Name: Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Erfahren Sie eine Echtzeit-Impedanzmethode zur Messung von Krebszell-Invasion durch Endothelzell-Monolayer. Diese Technik mit HUVECs liefert quantitative Daten zu metastaseähnlichen Zellinteraktionen.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Kinder-Krebs-Stiftung (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) und NIH (R01CA108641) unterstützt. Wir möchten Dr. Anton Wellstein und Mitglieder seines Labors für den Austausch ihrer Erfahrungen und helfen uns, präsentiert Methoden optimieren danken.

1. Vorbereitung <ol><li> Alle Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube erfolgen. </li><li> Die xCELLigence Station in einem 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2 gestellt. </li><li> Verwenden Sie einen niedrigen Durchgang HUVEC Zellen, vorzugsweise nicht mehr als Durchgang 6. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zellen nicht mehr als 75% konfluent zum Zeitpunkt der Ernte sind. </li><li> HUVEC-Zellen werden in EGM-2-Medien rekonstituiert mit EGM-2 Kugel Kit (Lonza Biosciences), enthaltend Wachstumsfaktoren, Ergänzungen und 5% fötalem Rinderserum. </li><li> Alle Spuren von Trypsin sollte aus Zellsuspensionen durch Spinnen Zellen bei 200 × g, einmaligem Waschen mit PBS und Resuspendieren sie angezeigt Zelldichten entfernt werden. </li><li> Coat xCELLigence E-16 mit 0,1% Gelatine für 1 Stunde bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° C. Waschen Platte mit PBS und fügen Sie 100 ul rekonstituierten EGM-2-Medien. Führen Sie eine leere Lesung zu dem xCELLigence System Hintergrund messenImpedanz in Abwesenheit von Zellen. </li></ol> 2. Generieren HUVEC Monolayer <ol><li> Ernte ein subkonfluenten Flasche HUVEC Zellen durch Trypsin. Die Zellen in rekonstituierten EGM-2-Medien zu einer endgültigen Dichte von 2,5 x 10 5 Zellen / ml. </li><li> Zu jeder Vertiefung einer kalibrierten Hintergrund E-Platte mit 100 ul EGM-2-Medien, fügen 100 ul der HUVEC Zellsuspension (2,5 x 10 4 HUVEC-Zellen). </li><li> Installieren Sie sofort E-Platte xCELLigence Instrument. </li><li> Programm xCELLigence Software Impedanz Messungen in 10-minütigen Abständen durchzuführen. </li><li> Lassen Sie die Endothelzellen wachsen für 18-21 Stunden, bis sie eine Monoschicht bilden, wie durch eine Abflachung der Zelle Index (Abbildung 2) zeigt. </li></ol> 3. Die Zugabe von eindringenden Zellen und Daten Normalisierung. <ol><li> Sobald ein stabiler HUVEC Monolayer gebildet hat, Ernte Tumorzellen durch Trypsinisierung und resuspendieren zu einer endgültigen denskeit von 1 x 10 5 Zellen / ml in Medium verwendet werden, um Tumorzellen (zB RPMI oder DMEM-Medium, enthaltend 10% FBS) wachsen </li><li> Pause Impedanz Lesungen auf dem xCELLigence Software und entfernen Sie E-Platte vom Bahnhof entfernt. </li><li> Entfernen EGM-2-Medien durch Aspiration. In 100 ul von Tumor-Zell-Suspension mit 1 x 10 4 Zellen. Im Allgemeinen wird ein 1:2,5 Verhältnis von Tumorzellen: funktioniert Endothelzellen ausgesät, am