Name: Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Influenza-Hämagglutinin und Neuraminidase mit universellen Antikörpern in Slot-Blot-Assays quantitativ analysieren. Diese Methode ermöglicht präzise Viralprotein-Quantifizierung für die Impfstoffentwicklung.

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Die Autoren bedanken sich bei Frau Monika Tocchi für redaktionelle Durchsicht des Manuskripts danken. AMH wird durch ein Stipendium von King Abdulaziz Universität unterstützt wird, durch den saudi-arabischen Kulturbüro in Kanada.

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<li>Hashem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+antibodies+against+the+highly+conserved+influenza+fusion+peptide+cross-neutralize+several+subtypes+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus.</a> Biochem Biophys Res Comm. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Quantitative Bestimmung des Influenza Virus HA und NA sind entscheidend für die Impfstoff-Forschung und Entwicklung, da diese beiden Oberflächenproteine ​​wichtigsten viralen Komponenten induzieren Immunreaktionen 6-11 sind. Zuvor berichtete immunologische Methoden zum Nachweis dieser Proteine ​​benötigen Belastung spezifischen Antikörpern. Die einfache, reproduzierbare und schnelle Slot-Blot-Methode, um die HA und NA-Antigenen hier beschriebenen Quantifizierung eignen sich für alle Influenza-A-Virus-HA und N...

An author's affiliation was omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/2784">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays</a>.

Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes oder Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Bio-Dot SF Mikrofiltration Apparatus </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6542 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Dot SF Filterpapier </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-FL Transfer-Membran (PVDF) </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Millipore </td><td> WP6111560 </td><td></td></tr><tr><td> Chemilumineszenz BioMax Light Film </td><td> Kodak </td><td> 178 8207 </td><td></td></tr><tr><td> FluorChem Gel-Dokumentations-System </td><td> Alpha Innotech </td><td> 29 bis 008-1896X </td><td></td></tr><tr><td> Universal-Kaninchen-Antikörper gegen HA und NA-Antigenen </td><td></td><td> Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) </td><td> Antikörper sind durch MTA erhältlich oder können von interessierten Forschern nach den Verfahren zuvor beschriebenen 6,7 erzeugt werden. </td></tr><tr><td> Influenza-Impfstoff-Antigen Referenz </td><td> CBER / FDA oder NIBSC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Influenza-Impfstoff Proben </td><td></td><td></td><td> Häufig in den meisten Ländern </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U1250 </td><td></td></tr><tr><td> Zwittergent 3-14 Waschmittel </td><td> Calbiochem </td><td> 693017 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Blotting Grade Blocker Non-Fett-Trockenmilch </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L), Peroxidase-konjugierten </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31460 </td><td></td></tr><tr><td> SuperSignal West Dura Erweiterte Duration Substrate </td><td> Thermo Scientific </td><td> 34075 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysen aller influenza typ a viral hämagglutininen und neuraminidasen mit universal antikörper in einfache slot blot assays

