Name: Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer een Trichuris muris infectiemodel opzetten voor onderzoek naar type 2 immuniteit en darmontsteking. Deze methode analyseert Th2-responsen in muizen en helpt bij het begrijpen van resistentie tegen parasitaire infecties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (MSH-95368, MOP-89773 en de MOP-106623 naar CZ) en de Canada Foundation for Innovation. SCM is de ontvanger van een CIHR / Canadese Vereniging van Gastro-enterologie postdoctoraal fellowship. CZ is een CIHR nieuwe onderzoeker.

1. Het uitdragen van Trichuris Muris eieren <ol><li> Voor het genereren van nieuwe partijen Trichuris Muris eieren, infecteren 20-30 immunodeficiënte muizen (bijv. NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) of 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) of genetisch gevoelige muizen ( bijvoorbeeld. AKR / J), die 6-8 weken oud met ongeveer 300 Trichuris Muris eieren door orale sondevoeding. </li><li> Na 32-35 dagen offeren de muizen door de CO 2 stikken. </li><li> Expose de ventrale zijde van de muis en nat van de buik met 70% ethanol. </li><li> Met behulp van een tang grijpen de buikhuid en maken een kleine incisie met een schaar. Snijd de huid om de buikinhoud bloot te leggen. </li><li> Identificeer de blindedarm en de proximale dikke darm, en verwijder ze. </li><li> Plaats de blindedarm en proximale dikke darm in een 10 cm petrischaaltje met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 500 U / ml penicilline en 500 ug / ml streptomycine (P / S). Snijd de blindedarm open voor het lumen en de wormen bloot te leggen. Met behulp van een tang plaats blindedarm in een bekerglas van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en schud zachtjes om uitwerpselen te verwijderen. </li><li> Keer terug naar blindedarm petrischaal en het gebruik van vloeiende gebogen pincet (Roboz RS-5047) Trek hem voorzichtig uit wormen en ze in een put van een 6 wells plaat met daarin 5 ml van DMEM + P / S. plaats </li><li> Herhaal dit proces voor alle muizen. </li><li> Leg 6 wells plaat in een Tupperware bakje met een vochtig papieren doekje voor vocht en incubeer te handhaven op 37 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Na 4 uur te verwijderen met behulp van wormen glad gebogen pincet en splitsen ze in twee nieuwe putjes van de 6 wells plaat met daarin 5 ml DMEM + P / S. Oogst de inhoud van de oorspronkelijke goed en in een 15 ml falcon buis. Spin buis bij 3000 toeren per minuut en te verwijderen en te reserveren supernatant als 4 uur antigeen (kan gebruikt worden voor mobiele restimulatie na PBS dialyse, waar typische eiwitten opbrengsten 10-20 mg per 20 muizen) en resuspendeer ei-bevattende pellet in geautoclaveerd kraanwater. </li><li> Plaats de 6 wells plaat bij 37 ° C gedurende de nacht. Verwijderen en afvoeren van de wormen. Oogst de inhoud van de putten in een valk buis en draaien op 3000 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en reserveer als 's nachts antigeen (kan worden gebruikt voor Trichuris Ag specifiek antilichaam isotype ELISA na PBS dialyse, waar typische eiwitten opbrengsten 10-20 mg per 20 muizen) en resuspendeer ei-bevattende pellet in geautoclaveerd kraanwater. </li><li> Combineer vier uur en 's nachts eieren en filter de eieren door de 70μm zeef om verwijder vervolgens alle resterende wormen te zetten in een 75 cm 2 kolf. Houden kolf in een donkere plaats in folie gedurende 6 weken bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Was de eieren in geautoclaveerd kraanwater en resuspendeer op 50 levensvatbare eitjes in 50 ui. Om dit te doen, centrifuge eieren op 3000 rpm gedurende 5 minuten en resuspendeer in ~ 50 ml steriel leidingwater. Verwijder 50 ul eieren en leg ze op een glasplaatje. Met behulp van de 40x vergroting tel het aantal levensvatbare bevruchte eieren in de 50 ui. Verdunnen eieren tot 50 levensvatbare eitjes te geven in 50 ui. Voor afbeeldingen van levensvatbare eitjes zie de studie van Kopper en Mansfield 16. </li></ol> 2. Acute infectie van de experimentele muizen met Trichuris Muris eieren (200 eieren / muis) <ol><li> Grondig mengen eieren en verwijder genoeg volume om het aantal muizen te behandelen X 2 (bv. voor 10 muizen te nemen 200 pi x 10 muizen x 2 = 4 ml van eieren) en ze in een 14 ml klikdop tube plaatsen. </li><li> Keer de 14 ml snap cap tube om te mengen. Brengen 200 ul van eieren in 1 ml spuit op een geschikte grootte voeding naald (voor de muizen met een gewicht 25 gram gebruikten we 18 gauge 1 1 / 2 "naalden). In de ene hand nekvel de muis en met de andere hand eieren beheren door orale sondevoeding . </li><li> Wacht 21 dagen. </li></ol> 3. Experimentele oogst <ol><li> Op dag 21 offeren de muizen met behulp van CO 2. </li><li> Verzamel bloed van muizen met hart doorboren, in een niet-gehepariniseerd spuit, en bewaar bij 4 ° C. De volgende dag isoleren serum en invriezen bij -20 ° C. Serum kan worden gebruikt voor de detectie van Trichuris-specifieke IgE-en IgG's met behulp van ELISA. </li><li> Expose de ventrale zijde van de muis en nat van de buik met 70% ethanol. </li><li> Met behulp van een tang grijpen de buikhuid en maken een kleine incisie met een schaar. Snijd de huid en de onderliggende membraan naar de buikinhoud bloot te leggen. </li><li> Identificeer de dunne darm, blindedarm