Name: Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Lernen Sie die immunhistochemische und fluoreszenzoptische Detektion von neuritischen Plaques in transgenen Alzheimer-Mausmodellen. Diese Methoden ermöglichen die zuverlässige Visualisierung von Amyloid-β-Ablagerungen im Gehirngewebe.

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Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die Townsend Familie und Jack Brown und Familie Alzheimer Research Foundation (WAS) unterstützt. WAS ist der Inhaber des Canada Research Chair in der Alzheimer-Krankheit. PTTL wird vom kanadischen Natural Sciences and Engineering Research Counsel und Michael Smith Foundation for Health Research Scholarship unterstützt.

1. Fixation der Maus Gehirne und Kryoschneiden <ol><li> Transgene Mäuse werden getötet mit Kohlendioxid-Gas, durch Enthauptung und das Gehirn entnommen gefolgt. </li><li> Das Gehirn ist in Längsrichtung in der Mitte durchtrennt. Die Hälfte des Gehirns zu blinken auf Trockeneis für die biochemische Analyse eingefroren werden. Der andere wird in 4% Paraformaldehyd (PFA) für mindestens 48 Stunden bei 4 ° C getaucht </li><li> Nach der Fixierung in 4% PFA für mindestens 48 Stunden wird die hemi Gehirn direkt in 30% Saccharose-Lösung überführt und bei 4 ° C. An dem Punkt, sollte die hemi Gehirn in der Saccharose-Lösung zu schweben. Wenn die hemi Gehirn auf den Grund sank, in der Regel erfordert etwa 48 Stunden ist es bereit, in OCT für Kryoschneiden eingebettet werden. </li><li> Vor Kryoschneiden, montieren Sie eine dünne Schicht der OCT auf den Knopf und lassen Sie sie bei -20 ° C einfrieren Entfernen Sie das Kleinhirn aus dem Rest der hemi Gehirn und Ort auf die Schicht aus gefrorenem Oktober Unmittelbar decken die hemi Gehirn mit OCT und lassen Sie sie langsam bei -20 ° C einfrieren Sobald der OCT Einbettung des Gehirns hat sich deckend, ist es bereit zu sein geschnitten. </li><li> Stellen Sie die Stärke eines jeden Abschnitts bis 30 um. Sammeln Sie jede Scheibe in einen Behälter mit D'Olomos Lösung. </li></ol> 2. Immunhistochemie Verfahren für neuritischen Plaques (frei schwebenden Abschnitte) <ol><li> Behandle jeden Abschnitt in 88% iger Ameisensäure für 15 Minuten. Nach Ameisensäure Behandlung wird der Abschnitt vorübergehend auszuschalten undurchsichtig und erscheinen zu schrumpfen. </li><li> Nehmen Sie jedes Teil in einen Teller geben und gründlich mit Tx-PBS (0,3% Triton X-100 in PBS) für 5 min X 3 unter leichtem Schütteln. </li><li> Block Endogene Peroxid blockieren 0,5% H 2 O 2 in Tx-PBS, RT 30 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Wash Abschnitt mit Tx-PBS für 10 min X 3 unter leichtem Schütteln. </li><li> Block Abschnitt mit 5% fettfreier Magermilch in Tx-PBS bei Raumtemperatur gelöst für 1 Stunde unter leichtem Schütteln. </li><li> Inkubieren Abschnitte in primärer Antikörper (biotinylierter 4G8, 1:500-1:2000, Signet) in Tx-PBS mit 5% Milch bei 4 ° C über Nacht verdünnt unter leichtem Schütteln. </li><li> Wash Abschnitt mit Tx-PBS für 10 min X 3 unter leichtem Schütteln. </li><li> Bereiten Sie ABC-Lösung folgende Protokoll des Herstellers (Elite ABC, Vector Laboratories,). Inkubieren Abschnitte in ABC-Gemisch für 30 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Wash Abschnitt mit Tx-PBS für 10 min X 3 unter leichtem Schütteln. </li><li> Bereiten 3,3 '-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) (Vector Laboratories) nach Protokoll des Herstellers. Inkubieren Abschnitte in DAB-Gemisch für 5-10 min. An dieser Stelle werden Sie feststellen, eine bräunliche Farbe auf jedem Abschnitt zu entwickeln. </li><li> Wash Abschnitt mit Tx-PBS für 10 min X 3 unter leichtem Schütteln. </li><li> Free-Floating-Hirn-Abschnitte werden auf Gelatine beschichtete Objektträger aufgebracht, mit Gewebeadhäsion helfen. Die Schnitte werden dann an der Luft, indem Sie mit einer Reihe von Xylol getrocknet gefolgt und montiert in Entellen. </li><li> Plaques sind visualisiert unter Lichtmikroskopie bei 40-facher Vergrößerung und werden von der Beurteilung der mittleren Plaque-Zahl pro Stück für jede Maus quantifiziert. </li></ol> 3. Thioflavin S Färbung zum Nachweis von neuritischen Plaques <ol><li> Maus zu opfern und das Gehirn Extraktionsverfahren sind in Abschnitte von 1,1 bis 1,5 angegeben. </li><li> Montieren Sie 4 bis 5 hemi Hirnschnitten auf einen Objektträger aus Glas und lassen Sie sie vollständig trocknen vor dem Färben. