Name: Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T09:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Erfahren Sie eine nicht-invasive Haarprobenahme zur Gewinnung hochwertiger DNA von scheuen Kleinsäugern wie dem Amerikanischen Pfeifhasen. Diese Methode ermöglicht genetische Analysen ohne Störung der Tiere.

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Wir möchten L. Evans, B. Granger, D. Rissling, Z. Sim, A. Goodwin, K. Hayhurst und D. Kuch für die Unterstützung im Bereich danken. K. Galbreath freundlicherweise zur Verfügung gestellt pika Leber Proben aus dem Bella Coola Tal. Vielen Dank an A. Gonçalves da Silva und K. Larsen für interessante Diskussionen, die das Design dieser nichtinvasiven genetischen Probenahmeverfahren beigetragen. Diese Arbeit wurde vom kanadischen Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery, und UBC Okanagan Individual Forschungsstipendien MAR finanziert. A Swiss National Science Foundation Doctoral Fellowship PBSKP3_128523 unterstützt PH. Diese Studie wurde im Anschluss an die Tierpflege-Protokoll von der University of British Columbia (: A07-0126-Zertifikat-Nummer) durchgeführt.

1. Haare Snare Vor dem Einrichten einer Schlinge, hat eine ideale Lage innerhalb des pika Lebensraum oder Geröllhalde bestimmt werden. Dazu gehören Heuhaufen, die Vegetation Caches, die Tiere zu sammeln im Spätsommer sowie frische scats bei Latrine Websites zu finden sind. Streifen aus Klebeband (10-50cm Länge) sind bis zu einer 360 °-klebrige Oberfläche bieten gerollt und sind in einem Web-Manier zum Umschlag der Eingang zum pika ist Heu Stapel (Abb. 1) oder Latrine Seite angeordnet. Abhängig von der Konfiguration der Felsen, kann ein Stück Angelschnur verwendet werden, um die Struktur des Haares Schlinge zu unterstützen, aber das ist oft nicht nötig, wenn Eingänge recht klein (&lt;30cm im Durchmesser) sind, eine vollständige Beschreibung des Einsatzes von Angelschnur in Henry und Russello (2010) 3 gefunden werden. Haare Fallen sind so oft wie möglich geprüft und Haarproben abgeschieden auf dem Band (Abb. 2) werden dann gesammelt und beschriftet. Sobald transportiert zurück ins Labor werden die Haare aus dem Klebeband mit einer sterilen Pinzette entnommen und in Kryoröhrchen und bei -20 ° C bis auf weiteres Manipulation. Haarproben gemeinsam auf ein Haar Snare Cluster werden als ein einzelnes Individuum gehören, während die Proben Cluster unabhängig davon ausgegangen werden, um verschiedene Individuen angehören. Im letzteren Fall ist das Haar dann in verschiedene Röhrchen. Diese Annahmen können später mittels DNA-Fingerprints und Berechnungen der Wahrscheinlichkeit von Identität auf Mikrosatelliten genotypischen Daten getestet werden. 2. DNA-Extraktion Da pika Haar ist sehr dünn und enthält eine winzige Wurzel Glühbirne, haben wir bereits gezeigt, dass ein Minimum von 25 Haare notwendig sind, um ausreichende Mengen an DNA für eine gute Qualität nachgeschalteten PCR-Amplifikation 3 zu erhalten. Wir verwendeten die DNA IQ-System (Promega, Madison, WI, USA) und eine leicht modifizierte Version des Herstellers für DNA-Isolierung aus Haarproben. Erstens ist die Haarprobe in einem Mikro-Zentrifuge geschleudert, um Haarausfall zu vermeiden, während dem Öffnen der Tube. Dann wird die Inkubation Lösung wird durch Mischen von 80 ul der Inkubationslösung mit 10 &amp;mgr; l von DTT (1M) und 10 &amp;mgr; l von Proteinase K (18ng/ml) in einer Endkonzentration von 0,1 M DTT und 1.8ng/ml von Proteinase K. Incubation Ergebnis vorbereitet Lösung (100 ul) wird auf die Probe zugegeben und bei 56 ° C für 1 Stunde. In der Zwischenzeit ist die Lyse-Lösung durch Zugabe von 1 ul der DTT (1M) für jeweils 100 ul Lysepuffer, was zu einer endgültigen DTT Konzentration von 0,01 M vorbereitet. Vorbereitet Lyse-Lösung (200 ul) wird dann auf die Probe gegeben, zusammen mit 7 ul der DNA IQ Harz, gevortext für 3 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit und bei Raumtemperatur inkubiert für 5 Minuten. Die Probe wird dann für 2 Sekunden gevortext und in die magnetische Halterung, wo die Trennung von magnetischen Kügelchen aus der Lösung auftritt. Die verbleibende Lösung wird dann abgesaugt und verworfen, darauf achten, daß das Pellet aus magnetischen Harz zu stören. Die Probe wird dann mit 100 ul der vorbereiteten Lyse-Lösung gevortext und wieder in die magnetische Halterung, wo die Trennung erfolgt wieder behandelt. Der Lysepuffer wird abgesaugt und verworfen, und dieser Schritt wird dreimal wiederholt mit einem Waschpuffer (100 ul). Die Probe wird anschließend links in die magnetische Halterung für 15 Minuten trocknen lassen. Nach dem Trocknen ist 100 ul Elutionspuffer auf die Probe zugegeben und bei 65 ° C für 5 Minuten. Die Probe wird verwirbelt und in die magnetische Halterung. Die Lösung enthält jetzt die eluierte DNA wird dann in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt und bei -20 ° C bis auf weiteres Manipulationen. DNA aus der Leber Proben wurde ebenfalls extrahiert mit der DNA IQ-System und als positive Kontrolle für die PCR-Amplifikationen. 