Name: Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Chromatin-Immunopräzipitation aus Spinalganglien nach axonaler Schädigung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und epigenetischen Modifikationen für Nervenregenerationsforschung.

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Wir möchten Andrea Tedeschi für Hilfe bei der Einstellung der anfänglichen Chip-Experimente im Labor und Ricco Lindner für seinen Beitrag zur Feinabstimmung der Bedingungen für ChIP. Diese Arbeit wurde von der Hertie-Stiftung unterstützt, die Fortune-Grant, Universität Tübingen und der DFG DI 1497/1-1 Zuschüsse (alle Simone Di Giovanni gewährt).

1. Ischias &amp; dorsalen Säule Nervenverletzung <ol><li> Das Tier befindet sich auf einem OP-Tuch gelegt und unter eine Thermopad ist während des gesamten Verfahrens anwesend halten die Körpertemperatur der Maus bei 37 ° C. Alle Tiere werden anästhesiert für Chirurgie mit einer kontinuierlichen Isofluran / O 2-Administration. Chirurgische Instrumente sind vor dem Eingriff autoklaviert. </li><li> Für Ischias-Verletzung, sind beide Hinterhand sorgfältig rasiert und Enthaarung mit generischen Haarentferner vor der Reinigung der Haut mit Alkohol Betadyne 3 mal gefolgt abgeschlossen. </li><li> Der Ischiasnerv ist, indem Sie einen 4 mm Inzision posterior und parallel zum Femur der Mitte des Oberschenkels durch die Haut und durch die Verbreitung der Muskeln mit Ausnahme des Bizeps femoris mit feinen Pinzetten ausgesetzt. </li><li> Die exponierte Ischiasnerv wird dann verletzt, und die Haut wird mit zwei Klammern für chirurgische Nähte verschlossen. </li></ol> HINWEIS: Die gleichen Schnitt gemacht, um den Ischiasnerv aussetzen, aber die Wunde wird vernäht Verlassen der Nerv intakt für die Schein-Verletzungen. <ol start="5"><li> Für dorsalen Säule Verletzungen, ist die Rückseite der Maus sorgfältig rasiert und Enthaarung mit generischen Haarentferner vor der Reinigung der Haut mit Alkohol Spray / Swipe abgeschlossen. </li><li> Das Rückenmark ist, indem eine 2,5 cm lange Inzision von etwa T7 bis T13 ausgesetzt. Die Haut wird abgesehen, zu verbreiten und das Bindegewebe wird entlang der Wirbel von T9 bis T11 entfernt. </li><li> Eine Laminektomie ist bei T10-Ebene durchgeführt </li></ol> HINWEIS: Für die meisten Experimente, die Laminektomie gilt als die Sham Verletzungen. <ol start="8"><li> Ein paar Tropfen Xylocain sind, um das Gewebe hinzugefügt, um das Kabel zu betäuben, und die Dura mater entfernt ist, achten nicht auf das Rückenmark zu berühren. </li><li> Die dorsale Säulen sind verletzt und der Muskel ist zu schließen, vernäht wieder Aufmerksamkeit nicht auf das Rückenmark zu berühren. Schließlich ist die Haut vernäht mit Klammern für chirurgische Nähte. Buprenorphin (0,1 mg / kg Körpergewicht) sollte zweimal täglich für 48 Stunden oder bis sie nicht mehr benötigt, verabreicht. </li></ol> 2. Die Vernetzung <ol><li> Dissect L4 und L5 DRG von verletzten Mäusen nach euthanization. Sammle insgesamt 16 DRG in eiskaltes HBSS + Protease-Inhibitoren-Cocktail (2 Verletzte und 2 sham DRG von jedem Tier für insgesamt 4 Tiere). </li><li> Kurz zentrifugieren DRG, dann vorsichtig den HBSS und fügen 500 ul 1% Formaldehyd in PBS + Protease-Inhibitoren-Cocktail und inkubieren Sie die Probe für 30 Minuten bei 37 ° C. </li></ol> Entscheidender Schritt. Verwenden Sie frische, Molekularbiologie Formaldehyd. <ol start="3"><li> Add 125 mM Glycin, um die Fixierung und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur zu stoppen. </li><li> Kurz zentrifugieren, absaugen Puffer, und waschen Sie das Gewebe zweimal mit 500 ul eiskaltem PBS + Protease-Inhibitoren-Cocktail. </li></ol> 3. Kerne Vorbereitung und Chromatin Scheren <ol><li> Absaugen PBS, fügen Sie 400 ul SDS Lysepuffer, Transfer zu einem vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen und stören das Gewebe mit ca. 30 Schläge mit dem Mikropistill. </li></ol> Entscheidender Schritt. Lysis und Störungen des Gewebes sind entscheidend für eine gute Ausbeute an vernetztem Chromatin. <ol start="2"><li> Mit Ultraschall die Probe mit 8 Impulse, 10 Sekunden jeweils bei 70% Leistung (Bandelin, Sonoplus GM70). </li></ol> VORSICHT. Die Scherung des Chromatins müssen für Ihre speziellen Beschallung optimiert werden eingerichtet und richtige Fragmentierung des Chromatins sollten, bevor Sie die tatsächliche IP-Experiment überprüft werden (siehe Abschnitt 3). HINWEIS. Fragmentierung des Chromatins könnte auch durch Mikrokokken-Nuclease (MNase) Verdauung durchgeführt werden. Als Faustregel gilt, ist die Fragmentierung durch Beschallung für feste Gewebe bevorzugt, während MNase Verdauung für native Gewebe Chromatinimmunpräzipitation begünstigt wird. Cross-linked kann geschert Chromatin bei -80 ° C bis zu 2 Monate gelagert werden, aber vermeiden Sie wiederholte Frost / Tau-Zyklen. 4. Analyse von Chromatin-Verdauung (empfohlen) <ol><li> Entfernen 10 pl Ihrer geschert Chromatin Probe für die Analyse. Add 200 mM NaCl auf die Probe und umgekehrt die Cross-Link durch Inkubation bei 65 ° C für 2h. </li><li> Purify DNA (siehe Abschnitt 8) und führen Sie ein 1% Agarosegel. DNA sollte eine Länge von ca. 200-1000 bp (Abbildung 1) fragmentiert. </li></ol> VORSICHT. Over-Fragmentierung von Chromatin kann zu einer verminderten Signal führen, während unvollständige Fragmentierung zu einer verminderten Auflösung und erhöhter Hintergrund führen wird. 5. Immunpräzipitation <ol><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Immunpräzipitation Reaktionen (siehe Hinweis unten), und teilen Proben zu gleichen Teilen in neuen Schläuchen. Bringen Sie die Lautstärke der einzelnenbis zu 500 ul mit ChIP-Puffer + Protease-Inhibitoren-Cocktail. </li><li> Entfernen 5 ul der verdünnten Probe und Überführung in eine neue Röhre. Dies ist Ihr 1% Eingangs-Sample, und es wird bei -20 ° C gelagert werden, bis sie benötigt (§ 7). </li><li> Für jede Immunpräzipitation, fügen Sie entsprechende Antikörper oder normalen IgG-Steuerung und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht mit einer Rotation. </li></ol> HINWEIS. Bei der Bestimmung der Anzahl der Immunpräzipitation, eine positive Kontrolle (zB Histone H3 Antikörper) und eine negative Kontrolle (Normal IgG) in Betracht gezogen werden. Die Menge der Antikörper für jedes IP verwendet wird, variiert zwischen Antikörpern und muss empirisch ermittelt werden. Allerdings ist es in der Regel innerhalb eines Bereichs von 2-10? G / Immunpräzipitation. <ol start="4"><li> Um Immunopräzipitat Ihren Antikörper / Protein / DNA-Komplex, fügen Sie 30 ul ChIP Grade Protein G Magnetic Beads und Inkubation für 2 h bei 4 ° C mit Rotation. </li></ol> 6. Waschen <ol><li> Um Pull-Down-gebunden Chromatin-Bead-Komplex, platzieren Sie den Schlauch auf die magnetischen Rack. Warten Sie, bis die Lösung klar ist und dann vorsichtig entfernen Sie Ihre Überstand. </li><li> 1 ml salzarme waschen (ChIP-Puffer), die Perlen und inkubieren Sie bei 4 ° C für 3-5 Minuten mit einer Rotation, dann Pull-Down-Perlen und absaugen waschen, wie in Schritt 6.1. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 3 Wäschen. </li><li> 1 ml der hohen Salz-Waschpuffer (ChIP-Puffer + 350 mM NaCl), die Perlen und Inkubation für 3-5 Minuten mit einer Rotation, dann Pull-Down-Perlen und absaugen waschen, wie in Schritt 6.1. </li></ol> 7. Elution und Umkehrung der Vernetzung <ol><li> Nehmen Sie Ihre Eingabe Proben aus der -20 ° C, fügen Sie 150 ul ChIP Elutionspuffer und beiseite stellen bei Raumtemperatur bis Step 7.5. </li><li> Add 150 ul 1x ChIP Elutionspuffer für jede IP-Probe aus Schritt 6.3. </li><li> Legen Sie die Rohre in einem Thermomixer und eluieren das Chromatin aus den Kügelchen durch Inkubation Proben bei 65 ° C für 30 Minuten unter leichtem Vortexen. </li><li> Pull-Down-Perlen auf dem magnetischen Rack und transferieren es vorsichtig in den eluierten Chromatin (Überstand) in neue Schläuche. </li><li> Um alle Rohre, einschließlich Ihrer Eingabe Proben, fügen Sie 200 mM NaCl und 40 ug / Reaktion der Proteinase K und Inkubation bei 65 ° C für 2 Stunden. </li></ol> HINWEIS. Die Elutionsschritt kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, auch, aber es wäre nicht so effizient. 