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind zwei Oberflächenproteine ​​von Influenza-Viren, die bekanntlich eine wichtige Rolle im viralen Lebenszyklus und die Induktion von schützenden Immunantworten 1,2 zu spielen. Als Hauptzielgruppe für neutralisierende Antikörper, ist HA derzeit als das Influenza-Impfstoff Potenz Marker verwendet und wird durch einzelne radiale Immundiffusion (SRID) 3 gemessen. Allerdings verursacht die Abhängigkeit der SRID von der Verfügbarkeit der entsprechenden Subtyp-spezifischen Antiseren mindestens 2-3 Monate Verzögerung für die Veröffentlichung von jedem neuen Impfstoff. Darüber hinaus, obwohl es Belege, dass die NA auch induziert eine schützende Immunität 4, die Höhe der NA in Influenza-Impfstoffen ist noch nicht standardisiert durch einen Mangel an geeigneten Reagenzien oder analytische Methode 5. So sind einfache Alternative Methoden in der Lage Quantifizierung HA und NA-Antigenen wünschenswert für die schnelle Freigabe und bessere Qualitätskontrolle von Influenza-Impfstoffen. Universell konservierten Regionen in allen verfügbaren Influenza-A-HA und NA-Sequenzen wurden von einer leistungsfähigen Bioinformatik-Analysen 6-7 identifiziert. Eine Sequenz (bezeichnet als Uni-1) wurde in die einzige universell konservierte Epitop des HA, das Fusionspeptid 6 identifiziert, während zwei konservierte Sequenzen in Neuraminidasen, einer in der Nähe der enzymatisch aktiven Stelle (bezeichnet als HCA-2) und die identifiziert wurden, andere in der Nähe des N-Terminus (bezeichnet als HCA-3) 7. Peptide mit dieser Aminosäure-Sequenzen wurden synthetisiert und verwendet, um Kaninchen für die Produktion von Antikörpern zu immunisieren. Der Antikörper gegen das Uni-1-Epitop von HA konnte auf 13 Subtypen von Influenza-A-HA (H1-H13) zu binden, während die Antikörper gegen die HCA-2 und HCA-3-Regionen von NA wurden binden alle 9 NA-Subtypen. Alle Antikörper zeigten bemerkenswerte Spezifität gegen die viralen Sequenzen als durch die Beobachtung, dass keine Kreuzreaktivität zu Allantois Proteine ​​erkannt wurde nachgewiesen. Diese universellen Antikörper wurden dann verwendet, um Slot-Blot-Assays zu entwickeln, HA und NA in Influenza-A-Impfstoffe ohne die Notwendigkeit für spezifische Antiseren 7,8 quantifizieren. Vaccine Proben wurden auf eine PVDF-Membran mit einer Slot-Blot-Apparatur mit Referenzstandards verdünnt, um verschiedenen Konzentrationen angewendet. Für den Nachweis von HA, wurden die Proben und Standard-First in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 4M Harnstoff, während für die Messung von NA sie in TBS verdünnt wurden mit 0,01% Zwittergent diese Bedingungen deutlich verbessert die Nachweisempfindlichkeit. Nach der Erkennung des HA und NA-Antigenen durch Immunoblot mit ihren jeweiligen universellen Antikörper wurden Signalintensitäten durch Densitometrie quantifiziert. Mengen von HA und NA in den Impfstoffen wurden dann anhand einer Standardkurve mit den Signalintensitäten der verschiedenen Konzentrationen der Referenzen verwendet etabliert. Da diese Antikörper binden an universellen Epitope in HA oder NA konnten sich Interessierte Forscher sie als Werkzeuge der Forschung Verwendung in Immunoassays andere als die Slot-Blot nur.

