Name: Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Lernen Sie die Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von Genexpressionsmustern in Maus-Embryonen (E8.5-E11.5). Diese Methode ermöglicht präzise Analysen in der Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R21MH082360 (BGC) und R01HD056315 (NRM) sowie der University of Georgia unterstützt.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methoden in diesem Protokoll beschriebenen aus einer Reihe von unterschiedlichen Quellen angepasst und optimiert für die ganze Berg E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen. Methoden für die whole mount in situ Hybridisierung von Wirbeltierembryonen erschien erstmals in den frühen 1990er Jahren 2,5-12. Dieses Protokoll wurde in erster Linie von Methoden für Xenopus Embryonen 7,8 sowie Maus 2,11 entwickelt angepasst. In unserem Protokoll viel Wert auf eine sorgfältige Bewertung d...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Digoxigenin-11-Uridin-5&#39;-Triphosphat </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleosid Triphosphat Set </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Quick Spin Columns für radioaktiv markierte RNA Aufreinigung </td><td> Versorgung </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6-RNA-Polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3-RNA-Polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 Ci </td><td> Reagens </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase I rekombinante RNase-freie </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Urea, farblose bis weiße Kristalle oder kristallines Pulver </td><td> Reagens </td><td> Fischer </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gel-Ladepuffer </td><td> Reagens </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Versorgung </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Ausstattung </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonat </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Heparin-Natrium </td><td> Reagens </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid 30% in Wasser </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glutaraldehyd, 8% EM grade </td><td> Reagens </td><td> Polysciences </td><td> 0 / 710 </td><td> Mit Vorsicht nach Herstellung der Anleitung </td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Machen Sie sich in 5% Aktien und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Machen Sie als 10 mg / ml Lager und bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNase T1 </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Formamid </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamisol Hydrochlorid </td><td> Reagens </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonukleinsäure aus Torula Hefe, Typ VI </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> Phenol / Chloroform extrahiert mehrmals und ausgefällt, erneut in DEPC-dH2O und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM Lila AP Substrat, ausfällt. Ready-to-use Lösung. </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4ml, Clear, Closed Top, Lagervial Convenience Kit </td><td> Versorgung </td><td> Nationale wissenschaftliche </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr><td> Shake n Bake Hybridisierungsofen </td><td> Ausstattung </td><td> Boekel Scientific </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Biopsie Sure-Tek </td><td> Versorgung </td><td> Fisherbrand </td><td> 15 bis 200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Plus-Gewebe Einbettmedium </td><td> Reagens </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way Einweg-Kunststoff-Gewebe Einbettformen </td><td> Versorgung </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost Plus-Objektträger </td><td> Versorgung </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Reagens </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

ganze berge in-situ hybridisierung von e8.5 bis e11.5 maus embryonen

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine sehr informative Ansatz für die Definition Genexpressionsmuster in Embryonen. Die in-situ-Hybridisierung Verfahren sind langwierig und technisch anspruchsvolle mit mehreren wichtigen Schritten, die gemeinsam die Qualität des Endergebnisses beitragen. Dieses Protokoll beschreibt im Detail einige wichtige Qualitätskontrolle Schritte zur Optimierung Sondenmarkierung und Leistung. Insgesamt bietet unser Protokoll eine detaillierte Beschreibung der kritischen Schritte notwendig, um reproduzierbar zu erhalten qualitativ hochwertige Ergebnisse. Zunächst beschreiben wir die Erzeugung von Digoxigenin (DIG) markierten RNA-Sonden über In-vitro-Transkription der DNA-Templates mittels PCR generiert. Wir beschreiben drei kritischen Qualitätskontrolle Assays, um die Menge, die Integrität und die spezifische Aktivität des DIG-markierten Sonden zu bestimmen. Diese Schritte sind für die Erzeugung einer Sonde eine ausreichende Empfindlichkeit, um endogene mRNAs in einer ganzen Maus-Embryo erkennen wichtig. Darüber hinaus beschreiben wir für die Fixierung und Lagerung von E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen für die in-situ-Hybridisierung. Dann beschreiben wir detailliert Methoden für begrenzte Proteinase K Verdau der rehydriert Embryonen durch die Details der Hybridisierungsbedingungen, post-Hybridisierung wäscht und RNase-Behandlung, um nicht-spezifische Sonden-Hybridisierung zu entfernen. Ein AP-konjugierte Antikörper verwendet, um die markierten Sonde visualisieren und zeigen die Expressionsmuster der endogenen Transkript. Repräsentative Ergebnisse sind aus der erfolgreichen Experimente und typische suboptimal Experimente gezeigt.

