Name: Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Lernen Sie die Analyse dendritischer Spine-Morphologie in primären kultivierten kortikalen Neuronen mit GFP-Transfektion und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Plastizität.

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Wir bedanken uns bei Kelly Jones für die sorgfältige Bearbeitung. American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS);; Diese Arbeit wurde vom NIH R01MH 071316, Alzheimer Association, der National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) und die National Alliance for Autism Research (naar) (PP) unterstützt amerikanischen Heart Association Promotionsstipendium (KMW).

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

Die Produktion dieser Arbeit wurde durch MetaMorph (Molecular Devices, Inc.) unterstützt.

Die oben beschriebenen Techniken für die detaillierte quantitative Analyse der dendritischen Dorn Morphologie, lineare Dichte und Beweglichkeit in fester oder leben primären kortikalen Neuronen sind auf das Verständnis der Auswirkungen der postsynaptischen Mechanismen, die zu Neuropathologien beitragen können konzentriert. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um Wirbelsäule Morphologie und Motilität in allen stacheligen Neuron, einschließlich Hippocampus pyramidal, Purkinje, oder mittlere stachelige Neuronen zu q...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> 18 mm rund Deckglas Nr. 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 mm ² Deckglas Nr. 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> MW 70 ~ 150 kDa </td></tr><tr><td> Neurobasal Medien </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Ascent Scientific </td><td> Asc-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> MediaTech CellGro </td><td> 25 bis 060-C 1 </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Formaldehyd-Lösung </td><td> EMD Chemicals </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, Histologie grade </td></tr><tr><td> Normale Ziegen Serum </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson Immunoresearch Labs </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG (H + L) hochvernetzte adsorbiert </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) * hochvernetzte adsorbiert * </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold-Antifade Reagenz </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Spezielle Verpackungen </td></tr><tr><td> Anbei Abbildungsstufe Kammer </td><td> Warner </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Temperature Controller-Einheit </td><td> Warner </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph </td><td> Universal Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die analyse der dendritischen spine morphologie in cultured zns-neuronen

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritischen Dornen sind die Seiten der Mehrheit der exzitatorischen Verbindungen im Gehirn, und bilden die postsynaptischen Fach von Synapsen. Diese Strukturen sind reich an Aktin und haben gezeigt, dass eine hohe Dynamik. Aufgrund der klassischen Hebb&#39;sche Plastizität sowie neuromodulatorischen Signale können dendritischen Dornen in Form und Zahl, die vermutlich von entscheidender Bedeutung sein für die Veredelung von neuronalen Schaltkreisen und die Verarbeitung und Speicherung von Informationen im Gehirn ist. Innerhalb dendritischen Dornen, Link ein komplexes Netzwerk von Proteinen extrazelluläre Signale mit dem Aktin cyctoskeleton ermöglicht die Kontrolle von dendritischen Dorn Morphologie und Anzahl. Neuropathologische Studien haben gezeigt, dass eine Reihe von Erkrankungen, angefangen von Schizophrenie, Autismus-Spektrum-Störungen, abnorme dendritischen Dorn Morphologie oder Zahlen anzuzeigen. Darüber hinaus haben die jüngsten genetischen Studien Mutationen in zahlreichen Genen, die synaptischen Proteine ​​kodieren identifiziert, was für Vorschläge, dass diese Proteine ​​an aberranten Wirbelsäule Plastizität, die zum Teil unterliegen der Pathophysiologie dieser Erkrankungen beitragen können. Um die mögliche Rolle dieser Proteine ​​bei der Kontrolle der dendritischen Dorn Morphologien / Anzahl Studie bietet der Einsatz von kultivierten kortikalen Neuronen mehrere Vorteile. Erstens ermöglicht dieses System für hochauflösende Bildgebung der dendritischen Dornen in fixierten Zellen sowie Zeitraffer-Imaging lebender Zellen. Zweitens ermöglicht diese in vitro-System für einfache Handhabung der Funktion des Proteins durch Expression von mutierten Proteinen, Knockdown von shRNA-Konstrukte oder medikamentöse Behandlungen. Diese Techniken können die Forscher damit beginnen, die Rolle der krankheits-assoziierte Proteine ​​zerlegen und vorherzusagen, wie Mutationen dieser Proteine ​​können in vivo-Funktion.

Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine ​​auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritische Dornen sind die Orte der Mehrheit der erregenden Verbindungen im Gehirn und bilden das postsynaptische Kompartiment von Synapsen. Diese ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen verschiedener molekularer und pharmakologischer Eingriffe auf die Morphologie und Beweglichkeit dendritischer Dornen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem primär kultivierte kortikale Neuronen mit GFP durchtrennt werden, gegebenenfalls kombiniert mit der exogenen Expression von DNA-Plasmiden, um die Neuronenmorphologie sichtbar zu machen und die Expression sowie Funktion endogener Proteine zu beeinflussen. Im zweiten Schritt können die Zellen pharmakologisch behandelt und anschließend zur Immunfärbung fixiert oder für die Zeitrafferaufnahme vorbereitet werden.Und anschließend erfolgt eine pharmakologische Behandlung, die die Visualisierung dendritischer Dornen sowie die induzierten Veränderungen in der Morphologie und Beweglichkeit dendritischer Dornen ermöglicht. Danach werden Z-Serien-Bilder fixierter Zellen oder Bilder lebender Zellen, die zu bestimmten Zeitpunkten aufgenommen wurden, mittels konfokaler Mikroskopie gewonnen. Detaillierte Messungen der Morphologie dendritischer Dornen können aus 2D-Projektionen der Z-Serien-Bilder vorgenommen werden.Die erhaltenen Ergebnisse zeigen den Effekt mol

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Pekarek, B. T., et. al., Bildgebung und Quantifizierung von intakten neuronalen Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing. (2021)In diesem Video demonstrieren wir die Präparation, Bildgebung und Analyse eines gereinigten Mäusegehirns, um dendritische Dorne, die Morphologie der Wirbelsäule und die neuronale Verteilung mithilfe von konfokaler Mikroskopie und 3D-Rekonstruktionstechniken zu untersuchen.

Konfokalmikroskopische Bildgebung von intakten dendritischen Dornen und der Morphologie der Wirbelsäule in einem gereinigten Mausgehirn

Quelle: Gouder, et. al. Dreidimensionale Quantifizierung von dendritischen Dornen aus pyramidalen Neuronen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video zeigt die Bildgebung und Analyse von dendritischen Dornen in transduzierten, immunmarkierten Pyramidenneuronen mittels konfokaler Mikroskopie. Hintergrundgeräusche werden reduziert und Dendriten werden durch Schätzung ihres Durchmessers und ihrer Länge verfolgt. Die automatisierte...

Quantifizierung dendritischer Dornen mittels konfokaler Mikroskopie

Dieser Artikel beschreibt ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen von Neuronen im Hippocampus in vitro unter Verwendung Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-Resolution-Mikroskopie mit SIM bietet Bildauflösung deutlich über der Lichtbeugungsgrenze in allen drei Raumdimensionen, so dass die Abbildung der einzelnen dendritischen Dornen mit verbesserten Details.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Hier stellen wir ein Golgi-Cox-Protokoll ausführlich vor. Diese zuverlässige Gewebe-Fleck-Methode ermöglicht eine qualitativ hochwertige Beurteilung der Cytoarchitektur im Hippocampus und im gesamten Gehirn mit minimaler Fehlersuche.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Wir präsentieren ein Protokoll zur Kennzeichnung und Analyse pyramidaler Neuronen, das für die Bewertung potenzieller morphologischer Veränderungen in Neuronen und dendritischen Stacheln, die neurochemischen und verhaltensbedingten Anomalien zugrunde liegen können, entscheidend ist.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

Dendritische Stacheln sind wichtige zelluläre Merkmale des Nervensystems. Hier werden bildgebende Verfahren zur Beurteilung der Struktur und Funktion von dendritischen Dornen in C. elegans beschrieben. Diese Ansätze unterstützen die Entwicklung von mutierten Screens für Gene, die die Form oder Funktion der dendritischen Wirbelsäule definieren.

Bildgebung dendritischer Dornen bei Caenorhabditis elegans

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Dendritische Stacheln sind postsynaptische Kompartimente der meisten exzitatorischen Synapsen. Veränderungen der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule treten während der neurologischen Entwicklung, des Alterns, des Lernens und vieler neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen auf, was die Bedeutung einer zuverlässigen dendritischen Wirbelsäulenanalyse unterstreicht. Dieses Protokoll beschreibt die genaue und reproduzierbare Quantifizierung der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule...

Quantifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit einer automatischen dreidimensionalen Neuronenrekonstruktionssoftware

Lernen Sie die Analyse dendritischer Spine-Morphologie in primären kultivierten kortikalen Neuronen mit GFP-Transfektion und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Plastizität.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

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