Ein einfaches Slot-Blot-Methode wurde für die Quantifizierung von Influenza Virus Hämagglutinin und Neuraminidase mit universellen Antikörper, die gegen ihre stärksten konservierten Sequenzen durch bioinformatische Analysen identifiziert entwickelt. Dieser innovative Ansatz kann eine sinnvolle Alternative zu quantitativen Bestimmung aller viralen Hämagglutinin und Neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind zwei Oberflächenproteine von Influenzaviren, von denen bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle im viralen Lebenszyklus spielen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Gehalt an influenzaviralem Hämagglutinin und Neuraminidase in Impfstoffen mithilfe von Antikörpern, die gegen konservierte Epitope gerichtet sind, quantitativ zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst konservierte Epitope identifiziert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Referenz- und Impfstoffproben zu verdünnen, um die Nachweisempfindlichkeit zu verbessern.Der dritte Schritt besteht darin, die Slot-Blot-Apparatur zusammenzubauen und die Proben in die Schlitze zu laden. Der vierte Schritt des Verfahrens ist der Nachweis von HA oder NA auf der Membran mithilfe der jeweiligen universellen Antikörper. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Quantifizierung der Mengen an HA oder NA mittels Densitometrie.Schließlich können Ergebnisse erhalten werden, die HA oder NA in Bezug auf ihre jeweiligen Referenzantigene quantifiziert zeigen. Hallo, mein Name ist Anwar Hashem. Ich bin Doktorand im Labor von Dr. Sean Lee.Hallo, mein Name ist Caroline Grab und ich bin Technikerin im Labor von Dr. Sean Lee am Zentrum für Impfstoffbewertung bei Health Canada. Heute werden wir ein Slot-Blot-Verfahren demonstrieren, das zur Quantifizierung der HA- und NA-Antigene von Influenzaviren verwendet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der einzigen radialen Immundiffusion (SRID) oder physikalisch-chemischen Methoden besteht darin, dass sie im Gegensatz zu SRID keine strainspezifischen oder subtypspezifischen Antikörper und im Gegensatz zu physikalisch-chemischen Methoden keine hochentwickelten Instrumente erfordert.Außerdem sind diese Antikörper, da sie gegen die einzigen universell konservierten Epitope eines RA gerichtet sind, als Grundlagenforschungswerkzeuge für interessierte Forscher nützlich. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie auf technische Probleme stoßen können, wie beispielsweise Schwierigkeiten beim Blockieren präzipitierter Impfstoffproben, Austreten von Proben zwischen den Schlitzen und Verlust des Vakuums während des Blottingschritts sowie ein hohes Hintergrundsignal in diffusen Banden, die nach der Immunodetektion beobachtet werden. Eine sorgfältige Beachtung einiger Schlüsselschritte kann jedoch helfen, diese Probleme zu beheben.Wir werden Ihnen heute den Ablauf demonstrieren. Beginnen wir also. Um konservierte Bereiche zu identifizieren, verwendeten wir Cluster-W-Ausrichtungen zur Analyse von insgesamt über 6.000 Influenza-A-HA-Sequenzen aus der NCBI und fanden das N-Terminus der HA-Zweiersubunit als hochkonservierten Bereich.Die Shannon-Entropie und die Erhaltungsrate für jede Position der Aminosäuren der identifizierten Konsensussequenzen wurden berechnet. Das in Rot dargestellte UNI-Epitop wurde zur Entwicklung eines universellen Antikörpers gegen HA für den Slot-Blot-Assay ausgewählt. Mit einem ähnlichen Ansatz wurden zwei universell konservierte Sequenzen in allen Influenza-A-NA identifiziert, eine nahe der enzymatisch aktiven Stelle und die andere am C-terminalen Ende. Peptide mit diesen Aminosäuresequenzen wurden als Antigene zur Erzeugung universeller Antikörper gegen NA für den Slot-Blot-Assay verwendet.Bevor Sie mit dem Slot-Blot-Verfahren beginnen, bereiten Sie 20 Milliliter einer vier Mol Harnstoff-Lösung in TBS für den Hämagglutinin- oder