvolle Aufgabe macht. </p&gt; Wir entwickelten eine neuartige Methode, die die inhärenten Grenzen des Rückenmarks Bildgebung überwindet durch die Stabilisierung der Wirbelsäule, wodurch der Atemwege-induzierte Bewegungen und damit die Erleichterung der Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Abbildung der Maus Rückenmark in vivo. Dies ist durch die Kombination eines maßgeschneiderten Wirbelsäulenstabilisierung Gerät mit einer Methode der tiefen Narkose, was zu einer signifikanten Reduktion von Atemwegs-induzierte Bewegungen erreicht. Dieses Video-Protokoll zeigt, wie man einen kleinen Bereich des Lebendigen Rückenmarks, die unter physiologischen Bedingungen stabil über längere Zeiträume hinweg, indem sie Gewebeschäden und Blutungen auf ein Minimum gehalten werden kann aussetzen. Vertreter von RAW-Bildern erworben in vivo Details in hoher Auflösung die enge Beziehung zwischen Mikroglia und das Gefäßsystem. Ein Zeitraffer-Sequenz zeigt das dynamische Verhalten von Mikroglia-Prozesse in der lebenden Maus Rückenmark. Darüber hinaus zeigen einen kontinuierlichen Scan der gleichen z-frames die herausragende Stabilität, die dieser Methode erreichen können, um Stapel von Bildern und / oder Zeitraffer-Filme, die keine Bildausrichtung nach dem Erwerb zu generieren. Schließlich zeigen wir, wie diese Methode verwendet werden, um erneut und reimage der gleichen Gegend des Rückenmarks zu späteren Zeitpunkten werden, so dass für Längsschnittstudien der laufenden physiologische oder pathologische Prozesse in vivo.

Ein minimal-invasiven Protokoll, um die Maus Wirbelsäule zu stabilisieren und sich wiederholende<em&gt; In vivo</em&gt; Rückenmarks Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ist beschrieben. Diese Methode verbindet eine Wirbelsäulen-Stabilisierung Gerät und ein Anästhetikum Regime die Atmungsorgane-induzierte Bewegungen zu minimieren und produzieren Rohstoffe Bilddaten, die keine Ausrichtung oder andere Nachbearbeitung erfordern.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

