Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hämozyten aus Mücken zu gewinnen und anzufärben. Dies wird erreicht, indem zunächst eine kleine Menge Antikoagulansverdünnung in gekühlte Mücken injiziert wird, um die Hämozyten freizusetzen und sämtliche Hämozyten in Lösung zu bringen.

Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Beine, Flügel und die Abdomenspitze des Moskitos zu entfernen. Drittens wird frisches Verdünnungsmittel an einer separaten Stelle des Moskitos injiziert, um den Perfusionsprozess einzuleiten. Der letzte Schritt besteht darin, das verdünnte Hämolymphe auf einen vorbereiteten Objektträger zu leiten, sodass die gesammelten Hämozyten fixiert und gefärbt werden können.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die mithilfe einfacher Gleitmikroskopie die wichtigsten Typen und die Anzahl der Hämolysestellen in der betreffenden Mückenspezies aufzeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Profusion besteht darin, dass sie die Einfachheit der Profusion mit der Genauigkeit hochinjizierender Methoden verbindet, jedoch mit weniger Schritten bis zum endgültigen Ziel. Unser Ziel ist es, die Typen von Hämocyten sowie deren Häufigkeit als Reaktion auf immunologische Herausforderungen zu identifizieren.

Die Durchführung dieser Technik zeigt Amina Abdul Kum, eine Studentin aus meinem Labor. Bevor Sie mit dem Protokoll beginnen, bereiten Sie die Hämolymphe-Verdünnungslösung in Aliquots zu je einem Milliliter vor. Lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius und frieren Sie nicht verwendete Anteile eines Aliquots nicht erneut ein.

Zeichnen Sie nun auf einen Millimeter dicken Objektträgern Kreise mit einem Zentimeter Durchmesser ein. Pro Moskito wird ein Objektträger benötigt. Bereiten Sie gezogene Nadeln vor.

Zerbrechen Sie die Spitze jeder gezogenen Nadel, um eine Öffnung für die Nadel zu schaffen. Befestigen Sie eine Nadel in ihrem Halter, der mit den Schlauch- und Spritzenteilen eines Mikroinjektors verbunden ist. Entfernen Sie anschließend Luftblasen aus der Schlauch- und Nadelhalteranordnung mit Mineralöl.

Sie ziehen Mineralöl in diese manuelle Spritze auf und achten darauf, dass sich keine Blasen bilden. Unter der Nadel platzieren Sie etwas, um tropfendes Öl aufzufangen. Öffnen Sie diesen Teil des Mikroinjektors und füllen Sie hier Öl ein, um eventuelle Blasen zu entfernen.

Und dies wird einfach genauso wie bei der anderen Spitze an die manuelle Spritze angeklickt. Injizieren Sie langsam das Mineralöl, sodass es durch die Kunststoffschläuche fließt und eventuelle vorhandene Luftblasen verdrängt werden. Füllen Sie dann erneut die Öffnung so weit mit Mineralöl auf, dass es überläuft.

Dann schließen Sie dies wieder an diese Glasspritze an, um Blasenbildung zu vermeiden. Füllen Sie anschließend die zusammengesetzten Komponenten mit Mineralöl auf, bis sämtliche Nadelschläuche und die Spritze vollständig gefüllt sind. Der Mikroinjektor ist nun betriebsbereit für die Applikation des Verdünnungsmittels.

Bereiten Sie als Nächstes die Tiere vor, indem Sie 15 adulte Weibchen in einen kleinen, festen Käfigbehälter aspirations, der vollständig in Eis eingetaucht wird. Die Mücken werden anästhesiert, wenn sie durch die Kälte immobilisiert sind, was normalerweise acht Minuten oder weniger dauert. Platziert eine einzelne anästhesierte Mücke auf einen Vertiefungsträger, wo die Mikroinjektion stattfinden wird.

Am Mikroskop 12 Mikroliter Hämolymphe-Verdünnungslösung in den Mikroinjektor aufnehmen. Die Mücke unter dem Mikroskop vorsichtig mit einer Pinzette fixieren und drei bis 3,5 Mikroliter der Verdünnungslösung injizieren. Zwischen dem siebten und achten Bauchsegment wird sich der Hinterleib aufblähen.