en dikke darm. Pak de blindedarm met een tang en trek van de buikholte. Met een andere tang push dunne darm op aan de rechterkant het blootstellen van de mesenteriale lymfeklieren (mLNs). Verwijder de mLNs en let niet te snijden in de darmen en in een 15 ml falcon met 2 ml van media. Indien gewenst kunnen deze worden verwerkt en opnieuw gestimuleerd in vitro (4x10 6 / ml in 1 ml in 24 goed platen met 1 ug / ml αCD3/CD28 of met 50μg/ml 4u Trichuris Ag) voor 72 uur voor cytokine-analyse door ELISA en intracellulaire flage cytometrie. </li><li> Knip de blindedarm en de dikke darm. </li><li> Met behulp van een tang, 'push out' fecale pellets van distale colon en plaats in een 2 ml Axygen buis. Invriezen bij -20 ° C. Fecale pellets kunnen worden geanalyseerd door western blot voor expressie van resistine-like molecule-β (RELM-β). </li><li> Verwijder het topje van de blindedarm (~ 0,5 cm). Voor het verwijderen van uitwerpselen te houden blindedarm tip met een pincet en spoelen met PBS met behulp van een 3 ml spuit en 22-gauge naald in een petrischaal. Plaats in verse 4% paraformaldehyde in een 5 ml Falcon snap cap tube. Bewaren bij 4 ° C. Deze kunnen worden in paraffine ingebedde, gesegmenteerd en gemonteerd op dia's voor histologische analyse. </li><li> Verwijderen van een stuk van proximale colon (~ 1 cm) voor RNA. Doe monster in 2 ml Axygen buis met 500 ul RNAlater. Bewaren bij 4 ° C. Deze monsters kunnen worden geanalyseerd op mRNA expressie door qPCR. </li><li> Leg de rest van de blindedarm in een gelabeld petrischaal en invriezen bij -20 ° C. </li></ol> 4. Opsomming van Trichuris Muris wormen in de blindedarm <ol><li> Verwijder de blindedarm van de vriezer en plaats in een petrischaaltje met ~ 5 ml water. </li><li> Met behulp van schaar, opengesneden blindedarm aan de lumen bloot te leggen. </li><li> Houd de blindedarm met een tang en schud de blindedarm om de meerderheid van de ontlasting te verwijderen. </li><li> Overdragen blindedarm naar een andere petrischaaltje met water en het gebruik van licht gebogen pincet voorzichtig af te schrapen van de IECS het onderliggende weefsel. </li><li> Overdracht blindedarm naar een nieuwe petrischaal met water en krachtig restmateriaal schrapen met een pincet, het rippen van het weefsel in kleine stukjes. </li><li> Gebruik een dissectiemicroscoop om alle wormen tellen in alle drie van de petrischaaltjes. Als je een worm te verwijderen van de schotel naar dezelfde worm garanderen, is geen tweemaal geteld. Als wormen beschadigd zijn (dat wil zeggen gebroken half) tellen slechts een dikke of dunne uiteinden om een ​​nauwkeurige telling te krijgen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten De Trichuris Muris infectie model stelt onderzoekers in staat te kwantificeren parasiet lasten en systemische immuunrespons, alsmede op histologisch onderzoek de ontstekingsreactie in het distale blindedarm. Wanneer het lumen van de geoogste blindedarm wordt blootgesteld, kan Trichuris wormen worden opgesomd met behulp van een dissectiemicroscoop (Figuur 1A-B). Parameters van immuniteit voor Trichuris ook antilichaam isotype omschakeling naar IgG1 (geassocieerd met Th2-type immuniteit) in resistente dieren, en IgG2a (in verband met Th1-type immuniteit) bij gevoelige dieren (figuur 1C). Expressie van de beker cel-specifiek eiwit resistine-like molecule-β (RELM-β) wordt geassocieerd met klaring van Trichuris en is detecteerbaar door Western blot-analyse (figuur 2). Het distale deel van de blindedarm kan worden gekleurd met Periodieke Acid-Schiff (PAS) om goblet cel responsen en de mate van intestinale ontsteking in reactie op infectie (figuur 3) te beoordelen. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Kwantificering van immuniteit voor Trichuris Muris. (A) Resistant (B6) muizen te verdrijven Trichuris Muris op dag 21 na infectie. Daarentegen, worden gevoelig (AKR / J) muizen chronisch geïnfecteerd met Trichuris, wat resulteert in parasiet vestiging. Elke staaf staat voor het gemiddelde ± SEM van 4-8 dieren per groep. (B) Wormen zijn geteld met behulp van een dissectie microscoop. Top paneel toont wormen in isolement, onderste paneel toont wormen in de aanwezigheid van IECS en uitwerpselen. (C) Trichuris-specifieke IgG2a titers worden bepaald door ELISA van verdund serum (1:2 verdunning, te beginnen op 1:20 verdunning en eindigend bij 1:2560) op platen gecoat met uitscheidingsorganen Trichuris antigeen (O / N Ag, 5 ng / ml). Gevoelig AKR / J muizen hebben met name hogere niveaus van Trichuris-specifieke serum IgG2a dan resistent B6 muizen. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Klaring van Trichuris Muris wordt geassocieerd met expressie van de beker cel-specifiek eiwit RELM-β 7. RELM-β productie kan worden gedetecteerd van fecale pellets uit Trichuris-geïnfecteerde bestand (B6), maar niet gevoelig (AKR / J) muizen door western blot analyse. Elke baan is representatief voor een enkel dier, (N) = Naïef, (Tm) = 21 dagen Trichuris geïnfecteerde muizen. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Histologisch onderzoek van het distale blindedarm volgende Trichuris infectie. 5-7 um delen van het distale blindedarm gekleurd met PAS. Goblet cel hyperplasie en slijmproductie zijn duidelijk in resistente (B6), maar niet gevoelig (AKR / J) muizen na Trichuris infectie.