3. PCR-Amplifikation Die DNA aus unserer nichtinvasiven Haar Snare und die Leber erhaltenen Proben wurden dann verwendet, um eine Reihe von häufig verwendeten molekularen Marker (Mikrosatelliten, AFLP, mitochondrialen Cytochrom B und ZFX / ZFY Geschlechtsbestimmung Marker) zu verstärken. PCRs wurden mit einem Veriti Thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in einem 25 ul Volumen enthält: 10 bis 20 ng DNA, 0,5 uM von jedem Primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTPs, 10 μ Rinderserumalbumin (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) und 0,5 U AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (Applied Biosystems). Radfahren Parameter für den Mikrosatelliten-Loci wurden optimiert mit einem Touchdown PCR-Programm (10 min bei 95 ° C, 35 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, 30 s Annealing und 45 s bei 72 ° C, durch einen letzten Schritt bei 72 ° C für 10 min). Die Annealingtemperatur um 1 verringert ° C pro Zyklus von 60 bis 55 ° C bis zum Erreichen des sechsten Zyklus, an welcher Stelle der 29 verbleibenden Zyklen bei 55 ° C. Radfahren Parameter für die mitochondriale Fragmente wurden wie oben beschrieben, aber bestand aus 35 Zyklen mit einer Glüh-Temperatur von 50 ° C. Amplified Fragment Length Polymorphism wurde nach dem Protokoll für Wirbeltier-Genomen von Bonin 4 beschrieben durchgeführt. Schließlich wurde molekularen Geschlechtsbestimmung durchgeführt unter Verwendung des PCR-RFLP von ZFX / ZFY loci mit HinfI Restriktionsenzymverdau 5. Die PCR-Produkte aus der Mikrosatelliten, AFLPs und Cytochrom B-Sequenzen wurden auf einem ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) laufen, während verdaut ZFX / ZFX Fragmente neben einem 100 bp Leiter (New England Biolabs) auf einem 3% Agarosegel mit ausgeführt wurden 2,5% SYBR Sicherer DNA-Gel-Färbung (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und visualisiert mit einer RED persönlichen Gel Imaging System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Mikrosatelliten und AFLPs wurden mittels GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) und die mitochondriale DNA Chromatogramm wurde unter Verwendung Sequencher v4.7 (Gene Codes Corporation, Ann Harbour, MI, USA). 4. Repräsentative Ergebnisse Die DNA aus Haarproben unter Verwendung unserer nichtinvasiven Snare extrahiert wurden verwendet, um PCR zu amplifizieren verschiedenen Typen von molekularen Markern. Als Grundlage für den Vergleich, extrahierten DNA mit Leberproben neben unseren Haarproben wurde verstärkt. Nuclear Mikrosatelliten-Loci wurden erfolgreich sowohl für Haare und Leber-Proben (Abb. 3) verstärkt. Obwohl die Intensität des Signals war größer, wenn Sie die Leberproben, tat dies keinen negativen Einfluss auf Genotyp Scoring (Abb. 3). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn AFLPs (Abb. 4), mitochondriale DNA-Sequenzen (Abb. 5), und der ZFX / ZFY molekularen Geschlechtsbestimmung Marker (Abb. 6). <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein Beispiel für eine nicht-invasive Haar Snare eingerichtet in einem Heu Stapel. Strips von aufgerollt klar Klebeband sind in einem Web-artig an den Eingang, um das Heu Stapel legen angeordnet. Ein Stück Angelschnur ist hier, um zusätzliche Unterstützung für die Haare Snare bereitzustellen. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Eine erfolgreiche Haar Schlinge mit einer großen Anzahl von Haaren klebte an das Klebeband. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Ein Vertreter nuklearen Mikrosatelliten-Chromatogramm (Ocp6) 8 als in GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) angezeigt. Die obere Chromatogramm wurde durch Amplifikation von DNA aus Lebergewebe gewonnen und ist heterozygot (354/358) an diesem Locus. Die untere Chromatogramm repräsentiert eine andere Person ausstellen einem heterozygoten Genotyp (358/362) auf die DNA aus Haaren extrahiert wurden. Während das Signal des Chromatogramms aus der Haarprobe hat eine geringere Intensität als die Leber Probe wird Genotyp Scoring nicht durch diesen Unterschied im Signal betroffen. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Ein Vertreter AFLP Chromatogramm (E31T32) als in GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) angezeigt. Die obere Chromatogramm durch Amplifikation von DNA aus Lebergewebe gewonnen wurde, stellt die untere Chromatogramm der DNA aus Haaren extrahiert. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Ein Vertreter mitochondriale DNA-Sequenz-Chromatogramm (Cytochrom B) wie in Sequencher v4.7 (Gene Codes Corporation) angezeigt. Die obere Chromatogramm durch Amplifikation von DNA aus Lebergewebe gewonnen wurde, stellt die untere Chromatogramm der DNA aus Haaren extrahiert. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Ein Vertreter molekularen Geschlechtsbestimmung Marker (ZFX / ZFY) sowohl für Leber-und Haarproben verstärkt. Dieser Ansatz beruht auf der Beobachtung, dass die Y Chromosom ein HinfI Restriktionsschnittstelle in dieser Region, dem X-Chromosom fehlt besitzt. So produzieren Weibchen zwei Co-Migration Fragmente von 432 bp, während männliche Fragmente von 432 bp, 261 bp und 171 bp produzieren.