8. DNA-Gewinnung <ol><li> Add 1 Volumen Phenol / Chloroform Ihre Proben aus Schritt 7,5 und Vortex für 30 Sekunden. </li><li> Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> Sorgfältig wieder die wässrige (obere) Phase in neue Schläuche, fügen Sie 1 Volumen Chloroform in die wässrige Phase und Vortex für 30 Sekunden. </li><li> Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> Sorgfältig wieder die wässrige (obere) Phase in neue Schläuche, dann fügen Sie 300 mM NaOAc, 20 ug / Reaktion von Glykogen und 2,5 Volumina eiskaltem 100% Ethanol. </li></ol> VORSICHT. Die Zugabe von einem Träger, wie zB die Glykogen, ist notwendig, um die Fällung von relativ kleinen DNA-Fragmenten zu verbessern. <ol start="6"><li> Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden zur Fällung DNA. </li></ol> HINWEIS. Die Fällung kann auch über Nacht bei -20 ° C durchgeführt werden <ol start="7"><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und wäscht das gefällte DNA-Pellets mit 300 ul eiskaltem 70% Ethanol. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für 10 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig soviel Überstand wie möglich und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen. </li><li> Resuspendieren in 20 ul sterilem H 2 O. Die Proben sind nun bereit für die PCR oder die DNA kann bei -20 ° C gelagert werden </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Ein repräsentatives Ergebnis einer ChIP Experiment in DRGs folgenden Ischias-Läsion wird angezeigt (Abb. 1 und 2). Zuerst zeigen wir, fragmentierte DNA auf einer Länge von ca. 200-1000 bp (Abbildung 1). Zweitens zeigen wir, eine PCR-Signal folgende Chip von der proximalen Promotors des Wachstums associated protein-43 (GAP-43) nur auf Ischiasnerv Verletzungen (Spur 4, Abbildung 2, 5 "). Kein PCR-Signal vorhanden ist, wenn das Tier eine Farce Verletzungen empfängt nur (Spur 3), und bei der Verwendung von normalen IgG-Serum für die IP (Bahn 5 und 6). Um zu testen, für die Spezifität der Antikörper, analysierten wir die gleichen DNA-Proben, sondern verwendet eine Steuerung Primer, die eine Region erkennt in der 3'-UTR unserer Gen von Interesse, wo keine Belegung erwartet. PCR-Signale fehlen in allen Gassen (Spuren 3-6, Abb. 2, 3 '), außer für das Eingangssignal, was Nicht-IP-DNA-Proben als Standard-PCR-Kontrolle (Spur 1-2, Figure 2). Dieser Chip Verfahren kann entweder nach ischiadicus oder Rückenmarks Spalte Verletzungen durchgeführt werden wie folgt zusammengefasst in einer schematischen (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Agarosegel der umgekehrten vernetzten DNA, die durch Beschallung wurde auf den richtigen Bereich der Fragmentlängen geschert. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Semi-quantitative PCR-Ergebnisse aus DRG Gewebe nach Ischiasnerv Läsion zeigen, dass p53 acetylierten der GAP-43 proximalen Promotor-Region 48 Stunden nach der Verletzung des Ischiasnervs bindet. Kontroll-PCR aus der gleichen DRG Gewebe zeigen, dass p53 acetylierten nicht zu einer Kontrolle DNA-Region in der 3'-untranslatierten Region (UTR) der GAP-43-Gen (S = Sham, I = Verletzte) befindet sich zu binden. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Eine allgemeine Diagramm, das den Ort der Läsion Standorte auf den Ischiasnerv und der dorsalen Säule.