HA-Slot-Blot oder 20 Milliliter einer 0,01 %igen Ergen-Lösung in TBS für den Neuraminidase- oder NA-Slot-Blot vor. Danach bereiten Sie zwei Liter Waschpuffer vor, indem Sie 20 bis A TBS-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,1 % hinzufügen. Bereiten Sie anschließend 80 Milliliter Blockierpuffer vor, indem Sie Magermilchpulver in Waschpuffer auf eine Endkonzentration von 5 % (Gewicht pro Volumen) auflösen. Aktivieren Sie die PDF-Membran und Methanol 15 Sekunden lang, gefolgt von einer zweiminütigen Spülung mit zweifach destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Membran in TBS ein, bis sie verwendet wird, und präbenetzen Sie drei Blätter T-Blot-SF-Filterpapier in TBS, bis sie verwendet werden. Influenza-Impfstoff-Referenzstandards mit vorbestimmtem HA-Gehalt entsprachen den zu testenden Impfstoffstämmen.Wurden vom Center for Biologics Evaluation and Research in den USA oder vom National Institute for Biological Standard and Control im Vereinigten Königreich bezogen und für die HA- oder NA-Quantifizierung mittels Slot-Blot für HA-Referenzantigene und Testimpfstoffproben verwendet. Bereiten Sie 650 Mikroliter verdünnten HA-Referenzantigen-Stamms in vier Mol Harnstoff in TBS bei den angegebenen Konzentrationen vor. Bereiten Sie anschließend 650 Mikroliter Testimpfstoffproben in vier Mol Harnstoff in TBS in drei verschiedenen Verdünnungen, wie 10×, 20× und 40×, mit jeweils einer Verdoppelungsdifferenz vor, um sicherzustellen, dass die Probenkonzentrationen innerhalb der Standardkurve für NA-Referenzantigene und Testimpfstoffproben liegen.Stellen Sie jeweils 650 Mikroliter NA-Antigenstandardlösungen in 0,01 % Sugen in TBS in den angegebenen Konzentrationen her; die Antigenstandards wurden im Haus unter Verwendung von SDS-Gelelektrophorese in Verbindung mit dichten zytometrischen Analysen hergestellt. Bereiten Sie anschließend 650 Mikroliter Testimpfstoffproben in 0,01 % Sugen in TBS in drei verschiedenen Verdünnungen, wie 10×, 20× und 40×, vor, um einen zweifachen Unterschied zu erreichen und sicherzustellen, dass die Probenkonzentration innerhalb der Standardkurve liegt. Bauen Sie eine zuvor gereinigte und getrocknete Bio-SF-Mikrofiltrationsapparatur zusammen, indem Sie die Dichtungsunterlage in das Vakuummanifold und die Deckeldichtung darauf platzieren.Platzieren Sie die drei feuchten Blätter des BIO SF-Filterpapiers über die Dichtung. Danach die vorbehandelte PVDF-Membran. Dann legen Sie die Probenvorlage auf die Membran und ziehen die vier Schrauben mit den Fingern fest, wobei Sie ein diagonales Kreuzmuster verwenden, um einen gleichmäßigen Druck auf die Membranoberfläche sicherzustellen. Bevor Sie das Gerät anschließen, überprüfen Sie, ob das Dreiwegventil so eingestellt ist, dass das Vakuummanifold mit der Vakuumquelle verbunden ist.Schalten Sie die Pumpe ein und schließen Sie die Bio-Dot-Apparatur an. Stellen Sie sicher, dass sich das Strömungsventil auf einer Ebene unterhalb der Probenmulden befindet, um eine schnelle und ordnungsgemäße Entleerung der Proben in den folgenden Schritten zu gewährleisten. Wiederholen Sie den Schritt zum Festziehen der Schrauben unter Verwendung des diagonalen Kreuzmusters.Das Anziehen der Schrauben während Vakuum angelegt wird, gewährleistet eine dichtere Abdichtung und verhindert Kreuzkontaminationen zwischen den Vertiefungen. Danach wechseln Sie das Flussventil, um das Vakuummanifold der Luft auszusetzen, und schalten die Pumpe aus. Anschließend geben Sie 100 Mikroliter TBS unter Verwendung eines Mehrkanalpipettiersystems in alle Vertiefungen, um die Membran erneut zu hydratisieren.Tragen Sie die Lösung in die Mitte des Wells möglichst nahe am Boden auf, um den Schlitz gleichmäßig zu bedecken. Verwenden Sie eine saubere Pipettenspitze, um eingebrachte Luftblasen zu entfernen. Wechseln Sie das Strömungsventil, um das Manifold sowohl der Luft als auch