Partikelagglutinations Methode für Poliovirus Identification

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die Isolate eines Poliovirus mithilfe eines einfachen Protokolls schnell zu identifizieren. Für diesen Assay verwenden wir sensibilisierte Gelatinepartikel, die mit chimären Molekülen beschichtet sind, die die extrazelluläre Domäne des humanen Poliovirus-Rezeptors enthalten, der mit IgG zwei fc verbunden ist. Da diese Partikel eine einheitliche Affinität zu allen Serotypen von Poliovirus-Isolaten aufweisen, kommt es bei der Inkubation mit Proben, die humane Polioviren enthalten, zu einer Agglutination der Partikel

Wenn jedoch Antikörper vorhanden sind, die in der Lage sind, das spezifische Virus zu erkennen, das die Probe isoliert, kommt es zu einer Neutralisation und verhindert eine Agglutination mit diesem experimentellen System, so dass eine schnelle Identifizierung von Poliovirus-Isolaten in einer einzigen Schrittreaktion durchgeführt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik des vorhandenen Gefäßes, wie der herkömmliche Neutralisationstest, ist die Einfachheit des Verfahrens und der Interpretation, die darauf abzielt, den Arbeitsaufwand zu reduzieren und den erforderlichen Aufwand zu beschleunigen und die Zeit bis zum Ergebnis zu verkürzen. Um die Anti-PV-Antikörper eins, PV zwei und PV drei zu rekonstituieren, geben Sie 0,5 Milliliter Wasser in jedes Fläschchen.

Übertragen Sie dann jede Antikörperlösung in separate Röhrchen mit 4,5 Millilitern Erhaltungsmedium. Einige Chargen von Anti-PV-Antikörpern werden in rekonstituierter Form für solche Chargen von Anti-PV-Antikörpern bereitgestellt. Eine Zugabe von Wasser zur Rekonstitution ist nicht erforderlich.

Bereiten Sie anschließend Eins-zu-Eins-Mischungen aus kombinierter Antikörperlösung mit einem Endvolumen von 3,6 Millilitern in frisch markierten Röhrchen vor. Mischen Sie zum Beispiel 1,8 Milliliter Anti-PV-Eins mit 1,8 Millilitern Anti-PV-Zwei. Um eine Kombination aus Anti-PV eins und PV zwei herzustellen, wiederholen Sie dies für jede mögliche paarweise Kombination und bereiten Sie auch eine Lösung vor, die alle drei Arten von Antikörpern enthält, indem Sie 1,2 Milliliter jedes Antiserums miteinander mischen.

Sobald die vier Mischungen hergestellt wurden, werden 720 Mikroliter FCS auf jede Antikörperlösung gegeben. Dies trägt dazu bei, die unspezifische Agglutination von Gelatinepartikeln durch Antikörper während des Assays zu reduzieren. Die Antikörperpools können bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, bis sie für den Agglutinationsassay verwendet werden.

In diesem Assay verwenden wir lyophilisierte Gelatinepartikel, die mit den extrazellulären Domänen des humanen Poliovirus-Rezeptors und IgG zwei FC-Domänen der Maus beschichtet wurden. Achten Sie darauf, eine einzelne Charge von Partikeln und nicht verschiedene Chargen in einem Experiment zu verwenden, um die Konsistenz des Agglutinationsbildes zu gewährleisten, um die Partikel mit 1,5 Millilitern Rekonstitutionspuffer in jedem Fläschchen zu rekonstituieren. Leicht klopfen, um gut zu mischen.

Die rekonstituierten Partikel können bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius gelagert werden. Entwerfen Sie zunächst Ihr Experiment in einer 96-Well-Mikrotiterplatte. Für jede Probe enthält Vertiefung Nummer eins nur das Virus.

Die Vertiefungen Nummer zwei bis fünf werden das Virus plus eine der vier gemischten Antikörperlösungen enthalten. Achten Sie darauf, eine Vertiefung für eine Negativkontrolle aufzubewahren, die nur Medien ohne Viren oder Antikörper enthält. Sobald die Platte aufgestellt ist, geben Sie 12 Mikroliter der richtigen Antikörperlösung in jede Vertiefung aus den Reihen zwei bis fünf und 12 Mikroliter des Wachstums

Medium bis zum Virus allein, Vertiefungen in Reihe eins und zur Negativkontrolle Vertiefung in Reihe sechs. Geben Sie anschließend 12 Mikroliter Virusprobe in den ersten fünf Reihen und 12 Mikroliter Wachstumsmedium in die Negativkontrollvertiefung in Reihe sechs. Sobald die Antikörper und das Virus plattiert sind, reanimieren Sie sie, suspendieren Sie die rekonstituierten Gelatinepartikel, indem Sie vorsichtig darauf klopfen, und fügen Sie sofort 25 Mikroliter Partikel pro Vertiefung in alle Vertiefungen hinzu.

Es ist wichtig, die Partikel nicht absetzen zu lassen, bevor man sie auf die Platte überträgt, um die gleiche Menge an Partikeln in jedem zu erhalten. Stellen Sie die Assay-Platte gut auf einen Plattenmischer und mischen Sie sie 30 Sekunden lang. Legen Sie dann die Platte auf ein weißes Blatt Papier und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, damit eine Agglutination auftreten kann.

Es ist wichtig, die Platte zu keinem Zeitpunkt während oder nach der Inkubation zu bewegen, da die gebildete Agglutination instabil ist. Sobald die Reaktion stattgefunden hat, machen Sie mehrere Bilder von der Platte, auf denen die Qualität der Agglutination in jeder Vertiefung zu erkennen ist. In Vertiefungen, in denen keine Agglutination stattgefunden hat, wie hier links gezeigt, fallen farbige Gelatinepartikel am Boden der Vertiefung aus, in Vertiefungen, in denen eine Agglutination stattgefunden hat.

Aufgrund der Wechselwirkung zwischen dem Virus und dem pvr, IgG zwei A-beschichteten Gelatinepartikeln, ist ein diffuses Farbmuster sichtbar, wie in der Mitte gezeigt. In diesem Experiment haben wir die Fähigkeit der Viruslösungen PV eins, zwei und drei getestet, Glu in Gegenwart des Antikörpers zu induzieren. Kombinationen, wie hier gezeigt, in Abwesenheit von Viren oder Antikörpern tritt keine Agglutination auf und die Gelatinepartikel fallen im Gegensatz dazu in gut enthaltenden Virus, aber ohne Antikörper aus.

Die Agglutination ist aufgrund der Wechselwirkung des Virus aufgetreten. Mit dem PVR-IgG zwei A-bedeckte Gelatinepartikel in den Versuchsvertiefungen wird eine Überschwemmung der Viren in einer Vertiefung verhindert, die Antikörper enthält, die das Virus spezifisch neutralisieren. Zum Beispiel wird eine Überschwemmung des Poliovirus Typ 1 in Vertiefungen mit Anti-PV-1-Antikörpern verhindert, nicht jedoch in Vertiefungen, die nur Anti-PV-2- und Anti-PV-3-Antikörper enthalten.

Gleiches gilt für die Polioviren der Typen zwei und drei. Obwohl Sie diese Technik beherrschen, kann sie in nur drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.