<ol><li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li>
<li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarey%2C+MF+%22Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%22">Chromatin immunoprecipitation (ChIP)</a>. , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).</li>
<li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28%26mu%3BChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li>
<li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Makwana, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li>
<li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+p53-CBP%2Fp300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression%2C+axon+outgrowth%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li>
<li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li>
</ol>

Dieses Protokoll bietet eine Methode, um direkt über die Chromatin-Umgebung stellen während der axonalen Regeneration im adulten Nervensystem folgende axonale Schädigung. Es enthält die DRG Verletzungen Modell mit Chromatin-Immunopräzipitation der Transkriptions-und epigenetische Umgebung im Anschluss an eine Verletzung des PNS oder ZNS entweder Sonde. Es ist besonders nützlich für die Ermittler, die gerne putative Bindungsstellen für ihre Lieblings-Transkriptionsfaktor zu charakterisieren, und würde, um festzustellen, ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> 10x ChIP Buffer </td><td> Cell Signaling </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2x ChIP Elutionspuffer </td><td> Cell Signaling </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> ChIP Grade Protein G Magnetic Beads </td><td> Cell Signaling </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Magna Grip Rack (8 gut) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> MERCK </td><td> UN 1888 </td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10x Glycin-Lösung </td><td> Cell Signaling </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> 10x HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Histone H3 Antikörper (Kaninchen) </td><td> Cell Signaling </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> Normal Rabbit IgG </td><td> Cell Signaling </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitoren Cocktail Tabletten </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinase K (20 mg / ml) </td><td> Cell Signaling </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS-Lysepuffer </td><td> Upstate </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Benötigte Ausrüstung </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropistill </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatin immunopräzipitation aus spinalganglien tissue folgende axonale schädigung