Das ganze Berg<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung Protokoll diskutiert kritische Schritte, die reproduzierbar hohe Qualität der Ergebnisse zur Genexpression Studien in E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen zu gewährleisten.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Die Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung ist ein sehr aufschlussreicher Ansatz zur Bestimmung von Genexpressionsmustern in Embryonen. Die In-situ-Hybridisierungsverfahren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Genexpressionsmuster in gesamten Maus-Embryonen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine spezifische Ribo-Sonde für das Gen der Interesse entworfen und hergestellt wird. Anschließend werden die Embryonen gesammelt und für die Hybridisierung vorbehandelt.Anschließend wird die markierte Sonde an die Embryonen hybridisiert. Der letzte Schritt besteht in der Visualisierung der hybridisierten Sonde mittels immunhistochemischer Detektion. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Expressionsmuster von Genen in ganzen Embryonen oder Embryonenschnitten zeigen.Nach der Bildgebung mit einem Stereomikroskop, Zerreißmikroskop oder einem herkömmlichen Hellfeldmikroskop haben in der Regel Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Hybridisierungsverfahren zeitaufwändig und technisch anspruchsvoll sind und mehrere wichtige Schritte insgesamt zur Qualität des Endergebnisses beitragen. Zunächst wird eine Vorlage-DNA erzeugt, indem die Sequenz des Interesses mit gen-spezifischen PCR-Primern, die an den 5'-Enden mit Farbtranskriptions-Promotorsequenzen ausgestattet sind, amplifiziert wird. Danach wird das PCR-Produkt gereinigt und gemäß dem schriftlichen Protokoll ein Proteinase-K-Digestionsschritt durchgeführt.Danach ein In-vitro-Transkriptionsreaktion aufsetzen und zwei Stunden bei optimaler Inkubatortemperatur inkubieren. Nach der DNA-Digestion der DNA-Vorlage den Ribo-Probe mittels Säulenaufreinigung aufreinigen und die Probenausbeute mittels NanoDrop oder Mikroplattenabsorptionsreader bestimmen. Anschließend die Probenkonzentration entsprechend der geschätzten Ausbeute auf 100 Nanogramm pro Mikroliter einstellen.Überprüfen Sie anschließend die Qualität der Sonde mittels denaturierender Acrylamid-Gelelektrophorese, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, und durch Messung der spezifischen Aktivität der RIBA-Sonde. Eine gute Sonde sollte eine einzelne scharfe Bande im Gel ergeben, mit minimaler Verschmierung. Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität führen Sie eine serielle Verdünnung der Ribo-Sonde durch, um eine Reihe von Verdünnungen von 10 hoch minus zwei bis 10 hoch minus fünf zu erhalten. Pipettieren Sie dann ein Mikroliter jeder Verdünnung auf ein 82 Millimeter durchmessendes Stück High-Bond-N-plus-Membran, zusammen mit einem Mikroliter einer unmarkierten DNA-Probe als Kontrolle. Vernetzen Sie den Filter unmittelbar danach in einem UV-Vernetzungsgerät bei 125 Millijoule.Geben Sie 10 Milliliter 1 % Blockierreagenz in 1× TN-Puffer hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, nachdem die Blockierung abgeschlossen ist. Entfernen Sie die Blockierlösung und waschen Sie den Filter 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 10 Milliliter 1× TN-Puffer, während Sie die Membran waschen. Bereiten Sie nach dem Waschen eine 1:5.000-Verdünnung von Anti-Doxygen im FAB-Fragment in 10 Milliliter 1× TN-Puffer vor.Inkubieren Sie die Membran 30 Minuten lang in dieser Lösung. Nach der Inkubation waschen Sie die Membran zweimal je 15 Minuten mit 10 Milliliter einermaliger TN-Pufferlösung. Nach dem letzten Waschschritt saugen Sie die Waschlösung aus der Petrischale ab und ersetzen Sie durch fünf Milliliter BM-Purpursubstrat. Inkubieren Sie die Membran 30 Minuten lang in dieser Lösung.Nach Ablauf von 30 Minuten überprüfen Sie die Membran auf das Vorhandensein eines sichtbaren Signals, das von der Stelle der 10 hoch minus 4 Verdünnung ausgeht. Ist das Signal sichtbar, beenden Sie die Farbreaktion durch zweimaliges Waschen mit fünfmaligem TE jeweils fünf Minuten lang. Ist nach 30 Minuten kein Signal sichtbar, sollte die Sonde verworfen werden.Sammeln Sie Maus-Embryonen in eiskaltem PBST. Sortieren Sie die Embryonen anschließend nach Genotyp in Vials mit Schraubverschluss mit einem Fassungsvermögen von vier Milliliter, die PBST enthalten. Fixieren Sie die Embryonen mit 4% PARALDEHYD in PBST, sofern nicht anders angegeben.Alle Inkubations- und Waschschritte werden mit Lösungen