<ol><li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildlife+Manage%22%5BJournal%5D)">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li>
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</ol>

Nichtinvasive genetische Probenahme hat sich zu einer attraktiven Alternative zu herkömmlichen Live Fangmethoden aus mehreren Gründen. Erstens, indem unauffällig Sammeln biologischem Material (zB Kot, Haare, Federn, Speichel und Schleim) aus Wildpopulationen, können die Forscher diese Arten ohne störende Studie, Handhabung, oder gar sie zu beobachten, damit die Risiken für Tiere und Forscher. Zweitens ermöglicht nicht-invasive genetische Probenahme Biologen die Bevölkerung auf schwer fassbare und seltene Arten, eine Aufgabe, die sich als schwierig erweisen mit mehr traditionelle Live-trapping Ansätze 6 können zu studieren. Und drittens kann NGS potenziell erhöhen Stichprobengrößen durch Reduzierung Störung von Tieren, die Probenahme Anstrengungen und Kosten und hilft so zu minimieren Verzerrungen bei der Schätzung der Bevölkerung Parameter 7. Dieser letzte Punkt kann entscheidend sein im Umgang mit bedrohten Arten, da verzerrten Schätzungen der Bevölkerung Parameter in einer unangemessenen Verwaltung führen kann. Im vorliegenden Video-Artikel beschreiben wir eine einfache, neue, kostengünstige und nicht-invasive Methode, um schwer fassbare kleine Säugetiere Probe, mit der American Pika als Beispiel. Wir zeigen, dass DNA aus Haaren extrahiert führt ähnlich wie DNA aus der Leber Proben im Hinblick auf Mikrosatelliten, AFLP, Mitochondrien und Geschlechtsbestimmung Marker extrahiert, so dass diese nicht-invasive Probenahme eine attraktive Alternative zum Einfangen oder tödliche Probenahme leben. Insgesamt erwarten wir, dass diese Methode wird in der Datensammlung Stadium der populationsgenetische und Verhaltensstudien von seltenen oder schwer zu kleine Säugetierarten nützlich, bei gleichzeitiger Minimierung der Auswirkungen auf die Organismen unter-Studie.