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit 70% Ethanol für 1 Minute. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit 80% Ethanol für 1 Minute. </li><li> Inkubieren in filtriert (0,2 &amp;mgr; m-Filter) Thioflavin S-Lösung (1% in 80% Ethanol) für 15 Minuten. (Thioflavin S-Lösung muss vor jedem Gebrauch gefiltert werden). Hinweis: Schutz Thioflavin S von Licht und schützen gefärbten Folien aus Licht. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit 80% Ethanol für 1 Minute. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit 70% Ethanol 1 Minute. </li><li> Waschen mit destilliertem Wasser zweimal. </li><li> Berg rutscht in wässrigen Medien und Montage ermöglichen Dias im Dunkeln für mindestens 2 Stunden, durch Abdichten Deckglas mit klarem Nagellack gefolgt trocken. Stained Abschnitte sollten im Dunkeln bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Die grüne Fluoreszenz gefärbten Plaques konnte visualisiert werden mit fluoreszierenden microscropy. Analysieren gleitet innerhalb einer Woche, weil die Färbung mit der Zeit verblassen wird. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse In unserer jüngsten Studie über die Wirksamkeit des anti-epileptischen Medikamenten und Stimmungsstabilisator Valproinsäure (VPA), um neuritischen Plaquebildung hemmen, verwendeten wir die oben beschriebenen Immunfärbung und Thioflavin S Färbeverfahren zu neuritischen Plaques in AD-Modell-Mäusen (3) zu identifizieren. Abbildung 1 stellt eine typische 9 Monate alten APP23 transgene Maus, mit Anti-Aß mit biotinylierten 4G8 angefärbt und mittels der ABC-Methode. Neuritischen Plaques sind deutlich mit dem Antikörper markiert und werden durch die weißen Pfeile angedeutet. Mit Thioflavin S-Färbung, entdeckten wir neuritischen Plaqueablagerung 2 Monate alt APP23xPS transgenic Mäusen (Abbildung 2). Thioflavin S gebunden Aß-haltigen neuritischen Plaques erscheint unter Fluoreszenz-Mikroskopie (angezeigt durch weiße Pfeile) grün. Wir zeigten, dass mit VPA behandelt, neuritischen Plaquebildung deutlich reduziert wird (3). In einer anderen Studie untersuchten wir die molekulare Verbindung zugrunde liegenden Hypoxie und AD Pathogenese. Wieder mit beiden 4G8 anti-Aß Immunhistochemie-Färbung und Thioflavin S-Färbung, fanden wir, dass Hypoxie erleichtert die Bildung von Aß mit neuritischen Plaques (4). <img src="/files/ftp_upload/2831/2831fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Immunhistochemische Analyse der neuritischen Plaquebildung in AD transgenen Mäusen. APP23 Mäuse im Alter von 9 Monaten wurden getötet und seziert, fixiert und geschnitten. Neuritischen Plaques im Hippocampus nachgewiesen wurden mit einem Anti-Aß-Antikörper 4G8 und wurden mit Hilfe der ABC-und DAB-Verfahren. Die Plaques wurden unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht mit 40X. Weiße Pfeile zeigen auf Aß neuritischen Plaques. <img src="/files/ftp_upload/2831/2831fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Thioflavin S-Färbung von neuritischen Plaques in AD modelliert Mäusen. APP23xPS45 doppelt transgenen Mäusen 8 Wochen alt, wurden getötet und präpariert, fixiert und geschnitten. Neuritischen Plagen in den Hippocampus sind bestätigt wurden mit Thioflavin S Fluoreszenzfärbung und visualisiert durch Mikroskopie bei 40-facher Vergrößerung. Weiße Pfeile zeigen Thioflavin S gefärbt neuritischen Plaques.