durchgeführt, die bis zur unteren Halskante des Vials gefüllt sind und ein Volumen von etwa vier Millilitern haben. Belassen Sie die Embryonen nach der Fixierung über Nacht bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie das 4%ige Paraldehyd in PBST mit einer Glas-Pasta-Pipette und ersetzen Sie es durch PBST.Stellen Sie das Gefäß fünf Minuten lang auf Eis, um zu waschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um das Gewebe ein zweites Mal zu waschen. Danach saugen Sie das PBST ab und dehydrieren die Embryonen schrittweise durch eine Methanol/PBST-Reihe in 100 % Methanol. Beachten Sie, dass die Pipettenspitze auf der gegenüberliegenden Seite des Gefäßes gehalten wird, um eine Beschädigung der Embryonen zu vermeiden. Falls gewünscht, können die Embryonen bis zu acht Monate und möglicherweise länger bei minus 20 Grad Celsius in 100 % Methanol gelagert werden, bis sie verwendet werden. Überführen Sie die Embryonen in eine Schale, stechen Sie mit einem Mikrodissektionsmesser in das Herz und den Kopf von E10,5 und älteren Embryonen, während sich die Embryonen noch in Methanol befinden. Dadurch können Spüllösungen in die Gehirnventrikel und Herzkammern eindringen und die Hintergrundanfärbung wird verringert.Danach hydratisieren Sie die Embryonen erneut durch aufeinanderfolgende Waschungen in einer Reihe mit Methanol in PBST. Schließen Sie mit zwei Waschungen in 100 % PBST ab, die jeweils fünf Minuten dauern, und bleichen Sie die Embryonen, indem Sie eine Lösung aus vier Teilen PBST und einem Teil 30 %igem Wasserstoffperoxid herstellen und die Embryonen eine Stunde lang auf Eis in dieser Lösung inkubieren. Während der Inkubation erwärmen Sie frisch zubereiteten Hybridisierungspuffer auf 65 Grad Celsius vor.Waschen Sie die Embryonen zweimal mit PBST, jeweils fünf Minuten lang. Während des letzten Waschschritts stellen Sie einen 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase-K-Stammlösung mit DEPC-Wasser her. Verdünnen Sie die Stammlösung anschließend seriell, um eine Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.Proteinase K in PBST das letzte Waschpuffer abpipettieren und durch ein Milliliter der Lösung mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K ersetzen. Das Gefäß senkrecht in ein Reagenzglasgestell in einem Wasserbad von 25 bis Grad Celsius stellen und 10 bis 30 Minuten inkubieren, abhängig von der Größe der Embryonen. Den Beginn der Inkubation notieren, da dieser Zeitpunkt optimal und reproduzierbar sein sollte.Die Inkubationszeit ist entscheidend, um das Eindringen der Ribo-Sonde zu ermöglichen, ohne den Embryo übermäßig zu verdauen. Um die Proteinase-K-Verdauung zu stoppen, saugen Sie die Proteinase-K-Lösung 30 Sekunden vor Ablauf der Inkubationszeit ab. Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, geben Sie frisch hergestelltes Glycin (zwei Milligramm pro Milliliter) in PBST hinzu.Stellen Sie sich fünf Minuten bei Raumtemperatur hin. Wiederholen Sie dann die Glycin-Waschung für weitere fünf Minuten. Anschließend zweimal für jeweils fünf Minuten in PBST waschen.Fixieren Sie die mit Proteinase K behandelten Embryonen anschließend erneut, indem Sie die Embryonen für 20 Minuten in 4 % PARALDEHYD in PBST, ergänzt mit 0,2 % Glutaraldehyd, einsetzen. Danach waschen Sie die Embryonen dreimal für jeweils fünf Minuten in PBST. Nach dem letzten Waschschritt saugen Sie das PBST ab und ersetzen es durch ein Milliliter vorgewärmten Hybridisierungspuffer.Sobald sich die Embryonen abgesetzt haben, saugt man den Hybridisierungspuffer ab und ersetzt ihn durch ein Milliliter frischen, vorgewärmten Hybridisierungspuffer. Inkubieren Sie die Gefäße eine Stunde lang vertikal in einem 65 °C warmen Ofen mit Schüttelplattform. Bereiten Sie einen Hybridisierungspuffer vor, der 0,5 Mikrogramm pro Milliliter markierten Ribo enthält.Verwenden Sie bis zu E 8.5 eine Sonde im Bereich von 0,1 bis einem Mikrogramm pro Milliliter, für Embryonen nach E 8.5 hingegen eine Sonde von bis zu E 8.5 oder 0,1 bis einem Mikrogramm pro Milliliter. Nach der Inkubation die Vorhybridisierungslösung durch 0,4 Milliliter dieser Lösung ersetzen und über Nacht bei 65 Grad Celsius hybridisieren. Am nächsten Tag die Qualität der Embryonen überprüfen.Wenn die Embryonen übermäßig mit Proteinase K behandelt wurden, können sie an der Größe des Gefäßes haften, erscheinen extrem transparent oder zerfallen. Solche Embryonen sollten verworfen werden, da ihre weitere Bearbeitung keine auswertbaren Daten liefern wird. Ersetzen Sie den Hybridisierungspuffer durch vier Milliliter