Haare Snare: <ul><li> Rolls klarer Klebeband (3M, St. Paul, MN, USA) </li><li> Angelschnur (10lb) </li><li> Kryo-Röhrchen (2 ml) </li><li> Sterile Pinzette </li><li> Flüssiger Stickstoff Dewar (optional) </li></ul> DNA-Extraktion: <ul><li> DNA IQ System (Kat. Nr. DC6701, Promega) mit dem Gewebe und Haare Extraktion Kit (Kat. Nr. DC6740, Promega). </li><li> MagneSphere Technologie Magnetic Separation Stand (Kat. Nr. Z5342, Promega) </li><li> Micro-Zentrifuge </li><li> Hybridisierungsofen oder im Wasserbad </li><li> 1,5 ml Eppendorf Tubes </li></ul>

ein nicht-invasives haar sampling-technik, um high quality dna aus elusive kleinsäuger erhalten

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Nichtinvasive genetische Probenahme Ansätze werden immer wichtiger, um Wildbestände zu studieren. Eine Reihe von Studien haben berichtet, unter Verwendung nichtinvasiver Stichprobenverfahren zur Populationsgenetik und Demographie der Wildpopulationen 1 Untersuchen. Dieser Ansatz hat sich als besonders nützlich, wenn es sich um seltene oder schwer Spezies 2. Während eine Reihe dieser Methoden auf Probe Haare, Kot und andere biologische Material aus Fleischfresser und mittelgroße Säugetiere entwickelt haben, haben sie blieben weitgehend ungetestet in schwer fassbaren kleinen Säugetieren. In diesem Video präsentieren wir eine neue, kostengünstige und nicht-invasive Haar Schlinge um einen schwer fassbaren kleines Säugetier, das amerikanische pika (Ochotona princeps) ausgerichtet. Wir beschreiben die allgemeinen Aufbau des Haares Schlinge, die aus Streifen von Klebeband in einem Web-artig angeordnet und platziert neben Reiserouten in die Pfeifhasen &quot;Lebensraum besteht. Wir illustrieren die Effizienz der Schlinge zu sammeln eine große Menge an Haaren, die dann gesammelt werden können und ins Labor gebracht. Wir haben dann demonstrieren die Verwendung der DNA-IQ-System (Promega), um DNA zu isolieren und zeigen die Nützlichkeit dieses Verfahrens auf häufig verwendete molekulare Marker einschließlich der nuklearen Mikrosatelliten, Amplified Fragment Length-Polymorphismen (AFLPs), mitochondriale Sequenzen (800bp) sowie Verstärkung eines molekulare Geschlechtsbestimmung Marker. Insgesamt zeigen wir den Nutzen dieser neuartigen nicht-invasiven Haar Snare wie ein Verfahren zur Probenentnahme für die Tierwelt Bevölkerung Biologen. Wir gehen davon aus, dass dieser Ansatz wird für eine Vielzahl von kleinen Säugetieren, Öffnung Bereichen Untersuchung innerhalb natürlicher Populationen, bei gleichzeitiger Minimierung der Auswirkungen auf die Studie Organismen.

Wir präsentieren ein nicht-invasives Vorgehen bei der Probennahme, um effizient zu sammeln Haarproben von schwer fassbaren kleinen Säugetieren, wie für den amerikanischen pika gezeigt. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode durch Extraktion von DNA aus Proben Haar und verstärkt verschiedene Arten von molekularen Markern häufig in Studien für Wildtierkunde und Ökologie und Naturschutz eingesetzt.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Nichtinvasive genetische Probenahmen gewinnen für die Untersuchung von Wildtierpopulationen zunehmend an Bedeutung. In einer Reihe von Studien wurde die Verwendung von ... berichtet.