<ol><li>Cliffe, L. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Trichuris+muris+system%3A+a+paradigm+of+resistance+and+susceptibility+to+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection.</a> Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).</li>
<li>Else, K. J., Finkelman, F. D., Maliszewski, C. R., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-mediated+regulation+of+chronic+intestinal+helminth+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Cytokine-mediated regulation of chronic intestinal helminth infection.</a> J. Exp. Med. 179, 347-351 (1994).</li>
<li>Bancroft, A. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+and+Th2+cells+and+immunity+to+intestinal+helminths%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 and Th2 cells and immunity to intestinal helminths.</a> Chem. Immunol. 71, 192-208 (1998).</li>
<li>Bancroft, A. J., McKenzie, A. N., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-13+in+resistance+to+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-13 in resistance to intestinal nematode infection.</a> J. Immunol. 160, 3453-3461 (1998).</li>
<li>Helmby, H., Takeda, K., Akira, S., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+%28IL%29-18+promotes+the+development+of+chronic+gastrointestinal+helminth+infection+by+downregulating+IL-13%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin (IL)-18 promotes the development of chronic gastrointestinal helminth infection by downregulating IL-13.</a> J. Exp. Med. 194, 355-364 (2001).</li>
<li>Owyang, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+25+regulates+type+2+cytokine-dependent+immunity+and+limits+chronic+inflammation+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract.</a> J. Exp. Med. 203, 843-849 (2006).</li>
<li>Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELM%CE%B2%2FFIZZ2+is+a+goblet+cell-specific+immune-effector+molecule+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RELMβ/FIZZ2 is a goblet cell-specific immune-effector molecule in the gastrointestinal tract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13596-13600 (2004).</li>
<li>Datta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+in+intestinal+tissue+that+are+regulated+after+infection+with+an+intestinal+nematode+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes in intestinal tissue that are regulated after infection with an intestinal nematode parasite.</a> Infect. Immun. 73, 4025-4033 (2005).</li>
<li>Cliffe, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+intestinal+epithelial+cell+turnover%3A+a+new+mechanism+of+parasite+expulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Accelerated intestinal epithelial cell turnover: a new mechanism of parasite expulsion.</a> Science. 308, 1463-1465 (2005).</li>
<li>Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+weapons+in+the+war+on+worms%3A+identification+of+putative+mechanisms+of+immune-mediated+expulsion+of+gastrointestinal+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">New weapons in the war on worms: identification of putative mechanisms of immune-mediated expulsion of gastrointestinal nematodes.</a> Int. J. Parasitol. 36, 723-733 (2006).</li>
<li>Finkelman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+regulation+of+host+defense+against+parasitic+gastrointestinal+nematodes%3A+lessons+from+studies+with+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models.</a> Annu. Rev. Immunol. 15, 505-533 (1997).</li>
<li>Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+helminth+infection%3A+immunopathology+and+resistance+during+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enteric helminth infection: immunopathology and resistance during intestinal nematode infection.</a> Chem. Immunol. 66, 41-61 (1997).</li>
<li>Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+intestinal+muscle+contraction+by+interleukin-9+%28IL-9%29+or+IL-9+neutralization%3A+correlation+with+worm+expulsion+in+murine+nematode+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Modulation of intestinal muscle contraction by interleukin-9 (IL-9) or IL-9 neutralization: correlation with worm expulsion in murine nematode infections.</a> Infect. Immun. 71, 2430-2438 (2003).</li>
<li>Khan, W. I., Blennerhasset, P., Ma, C., Matthaei, K. I., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat6+dependent+goblet+cell+hyperplasia+during+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stat6 dependent goblet cell hyperplasia during intestinal nematode infection.</a> Parasite Immunol. 23, 39-42 (2001).</li>
<li>Akiho, H., Blennerhassett, P., Deng, Y., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+IL-4%2C+IL-13%2C+and+STAT6+in+inflammation-induced+hypercontractility+of+murine+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of IL-4, IL-13, and STAT6 in inflammation-induced hypercontractility of murine smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, 226-2232 (2002).</li>
<li>Kopper, J. J., Mansfield, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+improved+methods+for+delivery+of+Trichuris+muris+to+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of improved methods for delivery of Trichuris muris to the laboratory mouse.</a> Parasitol. Res. 107, 1103-1113 (2010).</li>
<li>Bancroft, A. J., Else, K. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+infection+with+Trichuris+muris+significantly+affects+the+polarization+of+the+CD4+response%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the polarization of the CD4 response.</a> Eur. J. Immunol. 24, 3113-3118 (1994).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van British Columbia in te stellen.