Lösung.Eines bei 70 Grad Celsius. Diese Temperatur halten und zweimal je 30 Minuten für E8,5-Embryonen oder dreimal je 30 Minuten pro Waschgang waschen. Für E9,5 und ältere Embryonen während des letzten Waschgangs vier Milliliter einer 50%igen Lösung, eine 50%ige Lösung zwei für jedes Gefäß vorbereiten und nach dem letzten Waschgang auf 70 Grad Celsius vorwärmen.Die Embryonen 10 Minuten lang in dieser Lösung inkubieren, anschließend dreimal je fünf Minuten mit vier Millilitern Lösung waschen. Zwei Mal bei Raumtemperatur unter Schütteln nach dem Waschen. Die Lösung durch frische Lösung ersetzen.Zwei enthaltend 100 Mikrogramm pro Milliliter RNA A und 100 Einheiten pro Milliliter RNA T werden bei 37 Grad Celsius jeweils zweimal 30 Minuten pro Waschgang inkubiert. Anschließend Waschlösung drei bei 65 Grad Celsius mit Schütteln jeweils zweimal 30 Minuten pro Waschgang für E 8,5 und dreimal 30 Minuten pro Waschgang für E 9,5 und älter. Schließlich dreimal jeweils fünf Minuten pro Waschgang mit 1× TBST waschen.Danach mit der Antikörperdetektion fortfahren. Die letzte TBST-Waschung aus dem Gefäß absaugen und durch 0,5 Milliliter 1× TBST mit 10 % hitzebehandeltem Schafserum ersetzen. Das Gefäß senkrecht auf einen Plattenschüttler stellen und bei Raumtemperatur mindestens zweieinhalb Stunden unter Rütteln inkubieren, um unspezifische Antikörperbindungsstellen zu blockieren.Nach Ablauf der Inkubationszeit die Blockierungslösung abpipettieren und durch frische 1× TBST mit 10 % Serum ersetzen, das eine Verdünnung von 1:2.000 bis 1:5.000 des subtrahierten alkalischen Phosphatases, konjugiert mit Schafs-Antigen und FAB-Fragment-Antikörper, enthält, und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Dreimal je fünf Minuten mit 1× TBST waschen. Anschließend fünf- bis sechsmal je eine Stunde bei Raumtemperatur und schließlich über Nacht bei vier Grad Celsius waschen, um überschüssigen Antikörper zu entfernen.Am nächsten Tag. Waschen Sie die Embryonen zweimal für jeweils 20 Minuten mit frisch hergestelltem alkalischer Phosphatase-Puffer. Dies ist ein wichtiger Schritt, um die Hintergrundfärbung zu reduzieren.Ersetzen Sie die letzte Waschung durch ein Milliliter vorgewärmtes BM Purple AP-Substrat. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt, und überprüfen Sie regelmäßig das Signal mittels Stereomikroskop. Für reichlich vorhandene Botenmoleküle.Die RNA sollte innerhalb von 15 Minuten sichtbar sein. Sobald das Signal deutlich sichtbar ist oder wenn eine zunehmende Hintergrundanfärbung problematisch wird, beenden Sie die Reaktion durch zweimaliges Waschen mit jeweils fünfminütiger Dauer pro Waschgang mit PBST eins mal plus fünf Millimolar EDTA, und erfassen Sie Bilder, um das Färbungsmuster des Ganzpräparats des Embryos zu dokumentieren. Danach bringen Sie die Embryonen in ein Gefäß mit BM-Purple-Substrat zurück und inkubieren sie 16 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur, bis die äußere Oberfläche des Embryos dunkelblau wird, um eine vollständige Durchdringung der Färbung im gesamten Embryo zu ermöglichen.Anschließend die Embryonen in 4 % Parmal Hide in PBST überführen, um sie mehrere Stunden oder über Nacht bei vier Grad Celsius erneut zu fixieren. Dieser endgültige Fixierungsschritt ist entscheidend für die langfristige Erhaltung des Färbemusters. Abschließend gemäß den im schriftlichen Protokoll beschriebenen Verfahren zur Paraffineinbettung und Schnittführung übergehen, um diese Färbung sichtbar zu machen.Dieses Bild zeigt eine erfolgreiche Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung eines E10,5-Embryos unter Verwendung einer gata3-spezifischen Ribo-Sonde. Hier ist ein Bild eines E11,5-Embryos, der erfolgreich mit einer FoxG1-spezifischen Ribo-Sonde markiert wurde. Dieses Bild zeigt eine hohe Hintergrundfärbung und ein schwaches Signal aus einer fehlgeschlagenen Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung mit einer teilweise degradierten gata3-Sonde, was die Bedeutung einer sorgfältigen Qualitätskontrolle der Sonden zur Sicherstellung hochwertiger Ergebnisse verdeutlicht.Hier ist ein Bild eines weiteren erfolglosen Verfahrens. In diesem Fall wurde das Verfahren durchgeführt, ohne den Kopf zu punktieren, was zu einer hohen Hintergrundanfärbung in den Ventrikeln führte, wie durch die Pfeilspitzen angezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine qualitativ hochwertige In-situ-Hybridisierung durchführt, um Genexpressionsmuster an Maus-Embryonen hinsichtlich räumlicher Details sowie zeitlicher oder Genotyp-Vergleiche zu bestimmen.