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axone im zentralen Nervensystem (ZNS) nicht regenerieren, während die in das periphere Nervensystem (PNS) regenerieren zu tun, um in begrenztem Umfang nach einer Verletzung (Teng et al., 2006). Es wird anerkannt, dass transkriptionelle Programme unerlässlich für Neuriten und axonale Auswachsen nach Verletzungen im PNS (Makwana et al., 2005) reaktiviert werden. Doch die Werkzeuge zur Verfügung, um neuronale Genregulation in vivo zu analysieren sind begrenzt und oft eine Herausforderung. Die Spinalganglien (DRG) bieten eine hervorragende Verletzungen Modellsystem, weil beide das ZNS und PNS durch eine gegabelte Axon, die aus dem gleichen soma innerviert. Die Ganglien stellen eine diskrete Ansammlung von Zellkörpern, wo alle transkriptionelle Ereignisse auftreten, und somit eine klar definierte Region transkriptionelle Aktivität, die sich leicht und reproduzierbar aus dem Tier entfernt werden kann. Verletzung von Nervenfasern im PNS (zB Ischiasnerv), wo axonale Regeneration auftritt, sollte man ein Set von Transkriptions-Programme, die sich von denen der Reaktion auf eine ähnliche Verletzung im ZNS, in denen eine Regeneration nicht stattfindet (z. B. Rückenmark ). Websites für Transkriptionsfaktorbindungsstellen, Histon-und DNA-Modifikation aus der Verletzung entweder PNS oder ZNS charakterisiert Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) werden. Hier beschreiben wir eine ChIP-Protokoll mit festen Maus DRG Gewebe nach axonalen Verletzungen. Diese leistungsstarke Kombination bietet ein Mittel zur Charakterisierung der pro-Regeneration Chromatin Umfeld für die Förderung der axonalen Regeneration.

Wir stellen eine Methode zur Chromatinimmunpräzipitation aus Spinalganglien Gewebe nach axonalen Verletzungen. Der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und epigenetische Modifikation von Histon-und DNA wichtig für die Regeneration von verletzten Axonen sowohl in den peripheren und zentralen Nervensystems zu identifizieren.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Axone im zentralen Nervensystem (ZNS) regenerieren nicht, während Axone im peripheren Nervensystem (PNS) nach ... in begrenztem Umfang regenerieren