Dit protocol details van een standaard hoge dosis acute Trichuris Muris infectie die kan worden aangepast, zoals vereist door de onderzoeker. Kan bijvoorbeeld muizen worden opgeofferd en weefsels geoogst op verschillende dagen. Om vast te stellen dat de muizen met succes hebben volledige worm last vastgelegd kunnen worden opgeofferd op dag 14, en op dat moment alle muizen moet een last van ongeveer 200 wormen dragen. Muizen kunnen ook besmet worden voor 32 dagen waar geen worm ontdekt zal hebben bereikt, volwas...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Animal Feeding Naalden (18 x 1 ½ &quot;) </td><td> Drukknoop </td><td> 7912 </td><td></td></tr><tr><td> Gladde gebogen Forceps </td><td> Roboz </td><td> RS-5047 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Prkdc SCID IL2R gtm1Wjl / SzJ (NSG) </td><td> Jackson Laboratories </td><td> 005557 </td><td> Dit zijn de muizen hebben we gebruikt, echter, moet elke immunodeficiënte muizen of vatbaar zijn stam te werken. </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Qiagen </td><td> 76104 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml buizen </td><td> Axygen </td><td> MCT-200-C </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml buizen </td><td> Valk </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 6 well platen </td><td> Valk </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Electron Microscopy Wetenschap </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> α-RELMβ antilichaam </td><td> PeproTech Inc </td><td> 0694270Rb </td><td></td></tr></tbody></table>