besten für den Test. Jedoch kann das Verhältnis der einzelnen Zelllinien optimiert werden. </li><li> Legen Sie die E-Platte auf dem xCELLigence System in den Inkubator und weiter Impedanz Messungen bei 10 Minuten-Takt. </li><li> Invasion können in Echtzeit über die nächsten 6-12 Stunden werden wie ein Tropfen in Zelle Index durch das Zurückziehen des endothelial Kreuzungen und das Eindringen von eindringenden Tumorzellen überwacht. </li><li> Normalisieren Ergebnisse der Zeitpunkt der Zugabe des eindringenden Tumorzellen. Die Software erlaubt die Normalisierung xCELLigence zu jedem Zeitpunkt und Ergebnissekönnen direkt in der Software-Fenster angezeigt werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für HUVEC Monoschicht Invasion durch metastatischen und nicht-metastatischen Zellen ist in Fig. 3 gezeigt. K7M2 ist ein metastasierendem Osteosarkom-Zelllinie. Diese Zellen exprimieren hohe Mengen des Zytoskeletts Linkerprotein Ezrin, welche Konten für die invasive Eigenschaften dieser Zelllinie 13,14. Wenn HUVEC Zellen mit K7M2 Zellen sind herausgefordert, es ist ein Tropfen im elektrischen Widerstand innerhalb von 6 Stunden. Dieser Rückgang des elektrischen Widerstandes stellt die Invasion von HUVEC Monolayer von den eindringenden Tumorzellen. Die K12-Zelllinie, auf der anderen Seite, drückt deutlich geringeren Ezrin und ist somit weniger metastasierendem 13. Die Anfechtung der HUVEC Monolayer mit K12-Zellen führt zu einem weniger starken Rückgang der Widerstand, wenn die Zellen nicht in der Lage, um zu haften oder dringen durch die HUVEC Monolayer (Abbildung 3). <imgsrc files alt='"1"'></imgsrc> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Workflow-Prozess für die Invasion von Endothelzellen durch Tumorzellen. HUVEC-Zellen auf mit Gelatine beschichtete E-Platten ausplattiert und eine Monolayer bilden. Bösartige Zellen werden hinzugefügt sobald eine Monolage gebildet hat und Invasion wird in Echtzeit überwacht, wie die Zelle Index ändert aufgrund des Eindringens der endothelialen Monolayer. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. HUVEC Monolayerbildung. Veränderungen in der Zelle als Index HUVEC Zellen zu befestigen und zu verbreiten auf Gelatine-beschichteten Gold-Elektroden. Die Bildung einer konfluenten Monoschicht durch eine Stabilisierung des Zell-Index nach 18 Stunden dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Invasion von HUVEC Zellen durch K7M2 und K12 Osteosarkomzellen. Ein steiler Rückgang in cell-index erfolgt innerhalb von ein paar Stunden von der Einführung des hoch metastatischen K7M2 Zellen. K12-Zellen, auf der anderen Seite, sind weniger metastatischen und nicht imstande sind, die endothelialen Monoschicht so effizient wie K7M2 Zellen eindringen. Dies wird durch eine weniger steile Abnahme in der Zell-Index, wenn der HUVEC Monoschicht mit K12-Zellen in Frage gestellt wird dargestellt. Steuerelement darstellt Impedanz HUVEC Monoschicht in Abwesenheit von Krebszellen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.