dem Vakuum auszusetzen.Schalten Sie die Pumpe ein und entleeren Sie vorsichtig den Puffer aus den Vertiefungen, indem Sie mit einem Finger die luftseitig offene Pore abdecken, um die Vakuumstärke zu regulieren. Wechseln Sie dann das Flussventil, um das Manifold der Luft auszusetzen. Sobald der Puffer vollständig aus allen Vertiefungen entleert ist.Schalten Sie die Pumpe aus oder trennen Sie das Vakuum. Geben Sie 200 Mikroliter jeder Standard- oder Impfstoffprobenverdünnung pro Brunnen auf. Pipettieren Sie die Proben nacheinander in die Mitte jedes Brunnens, so nah wie möglich am Boden.Darauf achten, Luftblasen zu vermeiden und gegebenenfalls zu entfernen. Geben Sie 200 Mikroliter Probenverdünnungspuffer in unbenutzte Vertiefungen, um einen geeigneten Unterdruck in den verwendeten Vertiefungen sicherzustellen. Stellen Sie das Flussventil so ein, dass das Manifold sowohl der Luft als auch dem Unterdruck ausgesetzt ist.Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und lassen Sie die Proben vorsichtig vollständig aus den Vertiefungen ablaufen, indem Sie die Menge des Vakuums mit einem Finger über der der Luft ausgesetzten Pore steuern. Nehmen Sie den Finger von der Öffnung, um das Vakuum abzulassen. Sobald alle Proben abgelaufen sind, unverzüglich fortfahren.Geben Sie 200 Mikroliter TBS in jede Vertiefung. Mit einer Mehrkanalpipette einen sanften Vakuumdruck ausüben, um die Vertiefungen zu entleeren und zu waschen, indem die Menge des Vakuums mit einem Finger über der Luftöffnung gesteuert wird. Den Waschschritt einmal wiederholen, sobald die Vertiefungen vollständig entleert sind, lösen Sie die Schrauben der Probenvorlage und schalten Sie das Vakuum aus, um eine Überentwässerung zu vermeiden.Die Wells werden unverzüglich entnommen, die Membran entfernt und in Blockpuffer gegeben. Verwenden Sie ausreichend Puffer, um die Membran vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln.Nach der Übernacht-Inkubation und dem Blockierpuffer. Die Membran zweimal wie aufgelistet waschen, wobei alle Wasch- und Inkubationsschritte unter Schwenken durchgeführt werden. Sicherstellen, dass die Membran vollständig mit Lösung bedeckt ist.Als Nächstes inkubieren Sie die Membran mit dem universellen Kaninchen-Antikörper uni one gegen HA oder den universellen Antikörpern HCA-dash-zwei oder HCA-dash-drei für NA, verdünnt in 5 % (Gewicht pro Volumen) BSA in Waschpuffer, eine Stunde bei Raumtemperatur. Verdünnungen von 1:4.000 des Kaninchen-Antiserums ergaben optimale Ergebnisse für diese Antikörper. Danach waschen Sie die Membran dreimal bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln, jeweils 15 Minuten lang. Anschließend inkubieren Sie die Membran mit einer 1:50.000-Verdünnung des mit Peroxidase konjugierten Ziegen-Anti-IgG-Antikörpers in Blockierpuffer 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln. Nach der Inkubation waschen Sie die Membran dreimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur unter Schütteln, jeweils 15 Minuten lang.Anschließend die Membran fünf Minuten lang mit TBS unter leichtem Schwenken waschen, um restliches Tween-20-Detergens von der Membranoberfläche zu entfernen. Danach das Entwicklungs-Substrat herstellen, indem jeweils drei Milliliter der Reagenzien aus dem Super-Signal-West-Dura-Extended-Duration-Substrat-Kit gemischt werden. Die Membran auf ein trockenes Filterpapier legen, um überschüssiges TBS-Pufferpapier vorsichtig zu entfernen, bevor sie in einen trockenen Behälter überführt und das Substrat appliziert wird. Fünf Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken inkubieren und überschüssiges Substrat durch Abtupfen entfernen.