trichuris muris infectie: een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris is een natuurlijke ziekteverwekker van muizen en is biologisch en antigeen vergelijkbaar met soorten Trichuris dat mensen en vee een infecteren. Infectieuze eieren worden gegeven door orale sondevoeding, luik in de distale dunne darm, binnen te vallen van de darmepitheelcellen (IECS) die lijn de crypten van de blindedarm en proximale dikke darm en op de rijping van de wormen eieren introductie in het milieu 1. Dit model is een krachtig hulpmiddel om factoren te onderzoeken die de controle CD4 + T-helper (Th) cel activatie en de veranderingen in het darmepitheel. De immuunrespons die optreedt in resistente inteeltstammen, zoals C57BL / 6 en BALB / c, wordt gekenmerkt door Th2 gepolariseerd cytokines (IL-4, IL-5 en IL-13) en de uitzetting van wormen, terwijl Th1-geassocieerde cytokines (IL -12, IL-18, IFN-γ) het bevorderen van chronische infecties in genetisch gevoelige AKR / J muizen 2-6. Th2 cytokines bevordering van fysiologische veranderingen in de intestinale micro-omgeving waaronder snelle omzet van IECS, beker celdifferentiatie, recruitment en veranderingen in de epitheliale permeabiliteit en gladde spiercontractie, die allen zijn betrokken bij worm uitzetting 7-15. Hier hebben we detail een protocol voor het uitdragen van Trichuris Muris eieren die gebruikt kunnen worden in de volgende experimenten. We bieden ook een voorbeeld van experimenteel oogst met suggesties voor post-infectie-analyse. In het algemeen zal dit protocol te bieden onderzoekers met de basisinstrumenten voor een Trichuris Muris muis infectie-model dat gebruikt kan worden om vragen met betrekking tot Th neiging in het maag-darmkanaal en immuun effectorfuncties van IECS te pakken uit te voeren.

Trichuris Muris-infectie is een intestinale model van de Th2-immuniteit, waar resistente muizen genereren van een beschermende Th2 respons en vatbaar zijn muizen het genereren van een pathologische Th1 respons.

Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

*Trichuris muris* is een natuurlijke pathogeen van muizen en is biologisch en antigenisch vergelijkbaar met *Trichuris*-soorten die mensen en vee infecteren1. ...