<ol><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+The+metastasis+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. The metastasis cascade.</a> Science. 321, 1785-1787 (2008).</li>
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</ol>

Die Publikation kostet für dieses Manuskripts wurde uns freundlicherweise von Roche Applied Science zur Verfügung gestellt.

Die Echtzeit-HUVEC Invasion Assay ist eine einfache, aber leistungsfähige Methode zur Überwachung Invasion. Es liefert Ergebnisse in Echtzeit, was ein wesentlicher Vorteil gegenüber anderen herkömmlichen Techniken, die auf Endpunktanalyse verlassen. Der Assay kann auf Testverbindungen, Antikörper, Liganden und Proteine ​​als Inhibitoren oder Stimulatoren der Metastasierung modifiziert werden. Die Wirkung verschiedener Mittel auf die endotheliale / Krebszelle cross-talk kann auch beurteilt werden. Bei der Einführung von exogener Mittel, wie Wachstumsfaktoren und Medikamenten in den Kulturmedien, ist es wichtig sicherzustellen, dass sie keinen Einfluss auf die Integrität der HUVEC Monoschicht. Die Unterbrechung der HUVEC Monoschicht durch Einführen der exogene Substanz in Abwesenheit von eindringenden Zellen, und sicherzustellen, dass es keine Veränderung in der Zelle Index geprüft werden. Daher sollten geeignete Kontrollen als Teil des experimentellen Designs enthalten sein. Verschiedene Zelllinien zeigen unterschiedliche Zell-Index-Kurve, wie sie eine conf bildenluent Monoschicht. Die Form der Kurve, sowie die maximale Zell-Index erreicht ist Zelltyp-spezifisch. HUVEC-Zellen zeigen eine charakteristische transiente Abflachung der Zelle Index 4-6 Stunden nach dem Aussäen von einem anderen Stabilisierung bei einer höheren Zelle Index nach 16-18 Stunden. Daher ist es wichtig, damit die Zellen bilden eine konfluente Monoschicht für mindestens 18 Stunden vor der Zugabe von Tumorzellen. Da die Zelle Index ist abhängig von der ionischen Umgebung an der Elektrode / Zelle Interphase Einfluss verschiedener Faktoren wie zum Beispiel Zell-Morphologie und die Qualität der Zell-Zell-Adhäsion der Zellen-Index, zusätzlich zu dem Bereich der Schachtboden bedeckt. Somit ist die Abnahme in der Zell-Index, der auf Tumorzellinvasion auftritt, eine Funktion verschiedener Faktoren, die das Zurückziehen der endothelialen Verbindungen und anschließende Tumorzellinvasion umfassen. Das xCELLigence Instrument ist in drei verschiedenen Konfigurationen hergestellt: Echtzeit Zellanalysator(RTCA) SP, MP und RTCA RTCA DP. Die RTCA SP Instrument hält eine 96-well E-Platte, während die RTCA MP Instrument kann bis zu sechs 96-Loch-E-Platten gleichzeitig. Dies ermöglicht für das Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten und Verbindungen. Die Experimente in diesem Artikel werden unter Verwendung des RTCA DP Instrument, das drei 16-Well-Platten E-halten kann. Jede E-Platte Haltestation können unabhängig voneinander betrieben werden, was ermöglicht mehreren Benutzern die Experimente gleichzeitig laufen. Die RTCA DP Instrument kann auch verwendet werden, um die Migration mit CIM-Platten zu untersuchen. Dies sind 16-Well-Platten mit oberen und unteren Kammern durch eine Polyethylenterephthalat (PET)-Membran mit einer mittleren Porengröße von 8um getrennt. Die elektronischen Sensoren sind an der Unterseite der porösen Membran von der oberen Kammer angeordnet ist. Die untere Kammer als Reservoir für Lockstoff für Zellen in der oberen Kammer. Allerdings ist ein großer Vorteil der HUVEC Invasionsassay über die CIM-Platten, die die Tumorzelle Invasion in der ehemaligen is nicht durch die Porengröße beschränkt, wie Endothelzellen Invasion hängt von Übersprechen zwischen den Tumorzellen und Endothelzellen. Die HUVEC Invasionsassay können auch auf ECIS Z Instrument durchgeführt werden, hergestellt von Applied Biophysik (Troy, NY). Die ECIS Z Instrument nutzt eine Technologie ähnlich dem xCELLigence Instrument, mit Unterschieden in der Array-und Elektroden-Konfigurationen. Wir haben erfolgreich HUVEC Invasionsassays mit den 8-well ECIS Arrays durchgeführt. Es ist wichtig zu beachten, dass die gut Bodenfläche größer in der ECIS Arrays, die eine größere Anzahl von Endothel und Tumorzellen erfordert plattiert werden soll: 2,5 x 10 5 und 1 x 10 5 Zellen sind.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP Station</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469759001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA-Steuergerät</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05454417001</td><td>Netbook mit vorinstallierter RTCA-Software</td></tr><tr><td>E-Platte 16</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469830001</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC-Zellen</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2-Medien</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2-Bullet-Kit</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>0,1 % Gelatine in sterilem H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>EMD Millipore</td><td>MCPROTO045</td><td></td></tr></tbody></table>

eine echtzeit-elektrische impedanz basierte technik zur invasion von endothelzellen monolayer von krebs zellen zu messen