<ol><li>Glenner, G. G., Wong, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+initial+report+of+the+purification+and+characterization+of+a+novel+cerebrovascular+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).</li>
<li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+inhibits+Abeta+production%2C+neuritic+plaque+formation%2C+and+behavioral+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models.</a> J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).</li>
<li>Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+facilitates+Alzheimer%27s+disease+pathogenesis+by+up-regulating+BACE1+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).</li>
</ol>

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der University of British Columbia Animal Care und Verwenden Ausschuss und CIHR Richtlinien durchgeführt.

Immunhistochemie mit dem biotinylierten gekennzeichnet 4G8 Antikörper Flecken neuritischen Plaques in AD modelliert Mäuse mit Spezifität. Die Färbung Ergebnis ermöglicht die Quantifizierung und Vergleich der Plaque-Last zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen. Es gibt mehrere wichtige Schritte, die das Ergebnis beeinflussen könnten. Da die hemi Gehirne nicht vor der Extraktion aus dem Schädel perfundiert, sollte darauf bei der Extraktion verwendet werden, um Schäden an der hemi Gehirn zu verhindern. Da darüber hinaus die hemi Gehirn passiv durchströmt wird, empfehlen wir Inkubation in 4% PFA für mindestens 48 Stunden bei 4 ° C vor dem in der 30% Saccharose-Lösung eingetaucht. Alternativ könnte transcardial Perfusion vor der Extraktion des Gehirns durchgeführt werden. Wenn das Gehirn richtig befestigt ist, sollte es eine gummiartige Konsistenz. In dem Fall, dass das Gehirn noch nicht behoben ist richtig, werden die Abschnitte leicht in die D&#39;Olomos Lösung oder während der Färbeverfahren reißen. Die 4G8 monoklonalen Antikörper reaktiv Aminosäurereste 17-24 von Aß und erkannte die Epitop in der Core-Sequenz (VFFAE). Da 4G8 aus Maus Arten abgeleitet wird, neigt sie dazu, eine höhere Hintergrundfärbung zu geben. So entschieden wir uns, um die Abschnitte zu den angegebenen Verdünnung mit Überlegungen zur Erreichung eines echten Signals bei gleichzeitiger Minimierung der Hintergrundfärbung inkubieren. Zusätzlich zur neuritischen Plaques Detektion mit dem 4G8 Antikörper Immunfärbung ist ein Thioflavin S Färbemethode auch verwendet, um Plaques zu identifizieren. Thioflavin S ist eine homogene Mischung Farbstoff, der sich aus Methylierung von Dehydrothiotoluidin mit Sulfonsäuregruppen. Thioflavin S nicht selektiv bindet Beta-Faltblatt-Inhalte von Proteinen, wie sie in Amyloid-Oligomere. Bei der Bindung erfährt Thioflavin eine charakteristische blaue Verschiebung seines Emissionsspektrums. Umgekehrt Thioflavin S Bindung an die monomeren Formen nicht zu entlocken eine Blauverschiebung und konnte nicht mit Fluoreszenz-Mikroskop detektiert werden. Thioflavin S-Färbung ist eine schnelle Alternative zum Bildschirm für die Amyloid als die Intensität der Fluoreszenz ermöglicht eine gute Darstellung von kleinen Mengen von Amyloid-Ablagerungen. Allerdings ist ein Nachteil zu Thioflavin S-Färbung der mangelnden Spezifität. Viele andere Gewebe Komponenten, einschließlich mit umfangreichen Beta-Faltblätter, wie fibrinoids, hyaline, Keratin, etc, haben eine eher Affinität zu diesem Farbstoff.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes und Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidene </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PVP40-100G </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-3 </td></tr><tr><td> Ethylenglykol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 324558-2L </td></tr><tr><td> Tissue-Tek OCT Compound </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> 88% iger Ameisensäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> A118P-500 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td> 807426 </td></tr><tr><td> H2O2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-1009 </td></tr><tr><td> Biotin markiert 4G8 Antikörper </td><td> Cedarlane </td><td> SIG-39240-500 </td></tr><tr><td> Elite ABC Kit </td><td> Vektor </td><td> PK-6100 </td></tr><tr><td> Imm PACT DAB </td><td> Vektor </td><td> SK-4105 </td></tr><tr><td> Xylol </td><td> Fisher Scientific </td><td> X4-4 </td></tr><tr><td> Entellan </td><td> EM Wissenschaft </td><td> 65037-71 </td></tr><tr><td> Superfrost * Plus Mikropräparate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica </td><td> CM-3050-S </td></tr><tr><td> MX35 Premier Mikrotomklinge </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3052835 </td></tr><tr><td> Thioflavin S </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1892-25G </td></tr></tbody></table>

