Gezielte Schulung von Ultraschall Vocalizations in Aged und Parkinson-Ratten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Ratten darin zu trainieren, die Anzahl und Komplexität ihrer ultraschallbasierten Vokalisationen oder USVs zu erhöhen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Ausgangsvokalisationen aufgezeichnet werden. Im nächsten Schritt erfolgt das Training gezielter Vokalisationen durch positive Verstärkung.

Nach dem Training werden die Lautäußerungen aufgezeichnet. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht in der akustischen Analyse und dem Vergleich der Ausgangswerte mit den Lautäußerungen nach dem Training. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden.

Diese Studie zeigt, dass Training die Anzahl und Komplexität ultraschallartiger Vokalisationen durch Zunahmen akustischer Parameter wie Bandbreite, Spitzenfrequenz und Dauer erhöht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Kommunikationsstörungen zu beantworten, beispielsweise wie vokale Übungen zugrunde liegende neuronale Mechanismen modulieren. Obwohl diese Methode Einblicke in kraniale sensorisch-motorische Defizite im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit und dem Altern liefern kann.

Es kann auch auf andere Krankheitsmodelle und Bedingungen angewendet werden, bei denen ultraschallbasierte Stimmäußerungen als Verhaltensindex verwendet werden. Die Demonstration des Trainings zur Stimmäußerung übernehmen Emerald Dahl und Jamie Shire, Mitglieder meines Labors. Um mit der ultraschallbasierten Überwachung zu beginnen, laden Sie die Avisoft-Recorder-Software und wählen Sie „permanent unlimited“ als Auslöser, um die Aufnahmen manuell starten und stoppen zu können. Anschließend legen Sie das Basisverzeichnis fest, in dem die aufgezeichneten Audiodateien gespeichert werden sollen.

Die Abtastrate muss mindestens 200.000 Hertz betragen, um die höchste Vokalisierungsfrequenz aufzuzeichnen. Sobald diese Parameter eingestellt sind, entfernen Sie den Deckel des Heimkäfigs des Männchens und platzieren Sie ihn direkt unter das Mikrofon. Danach identifizieren Sie eine sexuell empfängliche weibliche Ratte anhand von Lordose, Ohrzucken und schnellem Hin- und Herlaufen.

Stellen Sie das empfängliche Weibchen in den Heimkäfig des Versuchsmännchens. Wenn das Männchen Interesse am Weibchen zeigt, indem es es beschnuppert, jagt oder besteigt, entfernen Sie das Weibchen und nehmen Sie die Vokalisationen des Männchens für eine bis zwei Minuten auf. Überwachen Sie die ultraschallartigen Vokalisationen visuell, indem Sie das Echtzeitspektrogramm beobachten.

Falls das Männchen nicht vocalisiert, bringen Sie die weibliche Ratte sofort kurz in den Heimkäfig des Männchens zurück, um die Vocalisation zu stimulieren. Zunächst bringen Sie ein einzelnes männliches Tier in den Trainingsraum. Alle anderen Männchen sollten bis zu ihrer Trainingssitzung in einem angrenzenden Raum untergebracht bleiben.

Die Ratte sollte vorab eingeschränkten Zugang zu Wasser haben, um die Verwendung von Wasser als Belohnung zu erleichtern. Stellen Sie während des Trainings den Avis-Soft-Recorder wie zuvor gezeigt auf. Bringen Sie anschließend den Heimkäfig unter dem Mikrofon in Position.

Wenn sich das Männchen in Position befindet, bringen Sie eine empfängliche weibliche Ratte in den Käfig ein. Entfernen Sie das Weibchen, sobald das Männchen Interesse an ihr gezeigt hat, und überwachen Sie die Ziel-Laute. Anfangs wird jeder 50-Kilohertz-frequenzmodulierte Ruf belohnt.

Präsentieren Sie die Belohnung, indem Sie gleichzeitig einen Kugelschreiber klicken und eine Wasserflasche oder Nahrung kurz präsentieren. Belohnen Sie im Verlauf des Trainings nur noch zunehmend komplexe Folgen von Lauten, beispielsweise Folgen aus fünf oder zehn Lauten, die in schneller Abfolge erfolgen. Setzen Sie das Training fort, bis 30 Belohnungen verabreicht wurden.

Dies dauert in der Regel fünf bis 10 Minuten, um die Basislinien- und die Aufnahmen nach dem Training zu analysieren. Erstellen Sie zunächst ein Archiv der ursprünglichen Audiodatei und nehmen Sie Bearbeitungen an einer Arbeitskopie vor, um Störfrequenzen unterhalb der ultraschallartigen Vokalisationen zu entfernen. Verwenden Sie den Batch-Modus von AVI Soft SaaS Lab Pro, um die Audiodateien mit einem Hochpassfilter bei 25 Kilohertz zu filtern.

Um die zur Nutzung der automatischen Elementerkennung in SaaS Lab Pro erforderliche Rauschschwelle zu bestimmen, öffnen Sie eine Audiodatei und erstellen Sie ein Spektrogramm. Stellen Sie die FFT-Länge auf 512 mit einer Rahmenbreite von 75 % und einer zeitlichen Überlappung von 93,75 % ein. Aktivieren Sie die Wellenformbearbeitung, sodass aus dem Spektrogramm gelöschtes Rauschen auch aus der Wellenform entfernt werden kann. Richten Sie die automatischen Parametermessungen wie hier gezeigt ein.