Wildtiergenetiker verwenden zunehmend nicht-invasive Probenahmestrategien, um Daten von ihren interessierenden Arten zu gewinnen. Solche Ansätze haben sich als nützlich erwiesen, um Fragen im Zusammenhang mit Tierverhalten, Population, Demografie und Genetik zu untersuchen, insbesondere bei seltenen und scheuen Tieren. Durch die ferngesteuerte Sammlung biologischer Materialien wie Haare können Forscher Tiere untersuchen, ohne sie zu stören, zu verletzen oder ihre interessierenden Arten überhaupt beobachten zu müssen. Während diese Techniken hauptsächlich bei mittelgroßen bis großen Raubtieren wie Grizzlys angewandt wurden, wurde bisher weniger Aufwand unternommen, um kleinere pflanzenfressende Säugetiere zu erfassen, um diese Lücke zu schließen.Neuartige, innovative Ans&auml;tze zur Probenahme bei kleinen S&auml;ugetieren werden entwickelt. Dieser Videoartikel beschreibt eine neue und innovative Methode, um unauff&auml;llig Haarproben von kleinen Hasenartigen, den Amerikanischen Pfeifhasen, zu gewinnen. Diese kleinen S&auml;ugetiere kommen in den gesamten nordamerikanischen Bergregionen von New Mexico und Kalifornien bis nach zentralem Britisch-Kolumbien vor.Sie bewohnen felsige Geröllhalden, die als Tala-Schrägungen bezeichnet werden und Schutz vor Räuberbedrohung sowie vor extremen Umweltbedingungen bieten. Gewöhnlich werden sie in der südlichen Region ihres Verbreitungsgebiets in Höhenlagen von mehr als 2.500 Metern über dem Meeresspiegel angetroffen, können jedoch im nördlichsten Teil ihres Verbreitungsgebiets auch auf Meereshöhe vorkommen. Murmeltiere halten keinen Winterschlaf.Sie sind im Sommer tagsüber aktiv, konzentrieren ihre Aktivität jedoch auf die Morgen- und Abendstunden. Bei kühleren Temperaturen wagen sie sich in Wiesen angrenzend an den Tali-Hang vor, um an benachbarter Vegetation zu fressen. Eine Besonderheit des PIKA ist, dass es seine Nahrung nicht einfach im Freien isst.Es bringt es in sein Territorium in den Tallis zurück und lagert es in Heuhaufen ein. Obwohl die Art leicht nachweisbar ist, ist sie von Natur aus scheu und meidet oft Lebendfallen, die von Forschern aufgestellt wurden. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Pelzhasen empfindlich auf Handhabung reagieren, was zum Tod des Tieres führen kann, um eine Reihe ökologischer, verhaltensbezogener und evolutionärer Fragen zu untersuchen.Bei dieser schwer fassbaren kleinen Säugetierart, unter gleichzeitiger Minimierung des Störungseffekts, hat der Doktorand Philippe Henry vom Okanagan-Campus der University of British Columbia eine nicht-invasive Probennahmetechnik entwickelt, die gut für die Art geeignet ist. Bevor er eine Falle aufstellt, sucht er nach Hinweisen auf aktive PIKA-Territorien an der Tallis-Hanglage. Dazu gehören Heuhaufen, also Pflanzenvorräte, die das Tier im Spätsommer sammelt, um damit den Winter zu überleben, sowie frische Exkremente.Das kommt gewöhnlich an bestimmten großen Standorten vor. Sobald innerhalb des TLU ein potenzieller Lebensraumgipfel identifiziert wurde, wird eine Haarfalle strategisch über dem Eingang platziert. Mithilfe einer Packbandrolle rollt Philippe geschickt Streifen des Bandes und arrangiert sie sternförmig, um sie zu umhüllen.Die Eingänge der Versteckfallen weisen aufwendige Designs auf, die eine Öffnung schaffen, die weder zu groß noch zu klein ist, damit das Tier hindurchschlüpfen kann. Theoretisch durchquert eine Murmel dann die Schlinge, wobei sie eine Probe ihres Haares hinterlässt, und setzt ungestört ihre täglichen Aktivitäten fort. Das Haar selbst ist sehr fein und besitzt eine kleine Wurzelknolle.Um eine geeignete Probe für die Analyse zu erhalten, werden mindestens 25 Haare desselben Individuums benötigt. Die Auftreffstellen müssen außerdem entlang des Klebebands deutlich voneinander getrennt sein. Haare, die unabhängig voneinander gruppiert sind, werden als separate Individuen angenommen.Während angenommen wird, dass zusammenhängende Haare identisch sind, können die gesammelten Haare anschließend vorsichtig mit sterilen Pinzetten von dem Klebeband entfernt werden, ohne die Struktur der Probe zu beschädigen, insbesondere die Haarwurzel, die die