nachweis von neuritischen plaques bei alzheimer-maus-modell

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung, die zu Demenz. Neuritischen Plaquebildung ist einer der pathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit. Die zentrale Komponente des neuritischen Plaques ist ein kleiner faserigen Protein namens Amyloid β Protein (Aß) 1, die aus der sequenziellen proteolytische Spaltung des beta-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) durch β-Sekretase und γ-Sekretase abgeleitet ist. Die Amyloid-Hypothese zur Folge, dass Aγ-haltigen Plaques als die zugrunde liegende toxische Mechanismus in AD-Pathologie 2. Die Obduktion Analyse der Präsenz von neuritischen Plaques bestätigt die Diagnose von AD. Um unser Verständnis von Aγ Neurobiologie in AD Pathogenese wurden verschiedene Maus-Stämme, die AD-bezogenen Mutationen im menschlichen APP-Gene erzeugt. Je nach Schwere der Erkrankung, werden diese Mäuse neuritischen Plaques in den verschiedenen Altersstufen zu entwickeln. Diese Mäuse dienen als unschätzbare Werkzeuge für das Studium der Pathogenese und Entwicklung von Medikamenten, die die APP-Prozessierung Weg und neuritischen Plaquebildung beeinflussen könnten. In diesem Protokoll, beschäftigen wir eine immunhistochemische Methode zum spezifischen Nachweis von neuritischen Plaques in AD-Modell-Mäusen. Wir werden insbesondere über die Vorbereitung von der Gewinnung der Hälfte des Gehirns, Paraformaldehyd Fixierung Kryoschneiden und zwei Methoden zur neurotischen Plaques in AD transgenen Mäusen zu erkennen: immunhistochemischen Nachweis über die ABC-und DAB-Methode und Fluoreszenzdetektion mit thiofalvin S-Färbung.

Einer der pathologischen Merkmale von AD ist die Bildung von Amyloid β Protein positive neuritischen Plaques. In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Methoden, um neuritischen Plaques in transgenen AD-Modell-Mäusen zu erkennen: immunhistochemischen Nachweis über die ABC-und DAB-Methode und Fluoreszenzdetektion mit Thioflavin S-Färbung.

Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung, die zu Demenz führt. Die Bildung neuritischer Plaques ist eines der pathologischen Kennzeichen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gehirne von AD-Modellmäusen zur Detektion von retikulären Plaques mittels 4G8-Immunfärbung und Thioflavin-S-Färbung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst das Mausgehirn aus dem Schädel entnommen und passiv in 4 % PFA perfundiert wird, gefolgt von einer Einbettung in 30 %ige Saccharoslösung, anschließend erfolgt das kryosektionelle Längsschneiden des Gehirns auf eine Dicke von 30 µm. Danach werden retikuläre Plaques mit dem 4G8-Antikörper gefärbt und mittels DAB-Methode sichtbar gemacht.Zusätzlich färben Sie retikuläre Plaques mit der Thioflavin-S-Färbung und visualisieren sie mittels Fluoreszenzmikroskopie. Letztendlich können die erhaltenen Ergebnisse die Ablagerung retikulärer Plaques in Gehirngeweben durch eine antikörperbasierte Detektion und Färbung mit dem Thioflavin-S-Farbstoff aufzeigen. Der Hauptvorteil dieser Methoden gegenüber bestehenden Verfahren liegt darin, dass die 4G8-Färbung und die Thioflavin-S-Färbung eine hohe Selektivität für retikuläre Plaques aufweisen, die A-beta-Proteine enthalten.Obwohl diese Methode hier zur Detektion von Beta-Plaques bei transgenen Alzheimer-Mäusen gezeigt wird, kann diese Methode ebenfalls zur Detektion von Beta-Plaques bei Alzheimer-Krankheit beim Menschen eingesetzt werden. Opfern Sie die transgenen Mäuse mittels Kohlendioxidgas, gefolgt von Enthauptung, entnehmen Sie das Gehirn und dissezieren Sie es in der Mitte longitudinal. Schockfrieren Sie eine Gehirnhälfte auf Trockeneis für die biochemische Analyse ein, geben Sie die andere Hälfte mindestens 48 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius.Überführen Sie das Hemi Brainin in eine 30%ige Saccharoselösung bei vier Grad Celsius. Anfangs schwimmt das Hemi Brainin in der Saccharoselösung, sinkt jedoch nach 24 bis 48 Stunden auf den Boden. Vor dem Einfrierschneiden tragen Sie eine dünne Schicht OCT auf den Knopf auf und lassen sie bei minus 20 Grad Celsius gefrieren. Entfernen Sie das Kleinhirn vom restlichen Hemi Brainin.Das verbleibende Material auf die Schicht gefrorenes OCT geben, es sofort mit OCT bedecken und langsam bei minus 20 Grad Celsius einfrieren lassen. Stellen Sie den Kryostaten auf eine Schnittdicke von 30 Mikrometern ein und sammeln Sie jeden Schnitt in einem Behälter mit Domo-Lösung. Behandeln Sie jeden frei schwimmenden Schnitt 15 Minuten lang mit 88 %iger Ameisensäure.Die Schnitte erscheinen zusammengezogen. Anschließend jeden Schnitt auf eine Platte übertragen und dreimal für jeweils fünf Minuten mit Triton XPBS bei sanftem Schütteln waschen. Die endogene Aktivität durch 0,5 % Wasserstoffperoxid in Triton XPBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur bei sanftem Schütteln hemmen.Anschließend die Schnitte dreimal mit Triton XPBS jeweils zehn Minuten unter leichtem Schütteln waschen, dann die Schnitte mit 5 % fettfreier Magermilch, gelöst in Triton XPBS, bei Raumtemperatur eine Stunde unter leichtem Schütteln blockieren. Danach die Schnitte über Nacht bei vier Grad Celsius mit leichtem Schütteln in primärer Antikörperlösung inkubieren, die in Triton XPBS mit 5 % Milch verdünnt ist. Die Proben anschließend dreimal jeweils zehn Minuten mit Triton PBS waschen.Bereiten Sie nun eine b, C-Lösung gemäß dem