In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Trium-Castin-Telomerase in vitro zu rekonstituieren und ihre Aktivität zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst rekombinant his tag, Trillium Castine turt oder TC turt protein in e coli exprimiert wird. Das exprimierte TC-Turt-Protein wird dann durch verschiedene Chromatographie-Schritte aufgereinigt.

Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Trium-Kastilkäfer zu kultivieren und die Gesamt-RNA aus den Larven des Trium-Kastankäfers zu isolieren. Das Telomerase-Enzym wird dann in vitro rekonstituiert, indem rekombinantes TC-Turt mit der extrahierten Gesamt-RNA gemischt wird. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass in vitro Telomerase, die aus rekombinantem Protein und Gesamt-RNA rekonstituiert wurde, einen Akt des Telomerase-Enzyms hervorruft, wie im Trap-Assay visualisiert.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Trium-KE-Telomerase geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie andere Proteinnukleinsäurekomplexe angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Isolierung der Käfer-Gesamt-RNA extrem empfindlich auf den RNA-Abbau reagiert und daher große Sorgfalt geboten ist, um eine ordnungsgemäße Rekonstitution zu gewährleisten. Dieses Protokoll beginnt mit der Expression von rekombinantem TC TURP mit der Tabakätzvirusprotease Cleavable N terminal HEXA Histamin-Tag in transformierten Rosetta DE drei P lyse S-Zellen, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Nach der Zellernte beschallen Sie die Zellen auf Eis für zwei Minuten in 32. Intervallen mit 32. Pausen bei etwa 51 Watt Leistung.

Schleudern Sie die lysierten Zellen 20 Minuten lang bei 18.000 U/min, um die löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen zu trennen und das SUP-Natin vorsichtig zu entfernen. Reinigen Sie das Supra-Natin mit Hilfe der Nickel-Affinitätschromatographie gemäß dem schriftlichen Protokoll. ELUTE TC treibt das Nickel-NTA-Harz mit einem Ole-Gradienten ab und sammelt drei Milliliterfraktionen.

Verwenden Sie für die SDS-Seitenanalyse die Seitenanalyse, um zu bestimmen, welche Fraktionen das TC-Turt-Protein enthalten. Konzentrieren Sie diese Fraktionen in einem AmCon 30 Kilodalton Millipore-Filter auf ein Volumen von weniger als 10 Millilitern. Als nächstes wird eine poröse HS-Säule voräquilibriert.

Um das TC Turt-Protein durch Kationenaustauschchromatographie weiter zu reinigen, laden Sie die Proteinmischung auf die poröse HS-Säule und waschen Sie sie, um alle Protein- und Nukleinsäureverunreinigungen zu entfernen. Waschen Sie die Säule weiter mit einem Puffer mit 500 Millimolar Kaliumchlorid, gefolgt von 700 Millimol Kaliumchlorid, um alle verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen. Eluieren Sie das TC Turt-Protein von der porösen HS-Säule mit einem molaren Kaliumchlorid-Puffer.

Zu diesem Zeitpunkt sollte das Protein zu mehr als 99 % rein sein. Entfernen Sie abschließend alle Proteinaggregate, indem Sie das Protein über eine voräquilibrierte SUEx 200-Größenausschlusssäule leiten. Das gereinigte TC Turt-Protein ist nun bereit für die In-vitro-Rekonstitution.

Einige Wochen vor diesem Protokoll wurde die Trium-Castin-Kultur gestartet, indem 100 adulte Käfer in einen Behälter mit 28,5 Gramm Mehl und 1,5 Gramm getrockneter Backhefe gegeben wurden. Die Kulturen wurden drei bis vier Wochen lang bei Raumtemperatur in einer dunklen, feuchten Umgebung gelagert, um die Vermehrung und das Wachstum zu ermöglichen. Ernten Sie nach der Inkubation 20 Käferlarven aus der Kultur, indem Sie sie von den adulten Käfern und der Blütenhefekultur trennen.

Entfernen Sie Blüten- oder Hefepartikel, die an den Käfern haften, bevor Sie sie zerkleinern. Sterilisieren Sie den Bankbereich sowie den Mörser und Stößel mit RNA Zap, um alle Spuren von Ribonuklease zu entfernen, bevor Sie die Käfer in flüssigem Stickstoff zerkleinern. Mahlen Sie die Larven mit dem Mörser und dem Stößel zu einem feinen Pulver.

Übertragen Sie das Pulver in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, während der flüssige Stickstoff erhalten bleibt, um sicherzustellen, dass das Pulver gefroren bleibt, bis der Extraktionspuffer hinzugefügt wird. Lassen Sie überschüssigen Flüssigstickstoff aus dem Pulver verdampfen, nachdem der Flüssigstickstoff verdampft ist. Das Käferpulver in 200 Mikrolitern Extraktionspuffer homogenisieren und 30 Minuten auf Eis inkubieren.

Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 15.000 U/min für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation wird der gesammelte Überstand in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Extrahieren Sie schließlich die Gesamt-RNA mit dem Kyogen RN easy Minikit.

Beginnen Sie mit der In-vitro-Rekonstitution von T-Castin-Telomerase, indem Sie 20 Mikrogramm rekombinantes histisches TAG TC TURP-Protein mit 50 Mikrolitern T-Castin-Gesamt-RNA in Bindungspuffer mischen, inkubieren Sie das TC-Turt-Gesamt-RNA-Gemisch zwei Stunden lang bei 22 Grad Celsius in T-Castin-Lysat und dem Vorhandensein eines RN-aen-Inhibitors, um den RNA-Abbau zu verhindern. Zum Schluss reinigen Sie den Komplex über einer Nickel-NTA-Säule, um Lysatverunreinigungen und überschüssige RNA zu entfernen. Die rekonstituierte t-Castin-Telomerase ist nun bereit für den Telomerase-Repeat-Amplifikationsprotokoll-Assay.

Zu Beginn des Trap-Assays werden vier Mikrogramm Nickel-NTA-gereinigtes T-Castin-Telomerase in 50 Mikroliter Elongationspuffer gemischt. Inkubieren Sie die Mischung bei 30 Grad Celsius für 60 Minuten. Um die Verlängerung der Einzelstrang-DNA durch die rekonstituierte T-Castin-Telomerase zu ermöglichen.

Die längliche einzelsträngige DNA wird extrahiert, indem dem Reaktionsgemisch ein gleiches Volumen Phenolchloroform zugesetzt wird. Schütteln Sie die Mischung vorsichtig, bis die Emulsion homogen ist. Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 12.000 U/min, um einzelsträngige DNA von Verunreinigungen zu trennen.

Übertragen Sie die oberste wässrige Schicht der Probe in ein 1,5-Milliliter-Einorröhrchen. Nach Zugabe von Natriumacetat pH 5,0, Magnesiumchlorid und Ethanol lassen Sie die Probe am nächsten Tag über Nacht bei minus 20 Grad Celsius ausfällen. Schleudern Sie die Probe 30 Minuten lang bei 15.000 U/min bei vier Grad Celsius, um die ausgefällte einzelsträngige DNA zu pelletieren.

Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette und fügen Sie dann 200 Mikroliter 70%iges Ethanol zur Probe hinzu, um das restliche Natriumacetat und Magnesiumchlorid auszuwaschen. Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei der gleichen Geschwindigkeit und Temperatur, um das Probenrohr abzustoßen. Die Ethanollösung wird abgenommen und die restlichen Ethanolspuren getrocknet, indem das Einor-Röhrchen drei Minuten lang offen bei Raumtemperatur inkubiert wird.

Das Vorhandensein von Ethanol in der Probe hemmt die PCR-Amplifikation Nachdem das Ethanol getrocknet ist, wird das einzelsträngige DNA-Pellet und 50 Mikroliter PCR-Reaktionspuffer durch die Wiederbelebung suspendiert. Anschließend werden die Telomerase-Elongationsprodukte nach der Amplifikation durch PCR amplifiziert. Führen Sie ein 12%iges Polyacrylamid-Gel mit Tris Bore Eight EDTA Running Buffer 30 Minuten lang vor.

Nachdem Sie das Gel vorgeführt und mit den PCR-Reaktionen geladen haben, lassen Sie das Gel 1,5 bis zwei Stunden lang bei 185 Volt laufen. Trocknen Sie als letzten Schritt das Gel und verwenden Sie die Phosphor-Speicherfolie, um die gezeigte Aktivität zu visualisieren. Hier ist ein Beispiel für gereinigten TC-Turt nach Größenausschlusschromatographie.

Das nach der Reinigung konzentrierte Protein wird auf ein 12%iges SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen und ist nachweislich zu mehr als 99% rein, was eine Größenausschlüsse darstellt. Ein Chromatogramm wird ebenfalls bereitgestellt, um die Reinheit und das Fehlen von Aggregaten aus der gereinigten Proteinprobe nachzuweisen. Beachten Sie, dass die endgültige Proteinausbeute variieren kann.

Obwohl eine erwartete Ausbeute bei fünf bis 10 Milligramm liegt, wird nach Abschluss aller Reinigungsschritte ein repräsentativer Trap-Assay für die rekonstituierte T-Castin-Telomerase gezeigt. Die stufenweise Leiter der Telomerase-Produkte ist in Spur eins zu sehen. Sie fehlen jedoch sowohl in den RNA-behandelten Telomerase-Proben als auch in den Turt-Mutantenproben des aktiven Zentrums auf Spur zwei bzw. drei.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Telomerase-Enzym in vitro mit rekombinantem Protein und Gesamt-RNA rekonstituieren können, und in der Lage sein, die Telomerase-Aktivität zu testen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben, insbesondere die extrahierte Gesamt-RNA, mit großer Sorgfalt zu behandeln, da eine Kontamination von R a kein Ergebnis liefert.