Name: Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Lernen Sie die Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von Genexpressionsmustern in Maus-Embryonen (E8.5-E11.5). Diese Methode ermöglicht präzise Analysen in der Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R21MH082360 (BGC) und R01HD056315 (NRM) sowie der University of Georgia unterstützt.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methoden in diesem Protokoll beschriebenen aus einer Reihe von unterschiedlichen Quellen angepasst und optimiert für die ganze Berg E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen. Methoden für die whole mount in situ Hybridisierung von Wirbeltierembryonen erschien erstmals in den frühen 1990er Jahren 2,5-12. Dieses Protokoll wurde in erster Linie von Methoden für Xenopus Embryonen 7,8 sowie Maus 2,11 entwickelt angepasst. In unserem Protokoll viel Wert auf eine sorgfältige Bewertung d...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Digoxigenin-11-Uridin-5&#39;-Triphosphat </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleosid Triphosphat Set </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Quick Spin Columns für radioaktiv markierte RNA Aufreinigung </td><td> Versorgung </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6-RNA-Polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3-RNA-Polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 Ci </td><td> Reagens </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase I rekombinante RNase-freie </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Urea, farblose bis weiße Kristalle oder kristallines Pulver </td><td> Reagens </td><td> Fischer </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gel-Ladepuffer </td><td> Reagens </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Versorgung </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Ausstattung </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonat </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Heparin-Natrium </td><td> Reagens </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid 30% in Wasser </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glutaraldehyd, 8% EM grade </td><td> Reagens </td><td> Polysciences </td><td> 0 / 710 </td><td> Mit Vorsicht nach Herstellung der Anleitung </td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Machen Sie sich in 5% Aktien und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Machen Sie als 10 mg / ml Lager und bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNase T1 </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Formamid </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamisol Hydrochlorid </td><td> Reagens </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonukleinsäure aus Torula Hefe, Typ VI </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> Phenol / Chloroform extrahiert mehrmals und ausgefällt, erneut in DEPC-dH2O und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM Lila AP Substrat, ausfällt. Ready-to-use Lösung. </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4ml, Clear, Closed Top, Lagervial Convenience Kit </td><td> Versorgung </td><td> Nationale wissenschaftliche </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr><td> Shake n Bake Hybridisierungsofen </td><td> Ausstattung </td><td> Boekel Scientific </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Biopsie Sure-Tek </td><td> Versorgung </td><td> Fisherbrand </td><td> 15 bis 200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Plus-Gewebe Einbettmedium </td><td> Reagens </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way Einweg-Kunststoff-Gewebe Einbettformen </td><td> Versorgung </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost Plus-Objektträger </td><td> Versorgung </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Reagens </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

ganze berge in-situ hybridisierung von e8.5 bis e11.5 maus embryonen

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine sehr informative Ansatz für die Definition Genexpressionsmuster in Embryonen. Die in-situ-Hybridisierung Verfahren sind langwierig und technisch anspruchsvolle mit mehreren wichtigen Schritten, die gemeinsam die Qualität des Endergebnisses beitragen. Dieses Protokoll beschreibt im Detail einige wichtige Qualitätskontrolle Schritte zur Optimierung Sondenmarkierung und Leistung. Insgesamt bietet unser Protokoll eine detaillierte Beschreibung der kritischen Schritte notwendig, um reproduzierbar zu erhalten qualitativ hochwertige Ergebnisse. Zunächst beschreiben wir die Erzeugung von Digoxigenin (DIG) markierten RNA-Sonden über In-vitro-Transkription der DNA-Templates mittels PCR generiert. Wir beschreiben drei kritischen Qualitätskontrolle Assays, um die Menge, die Integrität und die spezifische Aktivität des DIG-markierten Sonden zu bestimmen. Diese Schritte sind für die Erzeugung einer Sonde eine ausreichende Empfindlichkeit, um endogene mRNAs in einer ganzen Maus-Embryo erkennen wichtig. Darüber hinaus beschreiben wir für die Fixierung und Lagerung von E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen für die in-situ-Hybridisierung. Dann beschreiben wir detailliert Methoden für begrenzte Proteinase K Verdau der rehydriert Embryonen durch die Details der Hybridisierungsbedingungen, post-Hybridisierung wäscht und RNase-Behandlung, um nicht-spezifische Sonden-Hybridisierung zu entfernen. Ein AP-konjugierte Antikörper verwendet, um die markierten Sonde visualisieren und zeigen die Expressionsmuster der endogenen Transkript. Repräsentative Ergebnisse sind aus der erfolgreichen Experimente und typische suboptimal Experimente gezeigt.