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge...

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

Wir präsentieren hier ein optimiertes Protokoll zur Genotypisierung, Färbung und Vorbereitung fötaler Mäuse für die Bildgebung von peripheren Nozizeptoren-Axonprojektionen im gesamten Tier, als effektive Methode zur Beurteilung sensorischer Axonwachstumsphänotypen bei der Entwicklung gentechnisch veränderter Mäuse.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

Wir demonstrieren eine Methode zur Transplantation von kultivierten Zellen in definierte Stellen von frühen Mausembryonen, um ihr in vivo Potenzial zu bestimmen. Wir stellen auch eine optimierte Elektroporationsmethode vor, bei der Glaskapillaren mit bekanntem Durchmesser verwendet werden, was die präzise Abgabe von exogener DNA in einige wenige Zellen in den Embryonen ermöglicht.

Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll mit hochauflösender episkopischer Mikroskopie, um dreidimensionale (3D) Bilder von Mausembryonen zu erfassen. Dieses verbesserte Protokoll verwendet eine modifizierte Gewebepräparationsmethode, um die Penetration des Fluoreszenzfarbstoffs zu verbessern und so die morphometrische Analyse sowohl kleiner als auch großer Proben zu ermöglichen.

Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie

Die Knoten und notochordal Platte sind vergänglich Signalisierung Organisatoren bei der Entwicklung von Mäuseembryonen, die mit mehreren Techniken visualisiert werden können. Hier beschreiben wir im Detail wie Sie zwei Techniken ihre Struktur und Morphogenese durchführen: 1) Rasterelektronenmikroskopie (SEM); und 2) ganze Berg Immunfluoreszenz (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

Wir präsentieren Ihnen die Protokolle, um die Maus Herz Entwicklung mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie auf Mausembryonen seziert von ventrikulären spezifische MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns, jede Stufe der ventrikulären Formation während der Maus Herz Entwicklung ohne arbeitsintensive histochemische Methoden direkt zu visualisieren.

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

Klassischerweise wurde das Endokard des embryonalen Klappenprimordiums der Maus anhand transversaler, koronaler oder sagittaler Schnitte analysiert. Unser neuartiger Ansatz für die enface, zweidimensionale Bildgebung des Endokards in valvulogenen Regionen ermöglicht eine planare Polaritäts- und Zellumlagerungsanalyse des Endokards während der Klappenentwicklung.

En Gesicht Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Lernen Sie die Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von Genexpressionsmustern in Maus-Embryonen (E8.5-E11.5). Diese Methode ermöglicht präzise Analysen in der Entwicklungsbiologie.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

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