Het algemene doel van deze procedure is het tot stand brengen en behouden van een natuurlijk infectiemodel voor *H. curcurus*. Eerst worden muizen via orale gavage geïnfecteerd met *H. curcurus*-eieren. 21 dagen later worden de geïnfecteerde dieren geëuthanaseerd en worden bloed, mesenteriale lymfeklieren, fecespellets, colons en milt geoogst.Met behulp van deze monsters kan de immuunrespons die is opgewekt tegen tricks. Mirrors worden geanalyseerd. Serummonsters kunnen via ELISA worden geanalyseerd om TRA-specifieke antilichamen te detecteren.In vitro restimulatie van lymfeknoocellen kan worden uitgevoerd om cellulaire immuunresponsen te analyseren. Fecale pellets kunnen via Western blot worden gebruikt voor de bepaling van het eiwitgehalte, en genexpressieanalyse kan worden uitgevoerd door middel van QPCR-analyse van het colon. Tot slot kan de tip van het caecum worden gebruikt voor histologie, terwijl de rest van het caecum kan worden gebruikt om de wormlast bij geïnfecteerde muizen te bepalen.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen of een muis resistent of vatbaar is voor een infectie met trais MOUs, en kan de immuunrespons die tegen de parasiet wordt opgebouwd worden gekarakteriseerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals welke factoren de activering van T-helpercellen beheersen, en welke eiwitten vereist zijn voor de differentiatie van TH2-cellen. Trauss MOUs-eieren kunnen worden vermeerderd in immuundeficiënte muizen of genetisch vatbare stammen zoals een KR; 35 dagen na infectie kunnen de eieren worden geoogst uit geëuthanaseerde muizen.Leg de ventrale zijde van het dier bloot en spoel de buik van de muis met ethanol met behulp van steriele pincetten en een schaar. Pak de huid van de buik vast en maak een kleine incisie. Leg de inhoud van de buikholte bloot, identificeer het cecum en het proximale colon, en verwijder deze vervolgens.Breng de organen over naar een Petrischaal van 10 centimeter met door penicilline en streptomycine aangevuld DMEM. Snijd vervolgens het cecum en het proximale colon open, waarbij het lumen en de wormen met een pincet worden blootgelegd. Plaats de geopende organen in een bekerglas met PBS en schud voorzichtig om de feces weg te wassen.Zodra het caecum is gewassen, brengt u het over naar een schone Petrischaal en gebruikt u gladde, gebogen pincetten om de wormen voorzichtig te verwijderen. Breng alle wormen van elke muis over naar één putje van een six-well plaat die vijf milliliter met antibiotica aangevuld DMEM bevat. Plaats de six-well plaat samen met een vochtig papieren handdoekje in een Tupperware-bakje en incubeer dit gedurende vier uur bij 37 °C om de wormen de gelegenheid te geven eieren te leggen.Gebruik na deze incubatie een pincet om de wormen uit het oorspronkelijke putje te verwijderen en verdeel ze over twee nieuwe putjes met DMEM. Door de wormen op deze manier te verdelen, wordt het herstel van eieren met een pipet gemaximaliseerd. Oogst het resterende medium met het uitgescheiden antigeen en de eieren uit het oorspronkelijke putje en breng dit over naar een Falcon-buis van 15 milliliter.Centrifugeer de buis bij 3000 RPM gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het supernatant dat het vier uur oude antigeen bevat en bewaar dit, en resuspendeer het pellet in steriel water. Plaats de zeswellplaat met de wormen opnieuw bij 37 °C en incubeer deze overnacht tot de volgende ochtend.Nadat de wormen zijn verwijderd, oogst u de inhoud van de putjes zoals eerder beschreven en centrifugeert u het supernatant om de eieren te isoleren. Bewaar het supernatant dat het overnight-antigeen bevat en resuspendeer de eieren in water. Combineer deze eieren, zoals eerder gedaan, met de eieren die zijn verkregen uit de incubatie van vier uur.Filter de eieren door een zeef van 70 micron om eventuele overgebleven wormen te verwijderen. Breng ze vervolgens over naar een vierkante kolf van 75 centimeter. Bedek de kolf met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen en bewaar de eieren zes weken lang bij kamertemperatuur.Dit stelt de eitjes in staat om na zes weken te rijpen en te embryoneren. Was de eitjes, giet het water af en tel de levensvatbare eitjes. Hier te zien.Als voorbeeld van een levensvatbaar geëmbryoneerd ei en een