Die In-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie 1 bei Mäusen, die genetisch so verändert wurden, dass sie fluoreszierende Proteine in spezifischen Zelltypen exprimieren 2-3, hat ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine stabile In-vivo-Bildgebung im Maus-Rückenmark mithilfe der Zweiphotonenmikroskopie durchzuführen. Dies wird erreicht, indem das Tier zunächst mit einer Anästhetikamischung anästhesiert wird, die einen gleichmäßigen, aber ruhigen Atemrhythmus bewirkt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Wirbelsäule auf der gewünschten Ebene freizulegen und anschließend eine Laminektomie durchzuführen, um das darunterliegende Rückenmark freizulegen, sodass es in vivo abgebildet werden kann.Der dritte Schritt besteht darin, das Tier auf die Wirbelsäulen-Stabilisierungsvorrichtung zu legen. Der letzte Schritt ist die Isolierung des freigelegten Rückenmarkssegments. Zur Vorbereitung der In-vivo-Bildgebung können schließlich Ergebnisse erzielt werden, die das dynamische Verhalten von Zellen und ihre Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen oder Strukturen im lebenden Rückenmark im Zeitraffer mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie detailliert darlegen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber früheren Versuchen, das Rückenmark in vivo abzubilden, liegt darin, dass sie Rohdaten für die in-vivo-Bildgebung erzeugt, die keiner Nachbearbeitung bedürfen und sofort ausgewertet sowie für weitere Analysen genutzt werden können. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie nach Rückenmarksverletzung oder -erkrankung, da sie beispielsweise die Untersuchung des Fortschritts der axonalen Degeneration oder Regeneration nach einer Verletzung in Echtzeit ermöglicht. Neben der Rückenmarksverletzung kann diese Technik auch zur Untersuchung des Verlaufs entzündlicher oder neurodegenerativer Prozesse in Tiermodellen von Erkrankungen wie multipler Sklerose oder amyotropher Lateralsklerose eingesetzt werden, bei denen die Krankheitspathologie im Rückenmark deutlich hervortritt.Beginnen Sie das Verfahren mit dem Wiegen des Tieres. Betäuben Sie anschließend das Tier durch intraperitoneale Injektion des Anästhetikumgemischs. Führen Sie regelmäßig Zehenquetschungen durch, um eine tiefe Anästhesie des Tieres während des gesamten Experiments sicherzustellen, und verabreichen Sie stündlich oder nach Bedarf eine halbe Dosis des ursprünglichen Anästhetikums als Nachschub.Tragen Sie dann die künstliche Tränen-Salbe auf die Augen auf, um eine Hornhautaustrocknung und -schädigung zu verhindern. Schneiden Sie die Haare am Rücken des Tieres mit einem Schergerät zurecht und rasieren Sie die verbleibenden Haare mit einer scharfen Klinge ab. Nach der Desinfektion des rasierten Bereichs platzieren Sie das Tier unter ein Mikroskop und beginnen das Verfahren, indem Sie eine kleine longitudinale Inzision von etwa 1,5 Zentimetern über der gewünschten spinalen Ebene anlegen.Legen Sie die Rückenmuskulatur frei, indem Sie das subkutane Bindegewebe vorsichtig zurückziehen. Trennen Sie dann die paravertebralen Muskeln vorsichtig auf der gewünschten Ebene von der Wirbelsäule ab. Führen Sie so wenige Einschnitte wie möglich durch, um die Muskeln von beiden Seiten jedes Dornfortsatzes zu lösen.Entfernen Sie anschließend die abgelösten Muskeln von der Laminatoberfläche. Verwenden Sie bei Bedarf einen kleinen Gefäßkoagulator, um geringfügige Blutungen zu kontrollieren. Setzen Sie das Abkratzen der Muskeln fort, bis das darunterliegende Laminat ausreichend freigelegt ist und Sie dasjenige deutlich erkennen können, das Sie entfernen werden.Um die Einstellstellen für die Wirbelsäulenklammern auf jeder Seite der Wirbelsäule vorzubereiten, führen Sie die Spitzen eines Paars gekrümmter Scheren zwischen die paravertebralen Muskeln ein und verschieben vorsichtig das Muskelgewebe, um vier Taschen zu bilden, in die die Klammern eingesetzt werden. Heben Sie die Wirbelsäule mit der geraden Zahnspitzzange an, um ein sicheres Einführen der gekrümmten stumpfen Schere unter die Lamina zu ermöglichen, ohne das Rückenmark zu berühren. Führen Sie dann die Laminektomie durch, indem Sie langsam das Knochengewebe zuerst auf einer Seite und anschließend auf der anderen Seite durchtrennen. Verwenden Sie einen Wattestäbchen oder platzieren Sie ein vorgeschnittenes kleines Stück resorbierbaren Gelatineschwamms neben dem Schnitt, um geringe Blutungen einzuschränken.Anschließend das Gewebe mit vorgewärmter steriler künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit spülen. Eine Vorrichtung zur Wirbelsäulenstabilisierung wurde speziell konstruiert und besteht hauptsächlich aus den Nagate STSA-Komplex-Klammern für das Rückenmark und dem Nagate MA six N Kopfhalteadapter. Eine Edelstahl-Grundplatte wurde angefertigt, um zwei Naga-Bauteile ausgerichtet zu halten, sodass der Kopf des Tieres gestützt wird, während Wirbelsäule und Schwanz fixiert sind.Beachten Sie, dass das gesamte Gerät unterhalb der Mikroskoplinse auf einem abgesenkten Mikroskoptisch Platz finden muss, um das Tier zu stabilisieren. Stellen Sie es zunächst auf ein Höhenausgleichs-Pad auf der Grundplatte der Wirbelsäulen-Stabilisierungsvorrichtung. Nachdem der Kopf im Kopfhalte-Adapter befestigt wurde, platzieren