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, setzen Sie die Membran einer chemilumineszenten Filmexposition aus. Die Belichtungsdauer muss optimiert werden, um eine Signalüberlastung zu vermeiden, und liegt typischerweise zwischen 10 Sekunden und 10 Minuten. Die dichte Zytometrie-Analyse auf dem entwickelten Film wurde mit dem Flora-Chem-Gel-Dokumentationssystem gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt.Mitteln Sie die Dichtewerte für jeden Satz von Referenzantigen-Repликaten und Testimpfstoffproben. Für die Signifikanzprüfung und die Bewertung des experimentellen Fehlers sind dreifache Kits erforderlich. Tragen Sie die gemittelten Dichtewerte gegen die Menge an HA- oder NA-Antigen in jedem Feld auf.Entnommen aus dem Referenzstandard. Hier ist ein vierparametriges logistisches Modell für Immunoassays dargestellt, das eine Referenzimpfstoffkonzentration und -dichte verwendet, um die Probenkonzentration aus der Dichte der Testimpfstoffproben mittels einer variablen Steigung und einer nichtlinearen Regressionskurvenanpassung zu extrapolieren. Graph PRISM wird verwendet, um die Standardkurven darzustellen und Konzentrationen aus den hier gezeigten Dichtedaten zu ermitteln.Der universelle HA-Antikörper UNI one wies eine bemerkenswerte Spezifität für virale Sequenzen auf und kann an 13 verschiedene Influenza-Subtypen binden. Ein HA wurde aus ENT-toxischen Flüssigkeiten von virusinfizierten bebrüteten Hühnereiern extrahiert. Das NP-Protein dient als Ladekontrolle.Die negative Kontrolle ist ENT-Ohrenflüssigkeit von nicht infizierten Eiern, und die positive Kontrolle ist ein Referenzstandard von H ein von N-I-B-S-C. Die beobachteten Unterschiede in der Mobilität der HA-Proteine sind wahrscheinlich auf Variationen in ihrer Größe und/oder ihrem Verarbeitungsstadium zurückzuführen. Wie hier gezeigt, konnten die Antikörper HCA-Bindestrich-zwei und HCA-Bindestrich-drei gegen beide konservierten Epitope von NA an alle neun Subtypen von NA binden und zeigten sehr geringe Kreuzreaktivität gegenüber Alan Toic oder zellulären Proteinen. Die P-Protein-Kontrolle ist in Panel C dargestellt. Die positive Kontrolle ist Alan Toic-Flüssigkeit, angereichert mit R NA ein von Schrägstrich New Caledonia Schrägstrich 20 Schrägstrich 99, und mit den entsprechenden Antiseren untersucht; die NP-Protein-Kontrolle ist unten dargestellt.Dieses Bild zeigt repräsentative Ergebnisse, die den Ergebnissen der Quantifizierung des NA-Antigens im Referenzstandard für Influenza-Impfstoffen und in Impfstoffproben ähnlich sind. Die Dichteanalyse zeigte, dass die Intensität des Signals, das durch den Nachweis des NA-Antigens in verschiedenen Verdünnungen eines Impfstoff-Referenzstandards mittels Slot-Blot erhalten wurde, proportional zur Konzentration von NA ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Impfstoffproben vorzubehandeln, um sedimentierte Materialien aufzulösen und einen ordnungsgemäßen Abfluss aus dem Slot sicherzustellen.Besondere Sorgfalt ist ebenfalls erforderlich, um ein Austreten von Proben zwischen den Vertiefungen zu verhindern. Die Optimierung von Antikörperverdünnungen und Inkubationszeiten kann notwendig sein, wenn ein neuer Antikörper zur Detektion eingesetzt wird, um scharfe Signale idealer Intensität zu erhalten und gleichzeitig den Hintergrund nach der Entwicklung zu minimieren. Diese Technik ebnete Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Influenzaimpfungsforschung den Weg.Weitere zukünftige quantitative Analyse von HA- und NA-Antigenen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die wichtigen Oberflächenproteine von Influenzaviren in einfachen Assays ohne Verwendung von stammspezifischen Antikörpern quantifiziert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung von Escape-Varianten von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern des Influenzavirus. Antikörper-neutralisierte Virussuspension wird in embryonisierte Hühnereier injiziert, um Fluchtvarianten selektiv zu vermehren. Dies führt zu einer Viruspopulation, die überwiegend aus Escape-Varianten besteht, was durch einen Hämagglutinationsassay bestätigt wurde.