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels Immunpräzipitation vernetzte Protein-DNA-Komplexe aus dem Gewebe der Rückenwurzelganglien nach Nervenverletzung zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Verletzung des Nervus ischiadicus oder der Hinterstränge induziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Probe zu vernetzen und den Protein-DNA-Komplex zu solubilisieren. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, einen spezifischen Protein-DNA-Komplex immunpräzipitieren. Abschließend wird die DNA gereinigt und zurückgewonnen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Anreicherung von DNA-Fragmenten anzeigen, die mit einem Protein oder einer DNA-Histon-Modifikation assoziiert sind.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der axonalen Regeneration zu beantworten, beispielsweise welche DNA-Bindungsstellen, Transkriptionsfaktoren und Histonmodifikationen für die Regulation von Genen erforderlich sind, die wichtig für die Förderung der axonalen Regeneration sind. Beginnen Sie damit, ein anästhesiertes Tier auf den Operationstisch zu legen. Wahren Sie die Anästhesie während der gesamten Operation durch kontinuierliche Gabe von Isofluran-Sauerstoff über eine Nasenkonne, bevor Sie fortfahren.Überprüfen Sie die korrekte Anästhesietiefe mittels Zehenquetschreflex für die Ischiasnervenverletzung. Rasieren Sie das Hinterbein vorsichtig und entfernen Sie verbleibende Haare mit einem Enthaarungsmittel. Nach der Haarentfernung reinigen Sie die Haut durch mehrfache Applikation von Alkohol, gefolgt von Betadine.Erstellen Sie einen vier Millimeter langen Schnitt durch die Haut posterior und parallel zum Femur. Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Muskeln in der Mitte des Oberschenkels auseinanderzuziehen und den darunterliegenden weißen Nervus ischiadicus freizulegen. Sobald der Nerv isoliert ist, kann er entweder unangetastet belassen werden, um als Schein-Operationskontrolle zu dienen, oder durchtrennt werden, um eine Verletzung auszulösen.Um den Vorgang abzuschließen, ziehen Sie die Haut zusammen und verschließen Sie sie mit zwei Nahtclips für die dorsale Säulenverletzung. Entfernen Sie die Haare vom Rücken und reinigen Sie die Operationsstelle wie zuvor gezeigt. Führen Sie einen 2,5 cm langen Schnitt oberhalb des Rückenmarks von etwa T7 bis T13 durch.Verwenden Sie feine Pinzette, um die Haut zu halten, während Sie das Fett abtrennen. Befestigen Sie anschließend das oberflächliche Fett mit zwei Haken. Sobald das Fett zurückgezogen ist, lokalisieren Sie das Blutgefäß im Zwischenraum zwischen der sechsten und siebten Wirbelsäule, das als Referenzpunkt dient.Schneiden Sie den Muskel beidseits über den achten und zehnten Wirbel und setzen Sie zwei Haken ein, um ihn offen zu halten. Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Muskulatur über dem Laminat von T8 bis T10 zu entfernen, wobei Sie den Dornfortsatz halten. Führen Sie eine Laminektomie an T10 durch, indem Sie den verbindenden Knochen auf beiden Seiten durchtrennen.Heben Sie vorsichtig die obere Hälfte der Wirbel an, um das darunterliegende Rückenmark freizulegen. Geben Sie einige Tropfen 2% Xylocain auf, um das Rückenmark zu betäuben, und entfernen Sie anschließend die Dura mater, wobei Sie darauf achten, das Rückenmark nicht zu berühren.Wenn an diesem Punkt abgebrochen wird, ergibt sich eine Schein-Operation als Kontrolle zur Verletzung der Hinterstränge. Führen Sie einen 0,3 bis 0,4 Millimeter tiefen Schnitt quer durch das Rückenmark durch. Schließen Sie abschließend den Muskel mit einer Naht und lösen Sie das oberflächliche Fettgewebe. Ziehen Sie die Haut zusammen und verschließen Sie sie mit Nahtclips. Stellen Sie das Tier zurück in den Heimkäfig und überwachen Sie es, bis es sich vollständig erholt hat. 48 Stunden nach der Verletzung euthanasieren Sie das Tier und entnehmen die L4- und L5-Dorsalwurzelganglien oder DRG.Der erste Schritt besteht darin, die ventrale Wirbelsäule freizulegen. Anschließend entfernen Sie die vordere Hälfte der Wirbel von T 12 bis L sechs. Um das Rückenmark freizulegen, identifizieren Sie die in dem zwischen den Wirbeln seitlich zum Rückenmark gelegenen Raum befindlichen Spinalganglien (DRGs).Verwenden Sie feine Pinzette, um die L4- und L5-DRG leicht anzuheben. Schneiden Sie so nah wie möglich am DRG-Körper. Sammeln Sie