Während das Verdünnungsmittel injiziert wird, können drei Mücken injiziert werden. Bevor der Mikroinjektor erneut geladen wird, legen Sie alle injizierten Mücken in einen sauberen Plastikbecher auf Eis, in dem sich die Mücken etwa fünf Minuten lang erholen. Während der Inkubation löst das Antikoagulans-Verdünnungsmittel Hämocyten von den inneren Geweben ab.

Während die erste Charge von Tieren während der Inkubation erholt, können in der Regel weitere drei bis fünf Mücken injiziert werden. Bereiten Sie die injizierten Mücken nach den fünf Minuten, während sie sich noch im Becher befinden, vor, indem Sie mit einer Mikroschere Beine, Flügel und die Spitzen ihrer Abdomina am achten Segment abschneiden. Achten Sie darauf, Beine und Flügel nicht zu nahe am Thorax oder am Hemo abzuschneiden.

Möglicherweise entweicht Flüssigkeit. Spülen Sie nun einen Ätzobjektträger mit 70 % Ethanol und trocknen Sie ihn mit einem Kim-Tuch ab. Positionieren Sie unter dem Mikroskop eine präparierte Mücke am äußeren Rand des geätzten Kreises.

Füllen Sie den Mikroinjektor mit 12 Mikrolitern frischem Verdünnungsmittel. Halten Sie die Mücke mit einer Pinzette fest und injizieren Sie acht bis zehn Mikroliter in die Seitenfläche des Mesothorax. Achten Sie darauf, nach dieser Injektion kein Mineralöl zu verabreichen.

Das Hämolymphe sammelt sich aus dem Abdomen im Ätzkreis. Bewegen Sie vorsichtig das Abdomen mit einer Pinzette, um den Fluss des Hämolymphe zu lenken und zu fördern. Lassen Sie das gesammelte Hämolymphe nun auf dem Objektträger trocknen. Dies sollte etwa 10 Minuten dauern.

Danach ist es bereit zum Färben. Färben Sie jeden Objektträger einzeln mit Hema drei. Tauchen Sie jeden Objektträger fünfmal für jeweils eine Sekunde in das Fixiermittel ein.

Danach drei einsekündige Eintauchvorgänge in Lösung eins und anschließend in Lösung zwei durchführen. Spülen Sie nun nur die Rückseite des Objektträgers mit entionisiertem Wasser ab, nicht die Vorderseite. Trocknen Sie die Vorderseite ab, bringen Sie einen Deckgläser mit Einbettmedium auf und drücken Sie das Deckglas vorsichtig darauf, sodass das Medium die gefärbte Gewebestelle vollständig bedeckt.

Lassen Sie den Objektträger nun mindestens drei Stunden lang trocknen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die gefärbten Zellen sollten innerhalb von zwei Wochen nach dieser Vorbereitung sichtbar gemacht und abgebildet werden. Diese Zellen von adulten Weibchen wurden mithilfe dieses Protokolls identifiziert.

Das erste Bild zeigt einen prohämatopoetischen Zelltyp aufgrund seiner ovalen Form und des hohen Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnisses. Dieses Bild zeigt eine ENO-Zelle, basierend auf ihrer ovalen Form und dem Zytoplasma-zu-Kern-Verhältnis. Zuletzt ist dies ein hämatopoetischer Zelltyp vom Granulozyten-Typ.

Es weist eine stärker körnige Textur auf und ist in seiner Form eher ein OID im Vergleich zu früheren Hochinjektionsmethoden. Dieses Protokoll ergab eine ähnliche Gesamtanzahl an Hämocyten und identifizierte ebenso körnige Zellen als den häufigsten Zelltyp. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb einer Stunde an etwa 15 bis 20 Mücken durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mücken korrekt mit Dent injiziert, wie man ihr Hemos sammelt und anschließend das Hemos für die Visualisierung und Bildgebung vorbereitet.