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatischen Verbreitung von bösartigen Zellen erfordert Abbau Basalmembran Befestigung von Tumorzellen an Gefäßendothel, Einziehen der endothelialen Kreuzungen und schließlich Invasion und Migration von Tumorzellen durch das Endothel in die Blutbahn als Transportmittel geben zu entfernten Stellen in dem Host 1-3. Einmal in das Kreislaufsystem, sich Krebszellen Wände Kapillare und extravasieren des umliegenden Gewebes zu bilden Metastasen 4,5. Die verschiedenen Komponenten der Tumorzellen Endothelzellinteraktion kann in vitro durch die Herausforderung eine Monoschicht von menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) mit Krebszellen repliziert werden. Studien mit Elektronen-und Phasenkontrast-Mikroskopie durchgeführt vermuten, dass die in vitro Ablauf getreu die in vivo Metastasierungsprozess 6. Hier beschreiben wir eine elektrische Impedanz-basierte Technik, die quantifiziert und überwacht in Echtzeit den INVASion von Endothelzellen von malignen Tumorzellen. Giaever und Keese zuerst beschrieben eine Technik zum Messen von Schwankungen in der Impedanz, wenn eine Population von Zellen auf der Oberfläche der Elektroden 7,8 wachsen. Die xCELLigence Instrument, hergestellt von Roche, verwendet eine ähnliche Technik, um Änderungen in der elektrischen Impedanz zu messen, wie Zellen befestigen und in eine Kulturschale mit einer Gold-Mikroelektroden-Anordnung, die etwa 80% der Fläche bedeckt auf dem Boden eines Wells bedeckt verbreiten. Als Zellen anlagern und ausbreiten auf der Elektrodenoberfläche, es führt zu einer Erhöhung in der elektrischen Impedanz 9-12. Die Impedanz wird als dimensionslose Parameter bezeichnet Zell-Index, der direkt proportional zu der Gesamtfläche von Gewebekulturen, die von Zellen bedeckt ist, angezeigt. Daher kann die Zell-Index verwendet werden, um die Zelladhäsion, Streichen, Morphologie und die Zelldichte zu überwachen. Die Invasion Assay in diesem Artikel beschriebenen Änderungen auf der Grundlagein elektrische Impedanz an der Elektrode / Zelle Zwischenphase, als eine Population von bösartigen Zellen eindringen durch eine HUVEC Monolayer (Abbildung 1). Die Störung der endothelialen Kreuzungen, Rückzug der endothelialen Monolayer und Ersatz von Tumorzellen führen zu großen Veränderungen in der Impedanz. Diese Veränderungen korrelieren direkt mit der Kapazität von invasiven Tumorzellen, dh Invasion durch hoch aggressive Zellen zu großen Veränderungen in der Zelle Impedanz und umgekehrt führen. Diese Technik bietet einen zweifachen Vorteil gegenüber bestehenden Methoden zur Messung der Invasion, wie Boyden-Kammer und Matrigel-Tests: 1) die Endothelzellen-Tumor-Zell-Wechselwirkung mehr ahmt die in vivo-Verfahren, und 2) die Daten in Echtzeit erhalten Zeit und ist leicht zu quantifizieren, um Endpunktanalyse für andere Verfahren entgegen.

Dieser Artikel beschreibt ein<em&gt; In vitro</em&gt; Verfahren zur Überwachung Krebszellen Invasion durch eine Monoschicht aus Endothelzellen. Die Daten werden in Echtzeit in Abhängigkeit von Änderungen der Impedanz auf der Oberfläche der Elektroden, die an der Unterseite auch erworben.

Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen

Die metastatische Ausbreitung maligner Zellen erfordert den Abbau der Basalmembran, die Anheftung von Tumorzellen an das Gefäßendothel, die Retraktion von ...