Das ganze Berg<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung Protokoll diskutiert kritische Schritte, die reproduzierbar hohe Qualität der Ergebnisse zur Genexpression Studien in E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen zu gewährleisten.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Die Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung ist ein sehr aufschlussreicher Ansatz zur Bestimmung von Genexpressionsmustern in Embryonen. Die In-situ-Hybridisierungsverfahren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Genexpressionsmuster in gesamten Maus-Embryonen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine spezifische Ribo-Sonde für das Gen der Interesse entworfen und hergestellt wird. Anschließend werden die Embryonen gesammelt und für die Hybridisierung vorbehandelt.Anschließend wird die markierte Sonde an die Embryonen hybridisiert. Der letzte Schritt besteht in der Visualisierung der hybridisierten Sonde mittels immunhistochemischer Detektion. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Expressionsmuster von Genen in ganzen Embryonen oder Embryonenschnitten zeigen.Nach der Bildgebung mit einem Stereomikroskop, Zerreißmikroskop oder einem herkömmlichen Hellfeldmikroskop haben in der Regel Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Hybridisierungsverfahren zeitaufwändig und technisch anspruchsvoll sind und mehrere wichtige Schritte insgesamt zur Qualität des Endergebnisses beitragen. Zunächst wird eine Vorlage-DNA erzeugt, indem die Sequenz des Interesses mit gen-spezifischen PCR-Primern, die an den 5'-Enden mit Farbtranskriptions-Promotorsequenzen ausgestattet sind, amplifiziert wird. Danach

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

Research

Forschung

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Biology

Biologie

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge...

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

Wir präsentieren hier ein optimiertes Protokoll zur Genotypisierung, Färbung und Vorbereitung fötaler Mäuse für die Bildgebung von peripheren Nozizeptoren-Axonprojektionen im gesamten Tier, als effektive Methode zur Beurteilung sensorischer Axonwachstumsphänotypen bei der Entwicklung gentechnisch veränderter Mäuse.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

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Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll mit hochauflösender episkopischer Mikroskopie, um dreidimensionale (3D) Bilder von Mausembryonen zu erfassen. Dieses verbesserte Protokoll verwendet eine modifizierte Gewebepräparationsmethode, um die Penetration des Fluoreszenzfarbstoffs zu verbessern und so die morphometrische Analyse sowohl kleiner als auch großer Proben zu ermöglichen.

Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie

Die Knoten und notochordal Platte sind vergänglich Signalisierung Organisatoren bei der Entwicklung von Mäuseembryonen, die mit mehreren Techniken visualisiert werden können. Hier beschreiben wir im Detail wie Sie zwei Techniken ihre Struktur und Morphogenese durchführen: 1) Rasterelektronenmikroskopie (SEM); und 2) ganze Berg Immunfluoreszenz (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

Wir präsentieren Ihnen die Protokolle, um die Maus Herz Entwicklung mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie auf Mausembryonen seziert von ventrikulären spezifische MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns, jede Stufe der ventrikulären Formation während der Maus Herz Entwicklung ohne arbeitsintensive histochemische Methoden direkt zu visualisieren.

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Klassischerweise wurde das Endokard des embryonalen Klappenprimordiums der Maus anhand transversaler, koronaler oder sagittaler Schnitte analysiert. Unser neuartiger Ansatz für die enface, zweidimensionale Bildgebung des Endokards in valvulogenen Regionen ermöglicht eine planare Polaritäts- und Zellumlagerungsanalyse des Endokards während der Klappenentwicklung.

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In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

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