Herstellungsprotokoll vor und inkubieren Sie die Schnitte in der A B, C-Mischung 30 Minuten unter leichtem Schütteln, gefolgt von drei Waschungen mit tris-PBS jeweils 10 Minuten. Inkubieren Sie die Schnitte in frisch zubereiteter DAB-Mischung fünf bis 10 Minuten, bis sich auf jedem Schnitt eine bräunliche Färbung entwickelt hat, und waschen Sie anschließend dreimal mit tris-PBS jeweils 10 Minuten unter leichtem Schütteln. Bringen Sie die frei schwimmenden Gehirnschnitte auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern auf, lassen Sie sie lufttrocknen, entfärben Sie mit einer Reihe von Xylol-Behandlungen und decken Sie in Lin ein.Die Plaques unter dem Lichtmikroskop bei 40-facher Vergr&ouml;&szlig;erung sichtbar machen und die mittlere Plaque-Anzahl pro Schnitt f&uuml;r jedes M&auml;usegehirn quantifizieren, wobei das Gehirngewebe aus M&auml;usen wie zuvor gezeigt entnommen wird. Vier bis f&uuml;nf Hemi-Gehirnschnitte auf einen Objekttr&auml;ger aufbringen und vollst&auml;ndig an der Luft trocknen lassen. Die Proben anschlie&szlig;end f&uuml;r eine Minute in 70 %igem Ethanol und danach f&uuml;r eine Minute in 80 %igem Ethanol dehydrieren. Danach die Objekttr&auml;ger 15 Minuten in 0,1 % gefilterter THEOF-Flavin-S-L&ouml;sung inkubieren.Schützen Sie die Theoflavin S-Lösung und die gefärbten Objektträger vor Licht und waschen Sie die Objektträger nacheinander eine Minute lang mit 80 %igem Ethanol, eine Minute lang mit 70 %igem Ethanol und zweimal mit destilliertem Wasser. Decken Sie die Objektträger nun mit einer wässrigen Eindeckmasse ab und lassen Sie sie mindestens zwei Stunden lang im Dunkeln an der Luft trocknen. Versiegeln Sie anschließend die Deckgläser mit klarem Nagellack. Bewahren Sie die gefärbten Schnitte im Dunkeln bei vier Grad Celsius auf.Visualisieren Sie schließlich die grün fluoreszierenden gefärbten Plaques innerhalb einer Woche mittels Fluoreszenzmikroskopie. In unserer jüngsten Studie zur Wirksamkeit des Antiepileptikums und Stimmungsstabilisators Valproinsäure bei der Hemmung der Bildung retikulärer Plaques verwendeten wir die oben beschriebene Immunfärbung und die Flavin-S-Färbemethode, um retikuläre Plaques in AD-Modell-Mäusen nachzuweisen. Eine typische neun Monate alte APP23-transgene Maus wurde mit anti-Aβ unter Verwendung von BIOTINYLIERTEM 4G8 gefärbt und mittels der ABC-Methode detektiert.Neuroretikuläre Plaques sind deutlich mit dem Antikörper markiert und werden durch die weißen Pfeile angezeigt. Hier detektiert die Färbung mit Thioflavin S die Ablagerung von retikulären Plaques in zwei Monate alten APP23×PS-transgenen Mäusen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Tagen abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Gehirn vollständig in 4 % PFA zu fixieren und sicherzustellen, dass das Gehirn vollständig auf den Boden der 30 %igen Saccharoselösung sinkt.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie beispielsweise Immunfärbungen gegen Tau durchgeführt werden, um weitere Fragen wie die Hyperphosphorylierung von Tau und neuronale Veränderungen zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Transgene (Tg) Mausmodellen der Alzheimer bieten eine ausgezeichnete Gelegenheit, um zu untersuchen, wie und warum Aß oder tau-Spiegeln im Liquor ändern, wenn die Krankheit fortschreitet bei menschlichen Patienten. Hier zeigen wir eine raffinierte Cisterna magna Punktionstechnik für serielle CSF Probenahme aus die Maus.