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Überwachung der Invasion einer Endothelzell-Einschicht durch Krebszellen mithilfe einer echtzeitfähigen, elektrischen Impedanz basierenden Technik. Zunächst werden humane Nabelvenen-Endothelzellen, abgekürzt als VE bezeichnet, in 16-Well-EPLs ausgesät, die am Boden der Vertiefungen mit Goldelektroden beschichtet sind. Um eine konfluente Einschicht zu erzeugen, werden Krebszellen hinzugefügt, die an die VE binden und die HVAC-Einschicht infiltrieren, wodurch die Zell-Zell-Kontakte der Endothelzellen gestört werden. Anschließend werden Impedanzmessungen erfasst, die von der gesamten Fläche des Vertiefungsbodens abhängen, die von Zellen bedeckt ist.Der Umfang der Invasion kann anschließend anhand von Änderungen der elektrischen Impedanz bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Hohlraumkammer- und der METROGEL-Analyse, liegt darin, dass die Wechselwirkungen zwischen endothelialen Zellen und Tumorzellen den metastatischen Vorgang in vivo genauer nachahmen, und dass die Daten in Echtzeit gewonnen und im Vergleich zur Endpunktanalyse bei anderen Methoden leichter quantifizierbar sind. Obwohl diese Methode Einblicke in die Invasion von Krebszellen ermöglicht.Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise zur Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen im Immunsystem. Außerdem kann die Anfangsphase des Experiments, in der wir das Wachstum von UX-Zellen beobachten, genutzt werden, um die Zellproliferation beliebiger Zelllinien zu bewerten, ohne weitere Invasionsschritte durchzuführen, was zeigt, dass das Verfahren universell einsetzbar ist. Rahim, Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorstellen. Alle Schritte dieses Protokolls müssen unter sterilen Bedingungen in einer Zellkulturhaube durchgeführt werden.Das für dieses Experiment verwendete Xcel-System wird dauerhaft in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid gehalten, der bei der ersten Verwendung ausschließlich diesem Gerät vorbehalten ist. Das Gerät sollte mindestens 16 Stunden im Inkubator verbleiben, um sich an die neue Temperatur- und Feuchtigkeitsumgebung anzupassen. Bereiten Sie anschließend Thence EPL 16 vor, indem Sie es mit 0,1 % Gelatine für eine Stunde bei 37 °C beschichten.Nachdem die Platte beschichtet wurde, waschen Sie sie einmal mit PBS. Anschließend 100 Mikroliter rekonstituiertes e gm zwei Medium hinzufügen, um eine Leerwertmessung durchzuführen, um die Hintergrundimpedanz in Abwesenheit von Zellen zu messen.Platzieren Sie das EPL im Excel-Agenten-System auf dem Computer. Öffnen Sie die Excel-Agenten-Software, indem Sie im Softwarefenster auf das RTCA-Software-Symbol auf dem Desktop klicken. Klicken Sie auf die Registerkarte „Layout“ und wählen Sie die Vertiefungen aus, die die Proben enthalten.Um die Frequenz der Echtzeit-Datenerfassung zu programmieren. Klicken Sie auf den Reiter „Zeitplan“, dann auf das Symbol „Schritt hinzufügen“. Sweeps gibt die Anzahl der Messungen an, Intervals die Zeitintervalle zwischen den Messungen. Diese sind standardmäßig jeweils auf eins und 1,00 Minute eingestellt.Dadurch wird das System so programmiert, dass es eine Hintergrundmessung durchführt. Klicken Sie auf „Schritt hinzufügen“ und geben Sie 300 in das Feld „Durchläufe“ und 10 Minuten in das Feld „Intervalle“ ein. Dadurch wird das Gerät so programmiert, dass es bis zu 50 Stunden lang Impedanzmessungen durchführt.Um das Experiment zu beginnen, klicken Sie auf das Symbol „Schritt starten“. Nach Durchführung der Hintergrundmessung wird die Hintergrundimpedanz jedes Wells gemessen. Das Fenster zeigt die Meldung an.Bereit für den nächsten Schritt, bitte klicken. Nächster Schritt zum Start. Zu diesem Zeitpunkt können Zellen hinzugefügt und die Bildung einer Monoschicht wie beschrieben überwacht werden.Im nächsten Abschnitt werden die hier verwendeten humanen Nabelvenenendothelzellen oder VE in EGM-2-Medium kultiviert, das mit dem EGM-2-Bullet-Kit, enthaltend Wachstumsfaktor-Zusätze, und 5 % FBS rekonstituiert wurde. Die Zellen sollten in einem Inkubator bei 37 °C in Gegenwart von 5 % Kohlendioxid gehalten werden. Am Tag des Experiments überprüfen Sie unter dem Mikroskop die Konfluenz von HUVECs. Die Zellen sollten eine niedrige Passagezahl aufweisen, vorzugsweise