niet-levensvatbaar ei, buigt Reese de Exeter-concentratie van 50 per 50 µL. Op dit punt kunnen de eieren worden bewaard bij 4 °C voordat de muizen worden geïnfecteerd. Zorg ervoor dat de ei-bevattende oplossing grondig wordt opgeschud.Breng de gewenste hoeveelheid inoculum over in een snap cap buis van 14 milliliter en keer de buis om om te mengen. Trek 200 microliters eieren op in een voedingsnaald van passende grootte voor de grootte van het dier, bevestigd aan een spuit van één milliliter. Pak de muis in de nekvelhuid en dien de eieren toe via orale gavage.Plaats de geïnfecteerde muis terug in de kooi en laat de infectie 21 dagen voortschrijden. Na 21 dagen wordt het bloed van de geïnfecteerde muizen geoogst via een hartpunctie met een niet-gehepariniseerde spuit. Na euthanasie met koolstofdioxide kunnen de bloedmonsters worden bewaard bij 4 °C.Voor de isolatie van serum en de analyse van tra-specifieke IgGs en IgE via ELISA. Leg de buikholte van de muis vrij zoals eerder beschreven. Gebruik vervolgens een pincet om het caecum met een schaar of een tweede pincet naar buiten te trekken.Duw de dunne darm naar rechts om de mesenteriale lymfeklieren bloot te leggen. Verwijder de lymfeklieren voorzichtig, waarbij u erop let dat u de darmen niet doorsnijdt, en plaats deze in een Falcon-buis van 15 milliliter met twee milliliter medium. Lymfekliercellen kunnen later in vitro worden gestimuleerd met supernatant van antigen S uit de wormculturen na vier uur om de cellulaire immuunrespons op de parasiet te analyseren.Zodra de lymfeklieren zijn geoogst, exciseert u het caecum en het colon zoals eerder beschreven. Gebruik een pincet om fecespellets uit het distale colon te verwijderen en plaats deze in een 2 mL zuurstofbuis; pellets kunnen worden bewaard bij -20 °C en via western blot worden geanalyseerd op eiwitgehalte. Knip met een schaar ongeveer 1 cm van het proximale colon af en plaats dit in een buis met RNA-stabilisator. Bewaar dit vervolgens bij 4 °C.Snijd ongeveer vijf millimeter van de punt van het caecum af terwijl u de punt van het caecum met een pincet vasthoudt. Gebruik een spuit van drie milliliter en een naald van 22 gauge om het monster door te spoelen met PBS. Draag het vervolgens over naar een flk-buis met klikdop van vijf milliliter die 4%paraldehyde bevat.Het met paraldehyde gefixeerde blindedarmsample kan worden bewaard bij vier graden Celsius en gebruikt worden voor histologische analyse. Plaats het resterende deel van de blindedarm in een Petrischaal en vries dit in bij minus 20 graden Celsius om de wormen te doden. Voor een eenvoudigere telling van de wormen wordt de blindedarm ontdooid en met een schaar in een Petrischaal met ongeveer vijf milliliters water geplaatst.Snijd het caecum open om het lumen bloot te leggen en schud dit om de feces in een schaaltje te verzamelen. Plaats het schone caecum in een nieuwe Petrischaal met water en gebruik gladde, gebogen pincetten om de epitheelcellen van de darm af te schrapen. Verplaats het caecum naar een nieuwe Petrischaal met water en scheur het weefsel in kleine stukjes.Observeer de feces, darmepitheelcellen en het caecumweefsel onder een dissectiemicroscoop en tel de wormen; verwijder deze tijdens het tellen en plaats ze in een schone schaal. Zo zouden de wormen in het caecum eruit moeten zien voor en na isolatie, zoals hier getoond. Na infectie zijn tragus mirrors black six-muizen in staat om de parasieten te beheersen, terwijl KR-muizen een verhoogde parasitaire last ontwikkelen.Eveneens vatbare AKR-muizen ontwikkelen, zoals bepaald via serum-ELISA, merkbaar hogere TRA-specifieke IgG2a-titers dan C57BL/6-muizen. In dit experiment onthulde Western blot-analyse dat de hoeveelheid gobletcel-specifiek eiwit RelMβ verhoogd was in de feces van C57BL/6-muizen, maar niet in AKR-muizen na infectie. Histologische analyse van het distale caecum toont gobletcelhyperplasie en mucusproductie in resistente TRA-muizen en geïnfecteerde C57BL/6-muizen, maar niet in vatbare AKR-muizen.Na het bekijken van deze video moet u een goed inzicht hebben in het vermeerderen van trismus-eieren, het infecteren van experimentele muizen en het oogsten van het darmweefsel, het mesenterium, de enterische lymfeklieren en bloed voor de analyse van de infectie in vatbare of resistente muizen.

