Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung der Invasion einer Endothelzell-Monoschicht durch Krebszellen unter Verwendung einer auf elektrischer Impedanz basierenden Echtzeittechnik. Zunächst werden humane Endothelzellen der Nabelschnurvene, die als VE bezeichnet werden, in 16-Well-EPLs platziert, die am Boden der Vertiefung mit Goldelektroden beschichtet sind. Um eine konfluente Monoschicht zu erzeugen, werden Krebszellen hinzugefügt, die sich an die VE anlagern und in die HVAC-Monoschicht eindringen, wodurch die Endothelzellübergänge gestört werden. Anschließend werden Impedanzwerte erfasst, die von der Gesamtfläche des von Zellen bedeckten Vertiefungsbodens abhängen.

Das Ausmaß der Invasion kann dann anhand von Änderungen der elektrischen Impedanz bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik oder bestehender Methoden, wie z. B. Void-Chamber- und METROGEL-Assays, besteht darin, dass die Interaktionen zwischen Endothelzellen und Tumorzellen den in vivo Metastasierungsprozess besser nachahmen, und die Daten in Echtzeit erhalten werden und im Gegensatz zur Endpunktanalyse bei anderen Methoden leichter quantifizierbar sind. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Invasion von Krebszellen geben.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Untersuchung von Zellinteraktionen im Immunsystem. Darüber hinaus kann die erste Phase des Experiments, in der wir das Wachstum von UX-Zellen beobachten, verwendet werden, um die Zellproliferation jeder Zelllinie ohne weitere Invasionsschritte zu bewerten. Alle Schritte dieses Protokolls sollten unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube durchgeführt werden.

Das für dieses Experiment verwendete Xcel-System wird dauerhaft in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid aufbewahrt, der bei der ersten Verwendung ausschließlich für dieses Instrument bestimmt ist. Das Gerät sollte mindestens 16 Stunden lang im Inkubator belassen werden, um sich an die neue Temperatur- und Feuchtigkeitsumgebung anzupassen. Bereiten Sie anschließend Thence EPL 16 zu, indem Sie es eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 0,1 % Gelatine bestreichen.

Sobald die Platte beschichtet ist, waschen Sie sie einmal mit PBS. Fügen Sie dann 100 Mikroliter rekonstituiertes e gm two Medium hinzu, um eine Blindablesung durchzuführen. Zur Messung der Hintergrundimpedanz in Abwesenheit von Zellen.

Platzieren Sie die EPL im Excel-Agentensystem auf dem Computer. Öffnen Sie die Excel-Agent-Software, indem Sie auf dem Desktop im Softwarefenster auf das RTCA-Softwaresymbol klicken. Klicken Sie auf die Registerkarte Layout und wählen Sie die Vertiefungen mit den Proben aus.

Um die Häufigkeit der Echtzeit-Datenerfassung zu programmieren. Klicken Sie auf die Registerkarte Zeitplan und dann auf das Symbol Schritt hinzufügen: Sweeps zeigt die Anzahl der Messwerte und Intervalle das Zeitintervall zwischen den Messwerten an. Diese werden automatisch auf eine bzw. 1,00 Minute eingestellt.

Dadurch wird das System so programmiert, dass es eine Hintergrundlesung durchführt. Klicken Sie auf Schritt hinzufügen und geben Sie 300 in das Feld "Sweeps" und 10 Minuten in das Feld "Intervalle" ein. Dadurch wird das Gerät so programmiert, dass es Impedanzmessungen für bis zu 50 Stunden durchführt.

Um das Experiment zu starten, klicken Sie auf das Symbol Schritt starten. Die Hintergrundimpedanz jedes Brunnens wird gemessen, nachdem die Hintergrundmessung durchgeführt wurde. Das Fenster zeigt die Meldung an.

Bereit für den nächsten Schritt, bitte klicken. Nächster Schritt, um zu beginnen. Zu diesem Zeitpunkt können Zellen hinzugefügt und die Bildung einer Monoschicht wie beschrieben überwacht werden.

Im nächsten Abschnitt werden die hier verwendeten menschlichen Nabelvenen, Endothelzellen oder VE in EGM 2-Medium kultiviert, das mit dem EGM-Kit mit zwei Kugeln rekonstituiert wurde, das Wachstumsfaktoren-Ergänzungen enthält, und 5%FBS-Zellen sollten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator in Gegenwart von 5%igem Kohlendioxid aufbewahrt werden. Überprüfen Sie am Tag des Experiments die Kofluenz von HUB E Unter dem Mikroskop sollten die Zellen eine niedrige Durchgangszahl haben, vorzugsweise nicht mehr als sechs und weniger als 75 % Confluent, um einen Farbton zu erzeugen, Monolayer-Ernte der Zellen durch Trypsin. Sobald sich die Zellen vom Kolben gelöst haben, sollten alle Spuren von Trypsin durch Zentrifugation bei 200 G entfernt werden. Nach dem Schleudern werden die Zellen einmal mit PBS gewaschen.