nicht höher als sechs, und weniger als 75 % konfluent sein, um eine gleichmäßige, einschichtige Zellschicht zu erzeugen. Gewinnen Sie die Zellen durch Trypsinierung. Sobald sich die Zellen vom Kolben gelöst haben, sollte jegliche Spur von Trypsin durch Zentrifugation bei 200 × g entfernt werden. Nach dem Zentrifugieren waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.Suspenderen Sie die Zellen anschließend erneut und stellen Sie das rekonstituierte e GM zwei-Medium auf eine Konzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter ein. Sobald die Zellen resuspendiert sind, entfernen Sie das hintergrundkalibrierte EPL aus dem EXOGEN-System und geben 100 Mikroliter der HX-Suspension zu den bereits in der Platte befindlichen 100 Mikrolitern E GM zwei-Medium hinzu. Stellen Sie das EPL unmittelbar in den Excel-System-Cell-Analyzer.Beginnen Sie mit der Erfassung von Impedanzmesswerten, indem Sie im Softwarefenster die Schaltfläche „Start“ betätigen. Lassen Sie die endothelialen Zellen wachsen. Das System führt alle 10 Minuten weiterhin Impedanzmessungen durch.Uve zeigen vier bis sechs Stunden nach der Aussaat eine charakteristische vorübergehende Abflachung des Zellindex, gefolgt von einer erneuten Stabilisierung nach 16 bis 18 Stunden. Daher ist es wichtig, die Zellen mindestens 18 Stunden lang eine konfluente Monoschicht bilden zu lassen. Sobald eine Monoschicht gebildet ist, können die eindringenden Zellen hinzugefügt werden, um den Invasionstest vorzubereiten.Bereiten Sie die eindringenden Tumorzellen vor. Hier werden Osteosarkomzellen verwendet. Beginnen Sie mit der Gewinnung der Zellen durch Trypsin. Entfernen Sie alle Spuren von Trypsin, indem Sie die Zellen bei 200 G zentrifugieren und einmal mit PPS waschen. Nach der Wäsche suspendieren Sie die Zellen in dem Medium, das zum Kultivieren der Tumorzellen verwendet wird, wie RPMI oder DMEA-Medium mit 10 % FBS, bei einer Endkonzentration von 1 × 10⁵ Zellen pro Milliliter. Unterbrechen Sie das Experiment, indem Sie im Softwarefenster auf das Symbol „Schritt unterbrechen“ klicken.Entfernen Sie das EPL und aspirieren Sie das EGM zwei Medium aus der konfluenten Monoschicht. Geben Sie 100 Mikroliter Tumorzellsuspension mit einer Zellzahl von 1 × 10⁴ hinzu. Im Allgemeinen eignet sich ein Verhältnis von 1:2,5 Tumorzellen zu Endothelzellen am besten für den Assay.Allerdings kann das Verhältnis für einzelne Zelllinien optimiert werden. Stellen Sie das EPL zurück in das Excel-Agens-System im Inkubator. Klicken Sie auf den Schritt „Weiter“, um die Impedanzmessungen in Zehn-Minuten-Abständen fortzusetzen.Überwachen Sie die Invasion in Echtzeit über die nächsten sechs bis zwölf Stunden. Ein Abfall des Zellindex resultiert aus der Retraktion der endothelialen Zellkontakte und dem Eindringen der invadierenden Tumorzellen. Wenn das Experiment beendet ist, verwenden Sie die Exergen-Software, um die Ergebnisse auf den Zeitpunkt der Zugabe der invadierenden Tumorzellen zu normalisieren.Die Exergen-Software ermöglicht die Normalisierung auf einen beliebigen Zeitpunkt, zu dem VEX im Exergen-System kultiviert wurden, wie in diesem Video gezeigt, und entweder K7M2-Zellen oder K12-Zellen wurden nach der Bildung der Monoschicht hinzugefügt. Wie hier dargestellt, tritt ein starker Abfall des Zellindex innerhalb weniger Stunden nach der Zugabe von K7M2-Zellen auf. K7M2 ist eine hochmetastatische Osteosarkom-Zelllinie.Diese Zellen exprimieren hohe Mengen des zytoskeletalen Linkerproteins ene, was für die invasiven Eigenschaften der Zelllinie verantwortlich ist. K 12-Zellen hingegen sind weniger metastatisch und können die endotheliale Monoschicht nicht so effizient durchdringen wie K sieben M zwei-Zellen. Dies zeigt sich durch eine geringere Abnahme des Zellindex, wie hier dargestellt.Die hier gezeigte Kontrolle stellt die Impedanz des Uve-Monolayers dar. In Abwesenheit von Krebszellen wurden die Experimente im Dreifachansatz durchgeführt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Invasion in Echtzeit misst, indem man ein Endothelzellmonolayer erzeugt und dieses mit Krebszellen herausfordert.Die anfänglichen Schritte des Experiments, die die Bildung einer HU XL-Monolayer beinhalten, können zur Beurteilung der Zellproliferation mittels Impedanz verwendet werden. Zwei.