Die drei zu messenden Parameter sind Dauer des Elements, Spitzenfrequenz und Spitzenamplitude. Im Bereich der Messungen aktivieren Sie Abschnitte für maximale Amplitude sowie den minimalen und maximalen Parameter des gesamten Elements. Wählen Sie unter Elementtrennung automatische Einzelschwelle und zeigen Sie die Schwelle an.

Suchen Sie einen Bereich im Spektrogramm, in dem sich keine Laute oder Geräusche befinden. Dies ist das Hintergrundrauschen. Stellen Sie die Schwelle knapp über dem Hintergrundrauschen ein.

Indem die schwarze Linie im Leistungsspektrum-Fenster über dem Spektrogramm angepasst wird, kann hier der in der vorherigen Stufe festgelegte Schwellenwert in Dezibel gefunden werden. Stellen Sie den Ausschluss-Amplitudenwert auf ein Dezibel unterhalb der Schwelle ein. Diese beiden Werte sollten nun für alle analysierten Audiodateien verwendet werden.

Unter der Annahme, dass alle Aufnahmeeinstellungen identisch waren, erstellen Sie zur Kennzeichnung der Vokalisationen ein Spektrogramm unter Verwendung des zuvor automatisch festgelegten Schwellwerts und der zuvor gezeigten gleichen Einstellungen. Löschen Sie manuell jedes Rauschen, das die folgenden Kriterien erfüllt: Erstens, das fälschlicherweise als Vokalisation identifiziert wurde. Zweitens, das die Unterscheidung des Anfangs und/oder Endes der Vokalisation beeinträchtigt. Drittens, das fälschlicherweise als höchste oder tiefste Frequenz in der Vokalisation identifiziert wurde, die jeweils durch die obere und untere rote Linie angezeigt werden.

In einigen Fällen kann eine Vokalisation nicht vom umgebenden Rauschen getrennt werden, beispielsweise vom Geräusch des Einstreus während der Fortbewegung. Diese Vokalisation kann nicht genau analysiert werden und sollte gelöscht werden, sobald alle Vokalisationen identifiziert wurden, wobei die gelöschten Abschnitte des Spektrogramms dauerhaft aus der Audiodatei entfernt werden. Wählen Sie dazu im Dropdown-Menü unter Werkzeuge die Option „Entfernen“, um Spektrogrammabschnitte aus der Wellenform zu löschen und dauerhafte Markierungen in der Audiodatei zu erstellen.

Öffnen Sie das Fenster zur automatischen Parametereinstellung und klicken Sie visuell und auditiv auf die Schaltfläche „Bearbeiten“ im Bereich Elementtrennung. Überprüfen Sie jede markierte Vokalisation, um ihre Kategorie zu bestimmen, und weisen Sie das entsprechende Label unter Verwendung der vordefinierten Textmodule zu. Die Kategorien, die wir in unserer Analyse verwenden, sind einfache Frequenz, moduliert und harmonisch.

Schließen Sie das Spektrogramm, speichern Sie die Audiodatei und fahren Sie mit der nächsten zu analysierenden Audiodatei fort. Nachdem alle Vokalisationen in den Audiodateien identifiziert wurden, verwenden Sie das Stapelverarbeitungswerkzeug, um die akustischen Parameter aller Dateien automatisch zu messen. Wählen Sie im Dialogfeld für die Stapelverarbeitung im Dropdown-Menü die automatische Parametermessung aus.

Wählen Sie das Kontrollkästchen „Alle Dateien im ausgewählten Ordner verarbeiten“. Klicken Sie dann auf die Ordner-Schaltfläche und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Audiodateien gespeichert sind. Klicken Sie auf „Start“, und jede Datei wird automatisch gemäß den zuletzt verwendeten Einstellungen analysiert.

Im Dialogfeld zur automatischen Parametermessung werden die Messungen in einer Textdatei gespeichert, die mithilfe des DDE-Parameter-Befehls „Schrägstrich-Protokolldatei“ definiert werden kann. Diese Textdatei kann anschließend in ein Programm zur statistischen Analyse importiert werden. Diese Diagramme zeigen, dass sowohl die Anzahl der Vokalisationen pro Sitzung als auch die Vokalisationsrate pro Minute über einen Zeitraum von sechs Wochen hinweg ansteigen.

Hier sind repräsentative Vokalisationen jeder der drei Kategorien von 50-Kilohertz-Vokalisationen von links nach rechts dargestellt, die wir verwenden. Es handelt sich um einfache Frequenz-, frequenzmodulierte und harmonische Vokalisationen. In diesem Beispiel werden frequenzmodulierte Vokalisationen derselben Ratte vor der Induktion eines Parkinsonismus, nach der Induktion des Parkinsonismus und nach dem Vokalisationstraining gezeigt.

Im Vergleich zur Baseline-Vokalisation im Panel A zeigt die Vokalisation unter Parkinsonismus-Bedingungen im Panel B eine Verringerung von Bandbreite, Dauer und Intensität. Die nach dem Training gezeigte Vokalisation im Panel C demonstriert, wie Dauer, Intensität, Bandbreite und Frequenzmodulation nach dem Vokalisationstraining wieder auf Baseline-Niveau zurückkehren. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die ultraschallartigen Vokalisationen von Ratten trainiert, aufzeichnet und analysiert.