Name: Präparation des Adult Zebrafisch Kidney (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Lernen Sie die Präparation der adulten Zebrafisch-Niere für Zellisolierung und Transplantationsstudien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Nieren- und Blutzellpopulationen in Danio rerio.

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RAW Wünsche an die Mitglieder des Zon und Davidson Forschungslabors für ihre unzähligen Beiträgen zu helfen, Strategien, schrittweise diese Dissektionstechnik haben bei erwachsenen Zebrafisch geformt Laufe des letzten Jahrzehnts entwickeln danken. Darüber hinaus möchten wir unsere Dankbarkeit für die Mitarbeiter der Notre Dame-Zentrum für Zebrafisch Forschung für eine ausgezeichnete laufenden Tierhaltung Betreuung unserer Zebrafisch Kolonie auszudrücken. RAW sammelte Forschungsmittel aus dem NIH-NIDDK Zuschussvergabe DK083512 und großzügige Labor Anschubfinanzierung von der University of Notre Dame.

1. Dissection der erwachsenen Zebrafisch Niere von einer nicht fixierten Tier Probe <ol><li> Wählen Sie einen erwachsenen Zebrafisch zwischen 3-6 Monaten im Alter für die Präparation. </li><li> Euthanize die Fische, indem Sie sie in eine Schale mit 0,2% Tricaine pH 7,0 für ca. 4-5 Minuten und beobachtete sorgfältig, um zu sehen, dass die Kiemen bewegen und das Herz aufhört zu schlagen aufhören. </li><li> Mit einem Löffel, heben Sie den Fisch aus dem Tricaine Bad in eine kleine Menge der Lösung, giesst die Lösung und sanft Ort das Tier auf einem Papiertuch. </li><li> Mit einem scharfen Paar Dissektion Schere in den Kopf des Tieres zu entfernen, so dass ein Schnitt direkt hinter den Kiemen Operculum (Abb. 1, Weg A). Entsorgen Sie den Kopf in einer biohazard Abfallbehälter. </li><li> Verwenden Sie das Sezieren einer Schere, um den Körper des Tieres geöffnet, durch einen langen ventralen Inzision, beginnend mit dem Kopf und endet bei der Schwanz an der Basis der Schwanzflosse (Abb. 1, Weg B). </li><li> Entfernen Sie die inneren Organe des Tieres mit einem Paar Dissektion Pinzetten / Pinzette und lege sie in biohazard Abfall. Achten Sie darauf, die dorsale Körperwand Pinsel, da dies die Lage der Niere (Abbildung 2). Wenn Sie ein weiblicher Fisch ausgewählt haben, müssen Sie sich entwickelnden Eier Schaufel aus der Körperhöhle, die am leichtesten getan werden kann, mit einer abgewinkelten Pinzette oder einer Pinzette. </li><li> Verwenden Sie Dissektion Nadeln pin offenen Körper Wände zu einer Dissektion Tablett, und der Winkel der Pins so, dass die Niere visualisiert werden können. Die Niere wird besitzen eine charakteristische Form (Kopf, Rumpf / Sattel, Schwanz) und Farbe, die mit schwarz gefärbte Pigmentierung (Abbildung 2) durchsetzt. Möglicherweise finden Sie auch die Aorta mit dem peripheren Blut, die nach unten läuft der Mittellinie des Organs Struktur gefüllt. </li><li> Verwenden feinen Pinzette auf die Niere aus dem dorsalen Körperwand zu lösen, mit einer Pinzette auf die Niere heben Sie die Orgel aus dem Bindegewebe, die ihm zugrunde liegenden trennen. </li><li> Sanft legen Sie die Niere in das gewünschte Fahrzeug für weitere Studien an lebenden Zellen, wie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1x PBS für FACS Vorbereitung. </li></ol> 2. Vorbereitung und Präparation der erwachsenen Zebrafisch Niere von einer festen Tier Probe <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung aus 4% paraformaldehyde/1X PBST. Kochen Sie die Lösung für die PFA in Lösung auflösen, dann die Mischung wird auf 4 ° C und 0,1% Dimethylsulfoxid. Wir haben den größten Erfolg mit Gewebe Bewahrung vor mit frisch zubereiteten PFA-Lösungen wie zum gefrorenen Aliquots entgegen. Machen Sie genügend Lösung tauchen erwachsenen Zebrafisch beim Präparieren. </li><li> Füllen Sie eine Dissektion Tablett mit genug Fixierung Lösung tauchen erwachsenen Zebrafisch während der Präparation. Wir führen die weiteren Schritte mit diesem Fach unter dem Mikroskop