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Forschung

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Dieses Video beschreibt einen Invasionsassay mit einem Dreikammer-Array, das auf der elektrischen Impedanz basiert. Diese Technik misst das invasive Potenzial von Krebszellen unter dem Einfluss löslicher Faktoren, die von den residenten Stromazellen in Tumormikroumgebungen sezerniert werden.

Dreikammer-Array-basierter Impedanz-Assay: Eine Echtzeit-Analysetechnik zur Bewertung des invasiven Potenzials von Krebszellen durch Messung der elektrischen Impedanz

Quelle: Mudduluru, G., et. al. Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Migration und Invasion von Krebszellen. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt einen impedanzbasierten Assay zur Messung der Invasion und Migration von Glioblastom-Zellen. Die Zellen bauen die extrazelluläre Matrix ab, bewegen sich durch mikroporöse Membranen und haften an Elektroden, wodurch eine Impedanz erzeugt wird. Diese Echtzeitanalyse spiegelt ihr invasives Potenzial für Anwendungen in der Krebsforschung wider.

Impedanzbasierte Messungen der Invasion von Hirntumorzellen

Dieses Protokoll Bewertungen Elektro Zell-Substrat-Impedance Sensing, eine Methode zur Quantifizierung der Zellhaftung, Proliferation, Motilität und zellulären Antworten auf pharmakologische und toxische Stimuli erfassen und analysieren die Impedanzspektrum von adhärenten Zellen. Nachweis endothelialer Permeabilität und Bewertung der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Kontakte sind hervorgehoben.

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung der Fähigkeit von Krebszellen, unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu wandern und einzudringen, ist entscheidend für die Beurteilung therapeutischer Strategien. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der metastasierenden Fähigkeiten einer Glioblastom-Krebszelllinie in Echtzeit dar.

Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Viele hochregulierte Gene stimulieren die Migration und Invasion von Tumorzellen, was zu einer schlechten Prognose führt. Es ist entscheidend zu bestimmen, welche Gene die Migration und Invasion von Tumorzellen regulieren. Dieses Protokoll stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen der erhöhten Expression eines Gens auf die Migration und Invasion von Tumorzellen in Echtzeit zu untersuchen.

Quantitative Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion nach synthetischer mRNA-Transfektion

Hier demonstrieren wir die Technik der Verwendung impedanzbasierter Biosensoren: ECIS und cellZscope zur Messung der Endothelbarriere des Gehirns. Wir beschreiben die Vorbereitung und Technik des Hinzufügens verschiedener Stimuli zu einem in vitro-Modell des Gehirnendothels. Wir messen, erfassen und analysieren die Ergebnisse repräsentativ.

Messung von Veränderungen der Integrität der endothelialen Barriere des Gehirns mit zwei impedanzbasierten Biosensoren als Reaktion auf Krebszellen und Zytokine

Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Einen umfassenden Überblick über die Techniken bei der Erzeugung von einem Maus-Modell von Mundkrebs und quantitative Überwachung der Tumorinvasion in die Zunge durch Multi-Photonen-Mikroskopie markierter Zellen beteiligt wird vorgestellt. Dieses System kann als eine nützliche Plattform für die molekulare Beurteilung und Wirksamkeit von Medikamenten von anti-invasive Verbindungen dienen.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Ein Test zur quantitativen Messung Transforming Growth Factor (TGF)-β-induzierte Invasion im 3-dimensionalen Kollagen-Gelen beschrieben. Dieser Assay nutzt die MCF10A Reihe von Zelllinien, die verschiedenen Stadien der Entwicklung von Brustkrebs darstellen. Diese Methode kann angenommen, um mit anderen Zelllinien verwendet werden und könnte verwendet werden, um andere potenzielle Aktivatoren oder Inhibitoren der Invasion zu untersuchen sein.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

Erfahren Sie eine Echtzeit-Impedanzmethode zur Messung von Krebszell-Invasion durch Endothelzell-Monolayer. Diese Technik mit HUVECs liefert quantitative Daten zu metastaseähnlichen Zellinteraktionen.

Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen

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