trichuris-muris-infection-model-type-2-immunity-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Experimentele modellen van inflammatoire darmziekte hebben ons de complexe aangeboren en adaptieve immuunrespons geassocieerd met pathogenese te onderzoeken. Met behulp van histologische scoring, kwantificering van pro-inflammatoire cytokines en myeloperoxidase activiteit, kan men beginnen met deze reacties gezien bij inflammatoire darmziekten te beoordelen.

Onderzoeken darmontsteking in DSS-geïnduceerde Model van IBD

Postoperatieve ileus (POI) is een complicatie van abdominale chirurgie leidt tot verhoogde morbiditeit en een langdurig verblijf in het ziekenhuis. Omdat profylactische of therapeutische strategieën ontbreken geïntensiveerd onderzoek is noodzakelijk. Daarom hebben we een gestandaardiseerde en haalbaar muismodel naar de pathofysiologie van POI te onderzoeken en mogelijke therapeutische opties te bestuderen.

Functionele Evaluatie van darmmotiliteit en de darmwand ontsteking in Knaagdieren: Analyses in een gestandaardiseerd model van Intestinal Manipulatie

Citrobacter rodentium infectie biedt een waardevol model voor enterische bacteriële infecties te bestuderen, evenals het hosten immuunreacties en colitis bij muizen. Dit protocol beschrijft de meting van de barrière integriteit, pathogeen belasting en histologische schade waardoor de grondige karakterisering van pathogeen en gastheer bijdragen aan murine infectieuze colitis.

De<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis

Diermodellen hebben bewezen waardevolle instrumenten definiëren gastheer en pathogeen specifieke mechanismen die bijdragen aan de ontwikkeling van chronische ontsteking. Hier beschrijven we een muismodel van orale infectie met het humaan pathogeen Porphyromonas gingivalis en detail methoden om de progressie van inflammatie lokale en systemische plaatsen.

Een muismodel voor pathogenen geïnduceerde Chronische ontsteking op lokale en systemische sites

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

In dit antigeengedreven colitismodel werden OT-II CD4+ T-cellen die een rood fluorescent eiwit tot expressie brengen adoptief overgebracht naar RAG-/- muizen die een groen fluorescent eiwit tot expressie brengen in mononucleaire fagocyten (MP's). De gastheren werden uitgedaagd met Escherichia coli (E.coli) die het ovalbumine-eiwit (OVA) tot expressie brengt, gefuseerd met een cyaan fluorescent eiwit (CFP).

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

Hier wordt een protocol om na te bootsen de ingang van bacteriële afkomstige verbindingen na de schending van de intestinale barrière gepresenteerd. Een lage dosis subletale lipopolysaccharide werd systemisch geïnjecteerd in muizen, die werden gecontroleerd voor 24u na injectie. De expressie van pro-ontsteking cytokinen werd vastgesteld op verschillende tijdstippen in de milt, lever en dikke darm.

Injecties van Lipopolysaccharide in muizen om na te bootsen ingang van microbiële afkomstige producten na de schending van de intestinale barrière

Lymfkliertest distale colostomie biedt een lymfkliertest model voor menselijke afleiding colitis, een overwegend lymfatische colitis in dikke darm segment van de fecale stream uitgesloten.

Lymfkliertest distale colostoma, een nieuw Model van afleiding Colitis in C57BL/6 muizen

Dit protocol beschrijft een muismodel van door salmonella gedreven intestinale fibrose dat lijkt op belangrijke pathologische kenmerken van de ziekte van Crohn, waaronder Transmurale ontsteking en fibrose. Deze methode kan worden gebruikt om gastheerfactoren te evalueren die fibrotische uitkomsten veranderen met Mutant muizen gehandhaafd op een C57Bl/6 genetische achtergrond.

Chronische salmonella infectie veroorzaakte intestinale fibrose

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Ons gedetailleerde protocol schetst de creatie en het gebruik van het geavanceerde darm-op-chip-model, dat menselijk darmslijmvlies simuleert met 3D-structuren en verschillende celtypen, waardoor een diepgaande analyse van immuunresponsen en cellulaire functies als reactie op microbiële kolonisatie mogelijk is.

Immunocompetent darm-op-chip-model voor het analyseren van immuunresponsen van het darmslijmvlies

Leer een Trichuris muris infectiemodel opzetten voor onderzoek naar type 2 immuniteit en darmontsteking. Deze methode analyseert Th2-responsen in muizen en helpt bij het begrijpen van resistentie tegen parasitaire infecties.

Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

Meer video's verkennen