positioniert, die in einer chemischen Motorhaube platziert werden können, um die Exposition der Fixierung Gerüche vermieden werden. </li><li> Wählen Sie einen erwachsenen Zebrafisch zwischen 3-6 Monaten im Alter für die Präparation. </li><li> Euthanize die Fische, indem Sie sie in eine Schale mit 0,2% Tricaine pH 7,0 für ca. 5 Minuten und beobachtete sorgfältig, um zu sehen, dass die Kiemen und Herz aufhören zu schlagen. </li><li> Mit einem Löffel, heben Sie den Fisch aus dem Tricaine Bad in eine kleine Menge der Lösung, giesst die Lösung und sanft Ort das Tier auf einem Papiertuch. </li><li> Mit einem scharfen Paar Dissektion Schere in den Kopf des Tieres zu entfernen, so dass ein Schnitt direkt hinter den Kiemen Operculum (Abb. 1, Weg A). Entsorgen Sie den Kopf in einer biohazard Abfallbehälter, und sofort Platz das Tier in die PFA-haltigen Präparation Fach. </li><li> Verwenden Sie das Sezieren einer Schere, um den Körper des Tieres geöffnet, durch einen langen ventralen Inzision, beginnend mit dem Kopf und endet bei der Schwanz an der Basis der Schwanzflosse (Abb. 1, Weg B), und halten den Körper teilweise während der Überflutung das Verfahren. </li><li> Entfernen Sie die inneren Organe des Tieres mit einem Paar Dissektion Pinzetten / Pinzette und lege sie in biohazard Abfall. Achten Sie darauf, die dorsale Körperwand Pinsel, da dies die Lage der Niere (Abbildung 2). </li><li> Verwenden Sie Dissektion Nadeln pin offenen Körper Wände und Winkel die Stifte, so dass die Niere visualisiert werden können. Die Niere wird besitzen eine charakteristische Form (Kopf-, Sattel, Schwanz) und Farbe, die mit schwarz gefärbte Pigmentierung (Abbildung 2) durchsetzt. Möglicherweise finden Sie auch die Aorta mit dem peripheren Blut, die nach unten läuft der Mittellinie des Organs Struktur gefüllt. </li><li> Fix die Probe über Nacht, indem das Fach bei 4 ° C, wenn Sie bei der Organisation der gewünschten Proben fertig sind. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie die PFA-Lösung aus der Schublade und ersetzen mit 1x PBST. </li><li> Verwenden feinen Pinzette vorsichtig lösen die Niere aus dem dorsalen Körperwand, mit einer Pinzette auf die Niere heben Sie die Orgel aus dem Bindegewebe, die ihm zugrunde liegenden trennen. Das Nierengewebe wird weich und geschmeidig aus der DMSO in die Fixierlösung, die es ermöglichen, die gesamte Niere Orgel in einem Stück zu sezieren. </li><li> Verwenden Sie eine breiteBohrung Transfer-Pipette auf die Niere in ein Mikrozentrifugenröhrchen Platz. </li><li> Die Niere kann nun weiter bearbeitet werden, um histologische oder whole mount in situ Genexpression Studien über die gewünschte Studie basiert befragen. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die Schritte, die in Abbildung 1 schematisch dargestellt sind, zeigen die Zerlegung Verfahren. Die Niere kann anhand ihrer charakteristischen Form und Färbung, und anatomische Lage an der dorsalen Wand des Tieres Körperhöhle identifiziert werden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Nach der Präparation einer festen Nieren Probe whole mount in situ Hybridisierung kann zur Lokalisierung der Expression eines Gens von Interesse sein, wie in Abbildung 3 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Verfahren, die einen direkten Zugang zum Präparieren der Zebrafisch erwachsenen Nieren ermöglicht. (A) eingeschläfert Zebrafisch ist in schrittweise zerlegt (durch Zahlen und Pfeile), um den Forscher am einfachsten Zugriff auf die komplette Niere Organ. Bilder von der Bauchhöhle vor (B) und nach (C) Entfernung der Bauchorgane. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2:. Visualisierung der Zebrafisch-Niere in einer nicht fixierten Probe Nach Entnahme von Organen in der Leibeshöhle, erscheint die Niere als eine einzelne, abgeflachte Organ, das Anhänger der dorsalen Körperwand über Bindegewebe (A) ist, und wurde schematisiert (B) an ihre anatomische Form zu zeigen. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Whole mount in situ Hybridisierung auf dem gesamten erwachsenen Nieren-Orgel durchgeführt. (A) cadherin17 Transkripte sind in den Tubulus der erwachsenen Nieren Nephrone erkannt, vergrößert in (A '). (B) mafba Transkripte proximalen Nephron Zelltypen in der adulten Niere (zu vergleichen, um ganze Tubulus in Panel A) lokalisiert sind. (B' ) Eine vergrößerte Ansicht mafba Ausdruck zeigt, dass Transkripte sind speziell auf die Podozyten (P) Zellen des Blutes Filter (Glomerulus) und proximalen Tubulus (PCT) lokalisiert.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Adulte Stammzellen sind dynamisch und wesentliche Komponenten, die den erwachsenen Körper Form 1 aufrecht zu erhalten. Adulte Stammzellen können auch dazu dienen, Schäden entgegenwirken, die den Körper entstehen während der Erkrankungen und der Dysfunktion oder Verlust von adulten Stammzellen, um den Rückgang der Organfunktion führen und hat in Verbindung gebracht, um Krebs Malignome fahren und tragen zur Alterung. Adulte Stammzellen weisen zelluläre Eigenschaften, die sie von differenzierten Zelltypen unterscheiden. Bei der Zellteilung werden adulte Stammzellen in der Lage sich selbst zu erneuern und die Produktion von Vorläuferzellen, die wiederum Anlass zu verschiedenen differenzierten Nachkommen geben können. Es besteht ein großes Interesse für das Verständnis der Signalwege, die die Zelle Schicksal Entscheidungen und Wirksamkeit von adulten Stammzellen aufgrund ihrer wichtigen Rolle in Gewebshomöostase 1 zu regeln. Zum Beispiel sind viele Wissenschaftler, die derzeit versuchen, die Signale, die verschiedene erwachsenen Stammzell-Populationen in ihrer Nische, oder spezielle Mikroumgebung, und wie diese Nische wird durch humorale Faktoren beeinflusst halten zu identifizieren. Adult hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) sind pluripotente Zellen, die Kraftstoff die kontinuierliche Verjüngung der Blutkörperchen bei Tieren 8. Hämatopoese ist eine lebendige Prozess, der ständig laufende während der Lebensdauer eines Wirbeltier-Organismus, weil die reifen differenzierten Blut Zelltypen kurzlebig sind und müssen daher regelmäßig erneuert werden. Als sie sich teilen, Versorgung HSCs dieser entscheidenden Nachfrage durch Selbst-Erneuerung und Herstellung einer Reihe von Vorläufern, die Anlass zu der erythroiden, Megakaryozyten, lymphoiden und myeloischen Linien. Jede dieser Blut Zelltypen führt einzigartige Funktionen in den Kreislauf, einschließlich der Bereitstellung der Gasaustausch im Gewebe, so zum Abdichten von Verletzungen der Blutgefäße durch die Bildung von Blutgerinnseln oder Abwehrmechanismen gegen eindringende Krankheitserreger. Während HSCs seit vielen Jahren erkannt haben, bleiben eine Fülle von faszinierenden Fragen offen über diese faszinierenden Zellen. Jüngste Studien haben Unterklassen von HSK mit verschiedenen langfristigen Selbst-Erneuerung Eigenschaften und die Aufklärung der Nische Komponenten und signalisiert, dass HSC Verhalten modulieren 8 identifiziert. Der Zebrafisch gehört heute zu den Eckpfeilern der Hämatopoese Forschung Paradigmen, basierend auf der genetischen und molekularen Eigenschaften von diesem Tiermodell 8. Forschung unter Verwendung der Zebrafisch hat zu neuen Einsichten über HSC Biologie, die mit höheren Wirbeltiere wie Säuger konserviert sind, betonen die biomedizinischer Relevanz von Fisch Blutuntersuchungen 8 geführt. Historisch gesehen hat das Wissen über HSCs ebnete den Weg für die Expeditionen versucht, herauszufinden, ob andere Körperorgane durch adulte Stammzellen beibehalten werden. Zahlreiche erwachsenen Stammzell-Populationen sind jetzt geschätzt auf zu existieren, reicht über verschiedene Strukturen aus dem Gehirn in den Darm, Haut und Skelettmuskulatur. Fortsetzung der Bemühungen in der Stammzell-Bereich suchen, um herauszufinden, wie adulte Stammzellen oder sogar andere differenzierte Zelltypen können verbesserte Wirksamkeit in verschiedenen