insgesamt 16 DRGs von vier Tieren und geben Sie sie in eiskaltes HBSS. Kurz die DRG zentrifugieren, 500 µL 1 % Formaldehyd hinzufügen und die Probe 30 Minuten lang inkubieren. Bei 37 °C 125 mM Glycin hinzufügen, um die Fixierung zu stoppen, und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach einer kurzen Zentrifugation den Puffer abpipettieren und das Gewebe zweimal mit jeweils 500 µL eiskalter PBS, ergänzt mit Proteaseinhibitoren-Cocktail, waschen.Als Nächstes das PBS abpipettieren und 400 Mikroliter SDS-Lysepuffer hinzufügen; das Gewebe anschließend mit etwa 30 Stößen eines Mikrostabmörsers auflösen. Danach das Chromatin mit acht Impulsen zu je zehn Sekunden bei 70 % Ausgabeleistung beschallen. Es wird empfohlen, eine Probe zu analysieren, um die DNA-Fragmentierung in Längen von etwa 200 bis 1000 Basenpaaren zu bestätigen.Teilen Sie die geschnittene Chromatinprobe gleichmäßig auf ein neues Röhrchen auf. Füllen Sie für jede durchzuführende Immunpräzipitationsreaktion jedes Röhrchen mit ChIP-Puffer plus Proteaseinhibitorcocktail auf ein Volumen von 500 Mikrolitern auf. Entnehmen Sie anschließend fünf Mikroliter Ihrer verdünnten Probe und überführen Sie sie in ein neues Röhrchen.Dies ist Ihre 1 % Eingangsprobe, die bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt wird. Später. Fügen Sie Antikörper oder einen normalen IgG-Kontrollansatz zu jedem Gefäß hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rotoration. Am folgenden Tag.Präzipitieren Sie den Komplex durch Zugabe von 30 Mikrolitern Protein-G-Magnetkügelchen und Inkubation für zwei Stunden bei vier Grad Celsius unter Rotation. Stellen Sie anschließend das Röhrchen auf einen Magnetrack, um den gebundenen Chromatin-Kügelchen-Komplex abzutrennen. Sobald die Lösung klar ist, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen die Kügelchen dreimal mit je einem Milliliter Niedrigsalzpuffer, wobei jeweils drei bis fünf Minuten bei vier Grad Celsius unter Rotation inkubiert wird.Als Nächstes einmal mit einem Milliliter Hochsalz-Puffer waschen. Zu diesem Zeitpunkt die 1 %-Input-Probe aus der Lagerung bei minus 20 Grad Celsius entnehmen und 150 Mikroliter ChIP-Elutionspuffer hinzufügen. Das Röhrchen bei Raumtemperatur beiseitestellen, um es später zu verwenden.Kehren Sie zu den IP-Proben zurück, geben Sie 150 Mikroliter eines 1x Chip-Elutionspuffers zu jedem Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten bei 65 Grad Celsius mit sanftem Vortexen, um das Chromatin von den Kügelchen zu eluieren. Stellen Sie die Röhrchen auf den magnetischen Ständer, um die Kügelchen abzuscheiden, und überführen Sie das eluierte Chromatin vorsichtig in neue Röhrchen, einschließlich der Input-Proben.Fügen Sie 200 Millimolar Natriumchlorid und 40 Mikrogramm pro Reaktion Protease K hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei 65 Grad Celsius. Nach der Inkubation gewinnen Sie die DNA mit Standardverfahren für die weitere Analyse hier. Semiquantitative PCR-Ergebnisse aus DRG-Gewebe nach einer Verletzung des Nervus ischiadicus sind dargestellt. Die Gänge eins und zwei zeigen das PCR-Signal der Input-Proben.Das PCR-Signal in Lane vier zeigt, dass acetyliertes P53 nur nach Verletzung des Nervus ischiadicus an den proximalen Promotorbereich von gap43 bindet. Kein PCR-Signal ist vorhanden, wenn das Tier eine Scheinverletzung erhält, wie in Lane drei zu sehen, oder wenn normales IgG-Serum verwendet wird, wie in den Lanes fünf und sechs dargestellt. Eine Kontroll-PCR aus demselben DRG-Gewebe zeigt, dass acetyliertes P53 nicht an einen Kontrollbereich der DNA bindet, der sich im drei-primären nicht übersetzten Bereich des gap43-Gens befindet.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, drei entscheidende Schritte für den Erfolg zu beachten. Beginnen Sie mit einer ausreichenden Menge an Gewebe, stellen Sie eine effiziente Fragmentierung und Solubilisierung des DNA-Protein-Komplexes sicher und wählen Sie einen geeigneten Immunpräzipitationsantikörper für Ihr Protein von Interesse.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir zeigen, ein Protokoll für Axoplasma Isolierung von adulten Ratten Ischiasnerv auf Dissektion Nervenfaszikel und Inkubation in hypotonischen Medium Myelin Freigabe und lysieren nicht axonaler Strukturen, die durch Extraktion der restlichen Axon-angereichertem Material gefolgt basiert.