Entstehung von Influenzavirus-Escape-Varianten gegen neutralisierende Antikörper

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Influenza-Neuraminidase (NA) misst, die die Antikörpertiter in einer Serumprobe hemmt. Eine Serumprobe, die Antikörper gegen NA enthält, wird auf eine mit Fetuin beschichtete Mikrotiterplatte gegeben. Nach Zugabe des Virus verhindern die Antikörper, dass virale NA Fetuin spaltet und seine Galaktose-Einheit freilegt. Anschließend wird ein Peroxidase-konjugiertes Lektin zugegeben, das an die exponierte Galaktose bindet. Der NA-hemmende Antikörpertiter wird...

Ein Assay zur Messung von Antikörpertitern zur Influenza-Neuraminidase-Hemmung

Unter Verwendung einer gedruckten Glykan-Microarray-Strategie wurde ein konventioneller 96-Well-Plattenassay für die Analyse der Hämagglutinin-Avidität und Spezifität des Influenza-A-Virus für Sialinsäure-haltige Rezeptoren miniaturisiert.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Wir beschreiben den Enzyme-linked Lectin Assay (ELLA) zur Messung von Influenza-Neuraminidase (NA)-Inhibitions-Antikörpertitern in Seren. Der Assay verwendet Erdnuss-Agglutinin, um Galaktose-Rückstände zu quantifizieren, die zugänglich werden, wenn NA Sialinsäure von Fetuin-beschichteten 96-Well-Platten entfernt.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Diese Studie beschreibt ein   Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Wir beschreiben die Verwendung eines phänotypischen fluoreszenzbasierten Neuraminidase-Hemmt die Anfälligkeit von Influenza A und B Viren in die Neuraminidase-Hemmer Klasse von antiviralen Medikamenten zu beurteilen.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

Die vorgestellten Protokolle wird beschrieben, wie einen Hämagglutination Inhibition Assay Quantifizierung des Influenza-spezifischen Antikörper-Titer von Serumproben von Grippe-Impfstoff Empfängern durchführen. Der erste Test bestimmt optimale virale Antigen-Konzentrationen durch Hämagglutination. Die zweite Probe quantifiziert Influenza-spezifischen Antikörper-Titer Hämagglutination Inhibition.

Eine optimierte Hämagglutination Inhibition (HI) Assay, Influenza-spezifischen Antikörper-Titer zu quantifizieren

Wir beschreiben eine Methode mit der identifizieren wir kritische Rückstände für die Bindung von menschlichen oder murinen monoklonalen Antikörpern, die die virale Hämagglutinin der Influenza A-Viren Zielen erforderlich. Das Protokoll kann zu anderen Virus Oberfläche Glykoproteine und ihre entsprechenden neutralisierende Antikörper angepasst werden.

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Grippe neutralisierende Antikörper korrelieren mit dem Schutz der Influenza-Infektionen. Microneutralization Assays messen neutralisierende Antikörper im menschlichen Serum und dienen oft der menschlichen Grippe-Serologie. Wir beschreiben einen Microneutralization-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen um zu messen, neutralisierende Antikörpertiter zu zeitgenössischen 3C.2a und 3C.3a a/H3N2-Viren nach Influenza-Impfung oder Infektion.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Verwendung eines Protein-Mikroarrays, das durch den Druck von Influenza-Antigenen auf nitrozellulosebeschichtete Dias konstruiert wurde, um gleichzeitig Serum für mehrere Antikörper-Isotypen gegen über 250 Antigene aus verschiedenen Virusstämmen zu sonden, Messung der Breite von Serumantikörpern über Virussubtypen hinweg.

Verwendung eines Influenza-Antigen-Mikroarrays zur Messung der Breite von Serum-Antikörpern über Virussubtypen hinweg

Erfahren Sie, wie Sie Influenza-Hämagglutinin und Neuraminidase mit universellen Antikörpern in Slot-Blot-Assays quantitativ analysieren. Diese Methode ermöglicht präzise Viralprotein-Quantifizierung für die Impfstoffentwicklung.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays (Video) | JoVE Journal

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

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