Dann resuspendieren die Zellen und rekonstituieren e GM zwei Medien bis zu einer Konzentration von 2,5 mal 10 auf die fünften Zellen pro Milliliter. Sobald die Zellen resuspendiert sind, entfernen Sie das kalibrierte Hintergrund-EPL aus dem EXOGEN-System und fügen Sie 100 Mikroliter der HX-Suspension zu den 100 Mikrolitern E GM hinzu, die sich bereits in der Platte befinden. Legen Sie den EPL sofort in den Zellanalysator des Excel-Systems.

Beginnen Sie mit der Erfassung von Impedanzmesswerten, indem Sie auf die Schaltfläche "Startschritt" im Softwarefenster klicken. Lassen Sie die Endothelzellen wachsen. Das System misst weiterhin alle 10 Minuten die Impedanz.

Die Uve zeigen eine charakteristische vorübergehende Abflachung des Zellindex vier bis sechs Stunden nach der Aussaat, gefolgt von einer weiteren Stabilisierung nach 16 bis 18 Stunden. Daher ist es wichtig, die Zellen mindestens 18 Stunden lang eine konfluente Monoschicht bilden zu lassen. Sobald sich eine Monoschicht gebildet hat, ist es an der Zeit, die eindringenden Zellen zur Vorbereitung des Invasionsassays hinzuzufügen.

Bereiten Sie die eindringenden Tumorzellen vor. Hier kommen Osteosarkomzellen zum Einsatz. Beginnen Sie mit der Ernte der Zellen mit Trypsin.

Entfernen Sie alle Spuren von Trypsin, indem Sie die Zellen bei 200 g schleudern und einmal mit PPS waschen. Nach dem Wash Reus suspendieren Sie die Zellen mit einer Enddichte von eins mal 10 bis 10 Zellen pro Milliliter in dem Medium, das zum Züchten der Tumorzellen verwendet wird, wie z. B. RPMI- oder DMEA-Medium mit 10 % FBS. Halten Sie das Experiment an, indem Sie im Softwarefenster auf das Symbol für den Pausenschritt klicken.

Entfernen Sie das EPL und saugen Sie das EGM-Zwei-Medium aus der Vac-Monoschicht ab. Geben Sie 100 Mikroliter Tumorzellsuspension, die eine mal 10 enthält, zu den vierten Zellen. Im Allgemeinen eignet sich ein Verhältnis von 1 zu 2,5 Tumorzellen zu Endothelzellen am besten für den Assay.

Das Verhältnis kann jedoch für einzelne Zelllinien optimiert werden. Platzieren Sie die EPL wieder im Excel-Agentensystem im Inkubator. Klicken Sie auf den Schritt Weiter, um mit der Messung der Impedanz in 10-Minuten-Intervallen fortzufahren.

Überwachen Sie die Invasion in den nächsten sechs bis 12 Stunden in Echtzeit. Ein Abfall des Zellindex resultiert aus der Retraktion der Endothelverbindungen und der Penetration durch eindringende Tumorzellen. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, verwenden Sie die exergen-Software, um die Ergebnisse auf den Zeitpunkt der Hinzufügung von eindringenden Tumorzellen zu normalisieren.

Die Exergen-Software ermöglicht eine Normalisierung auf jeden beliebigen Zeitpunkt, zu dem VEX auf dem Exergensystem kultiviert wurde, wie in diesem Video gezeigt, und nach der Bildung der Monoschicht wurden entweder K sieben M zwei Zellen oder K 12 Zellen hinzugefügt. Wie hier gezeigt, kommt es innerhalb weniger Stunden nach der Einführung von K sieben M zwei Zellen zu einer starken Abnahme des Zellindex. K seven M two ist eine hochmetastasierte Osteosarkom-Zelllinie.

Diese Zellen exprimieren hohe Spiegel des zytoskelettalen Linkerproteins en, was für die invasiven Eigenschaften der Zelllinie verantwortlich ist. K12-Zellen hingegen sind weniger metastasiert und können die endotheliale Monoschicht nicht so effizient durchdringen wie K-7-M-Zwei-Zellen. Dies wird durch eine weniger starke Abnahme des Zellindex dargestellt, wie hier gezeigt.

Der hier gezeigte Regler stellt die Impedanz der uve-Monolage dar. In Abwesenheit von Krebszellen wurden die Experimente in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Invasion in Echtzeit messen können, indem Sie eine Endothelzell-Monoschicht erzeugen und die Monoschicht mit Krebszellen herausfordern.

Erste Schritte des Experiments zur Bildung von HU XL-Monoschichten können verwendet werden, um die Zellproliferation anhand der Impedanz zu bewerten. Zwei.