Axoplasma Isolation von Rat Ischiasnerv

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

Quelle: Li, Q., et al. Untersuchung der Axonregeneration von Säugetieren: In vivo Elektroporation des Spinalwurzelganglion einer adulten Maus. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt den Prozess der axonalen Regeneration in einem Ischiasnerv einer Maus nach einer Quetschverletzung. Der isolierte Nerv wird fixiert und für die Bildgebung vorbereitet, wobei fluoreszierende Proteine in Neuronen exprimiert werden, um das Axonwachstum sichtbar zu machen. Mit einem Epifluoreszenzmikroskop wird die...

Axonale Regeneration im Ischiasnerv einer Maus nach einer Quetschverletzung

Quelle: Li, Q. et al. Untersuchung der Axonregeneration von Säugetieren: In vivo Elektroporation des Spinalwurzelganglion einer adulten Maus. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Elektroporations-vermittelte Transfektion von DRG-Neuronen der Maus zur Untersuchung der Axonregeneration. Es beschreibt die Schritte zur Verabreichung von Nukleinsäurekonstrukten an DRG-Neuronen, zur Induktion von Ischiasnervenverletzungen und zur Beurteilung der axonalen Regeneration.

Elektroporations-vermittelte Transfektion von Spinalganglien der Maus zur Förderung der revitalisierten Axon

Eine Verletzung Paradigma mit der Drosophila Larve Bauchmark des zentralen Nervensystems Regeneration und Reparatur zu untersuchen beschrieben. Stabbing gefolgt von Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie im Zeitraffer und festen Proben mit quantitativen Analyse mit gezielt entwickelten Software und Genetik kombiniert werden verwendet, um die molekularen Mechanismen der ZNS-Regeneration und Reparatur zu untersuchen.

Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen<em&gt; Drosophila</em

Dieses Protokoll stellt die Verwendung einer Injektion eines dorsalen Wurzelganglions (DRG) mit einem viralen Vektor und einer gleichzeitigen Verletzung des dorsalen Wurzelquetsches bei einer erwachsenen Ratte als Modell zur Untersuchung der sensorischen Axonregeneration dar. Dieses Modell eignet sich, um den Einsatz von Gentherapie zur Förderung der sensorischen Axonregeneration zu untersuchen.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Vorgestellt wird die Entwicklung zur konsequent hochwertigen Erfassung von Kryostatschnitten der Spinalganglien.

Ein Verfahren zur Kryosektion von Spinalganglien der Maus

Dieses Protokoll beschreibt ein mikrofluidisches System, das die neuronale Stoffwechseldynamik nach axonaler Verletzung modelliert und Bildgebung, Multi-Omics-Analysen und mechanistische Studien des intrinsischen metabolischen Umbaus ermöglicht.

Mikrofluidischer Chip für axonale Verletzungsmodelle, Aufbau und Ermöglichung von Multi-Omics-Analysen

Dorsale Wurzelganglien (DRG) enthalten primäre sensorische Neuronenzellen und leiten periphere sensorische Signale an das Rückenmark weiter. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur DRG-Dissektion der Maus, die eine standardisierte Isolierung strukturell intakter Ganglien, anatomische segmentale Identifikation, intuitive Anleitung für Anfänger und reduzierte prozedurale Gewebeschäden unterstützt.

Dissektion und Isolierung der Maus-Dorsalwurzelganglien

Erfahren Sie die Chromatin-Immunopräzipitation aus Spinalganglien nach axonaler Schädigung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und epigenetischen Modifikationen für Nervenregenerationsforschung.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

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