Eine Technik für Serial Sammlung von Liquor aus der Cisterna Magna in Maus

Quelle: Bisht, K., et. al. Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Untersuchung von Mikroglia-Wechselwirkungen mit β-Amyloid-Plaques. J. Vis. exp. (2016) Dieses Video zeigt die Visualisierung und Kartierung von Methoxy-X04-markierten Amyloid-Plaques im Gehirn von Mäusen der Alzheimer-Krankheit Schnitte mittels Fluoreszenz- und Hellfeldmikroskopie, die eine präzise Korrelation von Plaques mit anatomischen Strukturen für die Untersuchung der Alzheimer-Pathologie ermöglichen.

Visualisierung und Kartierung von Methoxy-X04-markierten Amyloid-Plaques in einem Schnitt aus dem Gehirn einer Alzheimer-Maus

Quelle: Arango-Lievano, M. et. al., Längsschnittliche In-vivo-Bildgebung des zerebrovaskularen Systems: Relevanz für ZNS-Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung zur Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Amyloid-Plaques und zerebralen Gefäßen. Blaue Fluoreszenz markiert Plaques, während grüne Fluoreszenz die zerebralen Blutgefäße hervorhebt. Eine 3D-Karte der Region of Interest und hochauflösende Mosaik-Bildgebung zeigen detaillierte...

In-vivo-Bildgebung von Hirngefäßen und Amyloid-Plaques in einem Mausmodell für die Alzheimer-Krankheit

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte stereotaktische Gehirninfusion von Amyloid-beta. Diese Methodik bietet ein alternatives In-vivo-Mausmodell, um die kurzfristigen Auswirkungen von Amyloid-Beta auf Gehirnneuronen zu untersuchen.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Die Amyloid-β (Aß) -injected Tiermodell die Verabreichung einer definierten Menge und Arten von Aß-Fragmente ermöglicht und reduziert individuelle Unterschiede innerhalb der einzelnen Studiengruppe. Dieses Protokoll beschreibt die intracerebroventricular (ICV) Injektion von A &amp; bgr; ohne stereotaktischen Instrumente, die Produktion von Alzheimer-ähnliche Verhaltensstörungen in normalen Mäusen ermöglichen.

Intracerebroventricular Injektion von Amyloid-β-Peptide in normalen Mäusen zu Akut Induce Alzheimer-ähnliche kognitive Defizite

Hier beschreiben wir die Setup - Software Navigation, und die Datenanalyse für eine räumlich und zeitlich genaue Methode der tonischen und phasische extrazellulären Glutamat Veränderungen in vivo Messung unter Verwendung von enzymgekoppelten Mikroelektrodenarrays (MEA).

Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

Hier beschrieben handelt es sich um einen inszenierten, Verhaltens-Screening-Ansatz, der verwendet werden kann, um Verbindungen zu sehen, die in vivo Wirksamkeit auf kognitiven und funktionellen motorischen Verhaltensweisen in transgenen Mausmodellen von β-Amyloidose und Tauopathie zeigen. Diese Methoden sind optimiert, um Verbindungen für die Aktivität in kurzfristigen und Arbeitsspeicheraufgaben zu screenen.

Assessment of Spontane Alternation, neuartige Objekterkennung und Gliedmaßenverkürzung in transgenen Mausmodellen der Amyloid-β- und Tau-Neuropathologie

Das vorliegende Protokoll beschreibt und vergleicht das Verfahren zur Durchführung einer Analyse der gesamten Region oder Subregion von Interesse an sagittalen Hirnschnitten der Maus zur Quantifizierung der Amyloid-Beta-Belastung im transgenen APP/PS1-Mausmodell der Alzheimer-Krankheit.

Voll- versus subregionale Quantifizierung der Amyloid-Beta-Belastung von Hirnschnitten der Maus

Ein Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Erhöhung der...

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Aptamere sind kurze ribo-/deoxyribo-oligonucleotides ausgewählt...

Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

Lernen Sie die immunhistochemische und fluoreszenzoptische Detektion von neuritischen Plaques in transgenen Alzheimer-Mausmodellen. Diese Methoden ermöglichen die zuverlässige Visualisierung von Amyloid-β-Ablagerungen im Gehirngewebe.

Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell

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