höchste Konzentration an nukleärer DNA enthält. Danach wird das Haar sorgfältig in ein zwei Milliliter fassendes kryogenes Röhrchen gegeben und im Flüssigstickstoffbehälter aufbewahrt, bis die Probe ein Labor für weitere Analysen erreicht. Im Labor wird die Haarprobe in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert, um Verluste beim Öffnen des Röhrchens zu vermeiden. Die DNA wird aus den Haarproben mithilfe des Promega DNA IQ-Systems extrahiert. Der erste Schritt beinhaltet die Herstellung einer Lösung, die 100 Mikroliter Inkubationspuffer, 1,8 Milligramm pro Milliliter Proteinase K und 0,1 molare DTT enthält.Anschließend werden 100 Mikroliter der Inkubationslösung zum Haar gegeben und eine Stunde lang bei 56 Grad Celsius inkubiert. Die Probe wird dann mit 200 Mikrolitern Puffer zur Zelllyse bearbeitet, der 0,01 M DTT und sieben Mikroliter resuspendiertes DNA-IQ-Harz enth&auml;lt. Die Probe wird anschlie&szlig;end drei Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit verwirbelt und f&uuml;nf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.Die verdauete Probe wird anschließend zwei Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit verwirbelt und in eine magnetische Trennhülse gegeben. Zu diesem Zeitpunkt werden die magnetischen Harzpartikel, die DNA-Fragmente enthalten, sofort von der Lösung getrennt und bilden ein Pellet am Boden des Röhrchens. Die verbleibende Lösung wird daraufhin entfernt und entsorgt.Anschließend wird die Probe erneut mit 100 Mikrolitern Lysepuffer vortexiert und zurück auf den Magnethalter gestellt, wo die Trennung erfolgt. Derselbe Schritt wird danach dreimal nacheinander mit einem Waschpuffer wiederholt. Nach der letzten Wäsche wird die Probe 15 Minuten lang zum Trocknen im Magnethalter belassen.Dann werden 100 Mikroliter Elutionspuffer zur Probe gegeben und bei 65 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubiert. Abschließend wird die Probe zwei Sekunden lang verwirbelt und auf den magnetischen Ständer gestellt. Die DNA-Lösung wird anschließend in ein 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen überführt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert.Bis zur weiteren Analyse: Mein Name ist Peter Bohi. Ich bin Doktorand im Labor für Ökologische und Konversationsgenomik von Dr. Michael Rosso am Okanagan-Campus der University of British Columbia. Die aus den Haaren, die wir diesen Sommer gesammelt haben, extrahierte DNA wurde anschließend verwendet, um mittels PCR verschiedene Arten molekularer Marker zu amplifizieren.Wir verwendeten außerdem Leberproben als positive Kontrolle und Grundlage. Zum Vergleich unserer Methode amplifizierten wir nukleäre Mikrosatelliten-Loci, die zur Untersuchung der Populations- und genetischen Struktur unseres Tieres verwendet werden, sowie A-FLP-Genomscans, die zur Untersuchung der genetischen Grundlage der Anpassung entlang eines Höhengradienten eingesetzt werden. Außerdem amplifizierten wir mitochondriale DNA-Sequenzen von bis zu 800 Basenpaaren, die zur Untersuchung der Phylogeographie der Art verwendet werden können, und wandten das molekulare Geschlechtsbestimmungswerkzeug basierend auf Zinkfinger-Sequenzen und PCR-RFLP an, um das Geschlecht der Individuen in unseren Populationen zu identifizieren.Bei allen getesteten Markern ergaben DNA-Proben, die aus Haar- und Leberproben gewonnen wurden, vergleichbare Niveaus hinsichtlich Sequenz- und Genotypqualität. In diesem Video haben wir gezeigt, dass diese nicht-invasive Probennahmemethode in Kombination mit dem DNA-IQ-Extraktionsprotokoll wirksam ist, um ausreichende Mengen an Haaren zu gewinnen, die DNA in ausreichender Qualität und Quantität für die PCR-Amplifikation liefern. Insgesamt erwarten wir, dass diese Methode nützlich sein wird, um Datensammlungen für Populations-, Genetik- und Verhaltensstudien seltener oder schwer fassbarer Kleinsäuger zu erleichtern, während gleichzeitig die Auswirkungen auf die untersuchten Arten minimiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Die Direct PCR hier vorgestellte Ansatz ermöglicht PCR-Amplifikation direkt von kleinen Mengen von ungereinigten pflanzlichen und tierischen Gewebe.

