Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Überwachung der Invasion einer Endothelzell-Einschicht durch Krebszellen mithilfe einer echtzeitfähigen, elektrischen Impedanz basierenden Technik. Zunächst werden humane Nabelvenen-Endothelzellen, abgekürzt als VE bezeichnet, in 16-Well-EPLs ausgesät, die am Boden der Vertiefungen mit Goldelektroden beschichtet sind. Um eine konfluente Einschicht zu erzeugen, werden Krebszellen hinzugefügt, die an die VE binden und die HVAC-Einschicht infiltrieren, wodurch die Zell-Zell-Kontakte der Endothelzellen gestört werden. Anschließend werden Impedanzmessungen erfasst, die von der gesamten Fläche des Vertiefungsbodens abhängen, die von Zellen bedeckt ist.

Der Umfang der Invasion kann anschließend anhand von Änderungen der elektrischen Impedanz bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Hohlraumkammer- und der METROGEL-Analyse, liegt darin, dass die Wechselwirkungen zwischen endothelialen Zellen und Tumorzellen den metastatischen Vorgang in vivo genauer nachahmen, und dass die Daten in Echtzeit gewonnen und im Vergleich zur Endpunktanalyse bei anderen Methoden leichter quantifizierbar sind. Obwohl diese Methode Einblicke in die Invasion von Krebszellen ermöglicht.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise zur Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen im Immunsystem. Außerdem kann die Anfangsphase des Experiments, in der wir das Wachstum von UX-Zellen beobachten, genutzt werden, um die Zellproliferation beliebiger Zelllinien zu bewerten, ohne weitere Invasionsschritte durchzuführen, was zeigt, dass das Verfahren universell einsetzbar ist. Rahim, Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorstellen. Alle Schritte dieses Protokolls müssen unter sterilen Bedingungen in einer Zellkulturhaube durchgeführt werden.

Das für dieses Experiment verwendete Xcel-System wird dauerhaft in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid gehalten, der bei der ersten Verwendung ausschließlich diesem Gerät vorbehalten ist. Das Gerät sollte mindestens 16 Stunden im Inkubator verbleiben, um sich an die neue Temperatur- und Feuchtigkeitsumgebung anzupassen. Bereiten Sie anschließend Thence EPL 16 vor, indem Sie es mit 0,1 % Gelatine für eine Stunde bei 37 °C beschichten.

Nachdem die Platte beschichtet wurde, waschen Sie sie einmal mit PBS. Anschließend 100 Mikroliter rekonstituiertes e gm zwei Medium hinzufügen, um eine Leerwertmessung durchzuführen, um die Hintergrundimpedanz in Abwesenheit von Zellen zu messen.

Platzieren Sie das EPL im Excel-Agenten-System auf dem Computer. Öffnen Sie die Excel-Agenten-Software, indem Sie im Softwarefenster auf das RTCA-Software-Symbol auf dem Desktop klicken. Klicken Sie auf die Registerkarte „Layout“ und wählen Sie die Vertiefungen aus, die die Proben enthalten.

Um die Frequenz der Echtzeit-Datenerfassung zu programmieren. Klicken Sie auf den Reiter „Zeitplan“, dann auf das Symbol „Schritt hinzufügen“. Sweeps gibt die Anzahl der Messungen an, Intervals die Zeitintervalle zwischen den Messungen. Diese sind standardmäßig jeweils auf eins und 1,00 Minute eingestellt.

Dadurch wird das System so programmiert, dass es eine Hintergrundmessung durchführt. Klicken Sie auf „Schritt hinzufügen“ und geben Sie 300 in das Feld „Durchläufe“ und 10 Minuten in das Feld „Intervalle“ ein. Dadurch wird das Gerät so programmiert, dass es bis zu 50 Stunden lang Impedanzmessungen durchführt.

Um das Experiment zu beginnen, klicken Sie auf das Symbol „Schritt starten“. Nach Durchführung der Hintergrundmessung wird die Hintergrundimpedanz jedes Wells gemessen. Das Fenster zeigt die Meldung an.

Bereit für den nächsten Schritt, bitte klicken. Nächster Schritt zum Start. Zu diesem Zeitpunkt können Zellen hinzugefügt und die Bildung einer Monoschicht wie beschrieben überwacht werden.

Im nächsten Abschnitt werden die hier verwendeten humanen Nabelvenenendothelzellen oder VE in EGM-2-Medium kultiviert, das mit dem EGM-2-Bullet-Kit, enthaltend Wachstumsfaktor-Zusätze, und 5 % FBS rekonstituiert wurde. Die Zellen sollten in einem Inkubator bei 37 °C in Gegenwart von 5 % Kohlendioxid gehalten werden. Am Tag des Experiments überprüfen Sie unter dem Mikroskop die Konfluenz von HUVECs. Die Zellen sollten eine niedrige Passagezahl aufweisen, vorzugsweise nicht höher als sechs, und weniger als 75 % konfluent sein, um eine gleichmäßige, einschichtige Zellschicht zu erzeugen. Gewinnen Sie die Zellen durch Trypsinierung. Sobald sich die Zellen vom Kolben gelöst haben, sollte jegliche Spur von Trypsin durch Zentrifugation bei 200 × g entfernt werden. Nach dem Zentrifugieren waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.