Sie die Wirbelsäulenklammer der SDSA-Vorrichtung entlang der anteroposterioren Achse des Tieres in den vorbereiteten Taschen, die die Laminektomie flankieren.Platzieren Sie die beiden Klammern in einem Winkel von etwa 45 Grad zur ROS-Kordelachse des Tieres, um ausreichend Platz für das Absenken des Wassereintauchobjektivs über das exponierte Rückenmark zu schaffen. Danach platzieren Sie die dritte Klammer an der Basis des Schwanzes, sodass der Körper des Tieres nach dem Entfernen des Anhebepolsters im Bildgebungsversuch aufgehängt werden kann. Bauen Sie anschließend einen kleinen Gelring um das exponierte Rückenmark herum, um die Aufrechterhaltung des Rückenmarks in aCSF zu erleichtern.Entfernen Sie dann das Höhenausgleichskissen, sobald Sie bereit sind, mit der In-vivo-Bildgebung zu beginnen. Bringen Sie die Stabilisierungsvorrichtung in die vorgewärmte Mikroskopkammer und platzieren Sie sie auf dem abgesenkten Mikroskoptisch. Achten Sie darauf, die Laminektomie mit der Linse auszurichten. Senken Sie die Wassereintauchlinse vorsichtig in die ACSF-Lösung ab und stellen Sie sicher, dass sie die Wirbelsäulenklammern oder die Gelabdichtung nicht berührt.Verwenden Sie die Epi-Fluoreszenz, um den interessierenden Bereich zu identifizieren, und fokussieren Sie anschließend darauf. Wechseln Sie in den Laserscanning-Modus und führen Sie die In-vivo-Bildgebung mit der geeigneten Zwei-Photonen-Laseranregung, Wellenlänge, Dichroika und Bandpassfiltern für die im Gewebe vorhandenen Fluorophore durch. Am Ende der Bildgebungsexperimente entfernen Sie das Tier aus der spinalen Stabilisierungsvorrichtung.Wischen Sie vorsichtig die Gelversiegelung von der Region um die Laminektomie herum ab und reinigen Sie die Fläche. Nähen Sie die Rückenmuskulatur sorgfältig über der Laminektomie. Anschließend nähen Sie den Hautschnitt und tupfen ihn mit Betadine ab, hier dargestellt als Projektion von Zack-Bildern, wie sie in vivo erforderlich waren und anschließend entlang der Z-Achse ohne Bildregistrierung projiziert wurden.Das Bild zeigt stark dichte, grün markierte, GFP-positive Mikrogliazellen in unmittelbarer Nähe zu roten Blutgefäßen im Rückenmark. Hier sehen Sie eine Aufnahme mit hoher Vergrößerung einer einzelnen Mikrogliazelle, die an der Wand eines Blutgefäßes anhaftet und deren Fortsätze detailliert um das Gefäß herum sowie teilweise in Richtung des Rückenmarkparenchyms ausgestreckt sind. Dies ist ein Beispiel für wiederholte in-vivo-Bildgebung derselben, mit YFP markierten axonalen Abschnitte, die im Rückenmark derselben Maus der YFPH-Linie an zwei verschiedenen Terminen mit einem Abstand von fünf Tagen erneut lokalisiert und abgebildet wurden. Ein weiteres Beispiel für die wiederholte Bildgebung zeigt dieselben vaskulären Strukturen und Mikrogliazellen, die im Rückenmark an zwei aufeinanderfolgenden Tagen in vivo abgebildet wurden.Hier ist eine repräsentative Zeitrafferaufnahme, die in vivo aus dem Rückenmark gewonnen wurde. Diese Aufnahme zeigt detailliert das dynamische Verhalten der feineren Fortsätze von Mikrogliazellen in Grün und deren Wechselwirkungen mit der Gefäßstruktur in Rot. Im Zeitverlauf wurden die Rohbilder lediglich zur Korrektur von Hintergrundrauschen, Helligkeit und Kontrast bearbeitet, und der Zeitrafferfilm wurde durch sequenzielles Verwerfen von Bildstapeln ohne Bildregistrierung erstellt.Bei der Durchschnittsbildung der australischen Auswahl einzelner Ebenen durchlaufen Blutgefäße einen ähnlichen Bereich an Z-Ebenen wie die Aufnahmen der Mikroglia. Die Tiefe des Bildvolumens beträgt 38 Mikrometer. Dies ist eine Zeitrafferaufnahme, die die Stabilität der Abbildungsmethode auf der Ebene einer einzelnen Z-Ebene zeigt.Schnelle Aufnahme derselben einzelnen Z-Ebene im Rückenmark einer CX drei, CR eins GFP heterozygoten Maus, die mit der KXA-Mischung anästhesiert und auf der spinalen Stabilisierungsvorrichtung platziert wurde, zeigt minimale Bildverschiebungen zwischen aufeinanderfolgenden Einzelbildern. Bemerkenswerterweise betrug die Aufnahmegeschwindigkeit dieser Sequenz ein Bild pro Sekunde, was schneller ist als die Atemfrequenz der Maus. Die geringfügigen verbleibenden Verschiebungen sind wahrscheinlich auf den Herzschlag des Tieres zurückzuführen.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Anzahl der Inzisionen auf ein Minimum zu beschränken und jegliche geringfügige Blutung sofort nach ihrem Auftreten zu begrenzen. Nachdem Sie sich nun dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine stabile In-vivo-Bildgebung im Mausmuskel mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie durchführt.

in-vivo-imaging-of-the-mouse-spinal-cord-using-two-photon-microscopy

Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Source: Nishimura, C. et al. Quantifizierung der zerebralen Gefäßarchitektur mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation. J. Vis. (2016). Dieses Video zeigt die In-vivo-Visualisierung von kortikalen Kapillaren im Gehirn von Mäusen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Es beschreibt die Schritte zur Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in eine anästhesierte Maus mit einem dünnschädeligen kortikalen Fenster, zur Vorbereitung des Aufbaus für die...

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