Genotypisierung von Pflanzen und Tieren Proben ohne vorherige DNA-Aufreinigung

Gewebe-spezifische Analyse von einem Haarfollikel Regeneration Modell mit Lentivirus, um Gewinn-oder Verlust-of-function vermitteln.

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Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

Hier beschreiben wir eine optimierte und effiziente Entfernung Strategie für die Sammlung von in der heutigen Bio-Partikel 'berühren DNA' Proben, zusammen mit einer verbesserten Amplifikationsprotokoll mit einem einstufigen 5 ul Mikrovolumen Lyse / STR Verstärkung, um die Erholung der erlauben Short Tandem Repeat (STR) Profile der Bio-Korn Spender (n).

Erweiterte Genetische Analyse der Einzelmenschen Biopartikeln von Simplified Mikromanipulation von Forensic &#39;Touch DNA&#39; Evidence Recovered

In diesem Artikel zeigen wir wie die absorbierenden Microbiopsy-Technik durchgeführt wird und wie die Probe für die RNA-Extraktion für einfache und gleichzeitige Probenahme von Haut und Blut in einer minimal-invasive Weise verwendet werden kann.

Saugfähige Microbiopsy Probenahme und RNA-Extraktion für Minimal-Invasive, gleichzeitige Blut und Hautanalyse

Dies ist ein Protokoll für die optimale Gewebevorbereitung für genomische, transkriptomische und proteomische Analysen von Fledermäusen, die in freier Wildbahn gefangen sind. Es enthält Protokolle für Fledermaus-Capture und -Sektion, Gewebekonservierung, und Zellkultivierung von Fledermausgewebe.

Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur

Das aktuelle Protokoll stellt eine schnelle, effiziente und schonende Methode zur Isolierung einzelner Zellen dar, die für die Einzelzell-RNA-seq-Analyse aus einem kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahn, Mausmollaren und menschlichen Zähnen geeignet sind.

Schnelle Isolierung einzelner Zellen aus Maus- und menschlichen Zähnen

Das Protokoll präsentiert eine Reihe von Best-Practice-Protokollen für die Sammlung von Knochenpulver von acht empfohlenen anatomischen Probenahmestellen (spezifische Stellen an einem bestimmten Skelettelement) über fünf verschiedene Skelettelemente von mittelalterlichen Individuen (Radiokarbon datiert auf einen Zeitraum von ca. 1040-1400 CE, kalibrierter 2-Sigma-Bereich).

Optimierte Knochenprobenahmeprotokolle für die Gewinnung alter DNA aus archäologischen Überresten

Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll für die nichtinvasive genetische Probenahme von Schmetterlingspopulationen, die auf der Feldsammlung von Resteierresten basiert. Es kann verwendet werden, um die Identität von Arten zu bestätigen und genetische Variation zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann leicht an breitere Gruppen für die Beteiligung der Community Science angepasst werden.

Einsatz von Community-Wissenschaftlern zur Durchführung zerstörungsfreier genetischer Probenahmen seltener Schmetterlingspopulationen

Erfahren Sie eine nicht-invasive Haarprobenahme zur Gewinnung hochwertiger DNA von scheuen Kleinsäugern wie dem Amerikanischen Pfeifhasen. Diese Methode ermöglicht genetische Analysen ohne Störung der Tiere.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

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