Suspenderen Sie die Zellen anschließend erneut und stellen Sie das rekonstituierte e GM zwei-Medium auf eine Konzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter ein. Sobald die Zellen resuspendiert sind, entfernen Sie das hintergrundkalibrierte EPL aus dem EXOGEN-System und geben 100 Mikroliter der HX-Suspension zu den bereits in der Platte befindlichen 100 Mikrolitern E GM zwei-Medium hinzu. Stellen Sie das EPL unmittelbar in den Excel-System-Cell-Analyzer.

Beginnen Sie mit der Erfassung von Impedanzmesswerten, indem Sie im Softwarefenster die Schaltfläche „Start“ betätigen. Lassen Sie die endothelialen Zellen wachsen. Das System führt alle 10 Minuten weiterhin Impedanzmessungen durch.

Uve zeigen vier bis sechs Stunden nach der Aussaat eine charakteristische vorübergehende Abflachung des Zellindex, gefolgt von einer erneuten Stabilisierung nach 16 bis 18 Stunden. Daher ist es wichtig, die Zellen mindestens 18 Stunden lang eine konfluente Monoschicht bilden zu lassen. Sobald eine Monoschicht gebildet ist, können die eindringenden Zellen hinzugefügt werden, um den Invasionstest vorzubereiten.

Bereiten Sie die eindringenden Tumorzellen vor. Hier werden Osteosarkomzellen verwendet. Beginnen Sie mit der Gewinnung der Zellen durch Trypsin.

Entfernen Sie alle Spuren von Trypsin, indem Sie die Zellen bei 200 G zentrifugieren und einmal mit PPS waschen. Nach der Wäsche suspendieren Sie die Zellen in dem Medium, das zum Kultivieren der Tumorzellen verwendet wird, wie RPMI oder DMEA-Medium mit 10 % FBS, bei einer Endkonzentration von 1 × 10⁵ Zellen pro Milliliter. Unterbrechen Sie das Experiment, indem Sie im Softwarefenster auf das Symbol „Schritt unterbrechen“ klicken.

Entfernen Sie das EPL und aspirieren Sie das EGM zwei Medium aus der konfluenten Monoschicht. Geben Sie 100 Mikroliter Tumorzellsuspension mit einer Zellzahl von 1 × 10⁴ hinzu. Im Allgemeinen eignet sich ein Verhältnis von 1:2,5 Tumorzellen zu Endothelzellen am besten für den Assay.

Allerdings kann das Verhältnis für einzelne Zelllinien optimiert werden. Stellen Sie das EPL zurück in das Excel-Agens-System im Inkubator. Klicken Sie auf den Schritt „Weiter“, um die Impedanzmessungen in Zehn-Minuten-Abständen fortzusetzen.

Überwachen Sie die Invasion in Echtzeit über die nächsten sechs bis zwölf Stunden. Ein Abfall des Zellindex resultiert aus der Retraktion der endothelialen Zellkontakte und dem Eindringen der invadierenden Tumorzellen. Wenn das Experiment beendet ist, verwenden Sie die Exergen-Software, um die Ergebnisse auf den Zeitpunkt der Zugabe der invadierenden Tumorzellen zu normalisieren.

Die Exergen-Software ermöglicht die Normalisierung auf einen beliebigen Zeitpunkt, zu dem VEX im Exergen-System kultiviert wurden, wie in diesem Video gezeigt, und entweder K7M2-Zellen oder K12-Zellen wurden nach der Bildung der Monoschicht hinzugefügt. Wie hier dargestellt, tritt ein starker Abfall des Zellindex innerhalb weniger Stunden nach der Zugabe von K7M2-Zellen auf. K7M2 ist eine hochmetastatische Osteosarkom-Zelllinie.

Diese Zellen exprimieren hohe Mengen des zytoskeletalen Linkerproteins ene, was für die invasiven Eigenschaften der Zelllinie verantwortlich ist. K 12-Zellen hingegen sind weniger metastatisch und können die endotheliale Monoschicht nicht so effizient durchdringen wie K sieben M zwei-Zellen. Dies zeigt sich durch eine geringere Abnahme des Zellindex, wie hier dargestellt.

Die hier gezeigte Kontrolle stellt die Impedanz des Uve-Monolayers dar. In Abwesenheit von Krebszellen wurden die Experimente im Dreifachansatz durchgeführt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Invasion in Echtzeit misst, indem man ein Endothelzellmonolayer erzeugt und dieses mit Krebszellen herausfordert.

Die anfänglichen Schritte des Experiments, die die Bildung einer HU XL-Monolayer beinhalten, können zur Beurteilung der Zellproliferation mittels Impedanz verwendet werden. Zwei.