Einstellungen anzuzeigen. Im Hinblick auf die Niere, hat es große Debatten unter Nephrologen, ob Nieren-Stammzellen 16 vorliegen worden. Unabhängige Erkenntnisse haben Populationen von Nierenzellen in Säugetieren, die in unterschiedlichem Maße von regenerativen Potential besitzen dokumentiert, aber ein zusammenhängendes Verständnis dieser Berichte ist noch nicht erreicht werden. Interessanterweise gibt es starke Hinweise auf die Vorstellung, dass viele Fischarten Zellen, die robust Kraftstoff Regeneration geschädigter Nephrone können sowie wachsen völlig neue Nephrone im Erwachsenenalter 9 besitzen unterstützen. Neuere Arbeiten haben die molekulare Kennzeichen der erwachsenen Nieren-Stammzellen in der Zebrafisch 10,11 identifiziert, und demonstrierte die Selbst-Erneuerung Potenz dieser sogenannten renalen Stammzellen / Vorläuferzellen (RPCs) 11. Zukünftige Studien sind notwendig, um festzustellen, ob analog Nierenzellen in Säugern sind. Dennoch kann weiterhin Untersuchungen über die zellulären und molekularen Mechanismen, die Fische RPCs regulieren Einblick in die regenerative Leistungen können in der Säugetierniere stimuliert werden können. Es ist offensichtlich, dass noch viel über RPCs verstanden werden, und dass die vielen Tools nun auch für die Zebrafisch-Forscher kann implementiert, um diese faszinierenden Fragen anzugehen. In diesem Protokoll, beschreiben wir unsere Methode zur anatomischen Identifizierung und Präparation des erwachsenen Zebrafisch Niere. Alternative Schritte können verwendet werden, um die Nieren, wie das Öffnen der Bauchhöhle mit einer ventralen Schnitt mit einer Schere zerschneiden Dissektion werden, aber wir haben den größten Erfolg beim Zugriff auf die gesamte Niere, wenn die Bauchdecke wird merken offen und der Kopf wird entfernt angetroffen. Blut und Nieren Wissenschaftler gleichermaßen, zu isolieren und mit diesen Zelltypen arbeiten möchten, können Sie entweder Dissektion Methode. Es sollte angemerkt werden, dass die Methode, die wir beschreiben, für die Isolierung und working mit dem Zebrafisch erwachsenen Nieren ist sicherlich nicht an Wissenschaftler, die zu Fragen der Erwachsenenbildung Stammzellbiologie zu verfolgen, als das Sezieren von diesem Organ können die Untersuchungen über die Forscher weitere Untersuchungen zu Themen wie Physiologie der Alterung zu erleichtern möchten begrenzt. Darüber hinaus kann diese Methode mit anderen Technologien wie Transgenik gekoppelt werden, um so molekular-Label und dann zu reinigen und zu studieren diskreten Subpopulationen von Blut oder Nierenzellen aus Wildtyp-und genetisch mutierte Zebrafische 11. Wir freuen uns, derart detaillierte Reinigungsverfahren von Stamm-und Vorläuferzellen Zelltypen ist von entscheidender Bedeutung, um zu gewinnen Wissen darüber, wie ihr Verhalten reguliert wird, als operative Tests wie Transplantation oder Vorläuferzellen Kultivierung der Grundlage bilden, durch die die Wirksamkeit und die Identität dieser Zellen ist definiert. Jüngste Fortschritte in der hämatopoetischen Vorläuferzellen Kultur Methoden öffnen viele neue Wege für die Studie und kann zu Kultivierung der Nierenfunktion Bevölkerung 17 angepasst werden. Zebrafisch chemische Genetik wurden bei der Ermittlung von Wegen, die HSZ-und Nierenfunktion Vorfahren in verschiedenen Kontexten 18-20 modulieren, und wird auch weiterhin eine sinnvolle Möglichkeit, die im Kombination mit den oben zellbiologischen Techniken Test erfolgreich zu sein. Zusammengenommen gibt es eine Reihe von bahnbrechenden Beiträge auf den Gebieten der Hämatologie und Nephrologie mit dem Zebrafisch-Modell gewesen, und die weitere Forschung in diesen Arenen Versprechungen zu führen weitere transformative Einblicke in den kommenden Jahren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Dissection Schere </td><td> Roboz </td><td> RS-5882 </td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Dissection abgewinkelten Pinzette </td><td> Roboz </td><td> RS-5058 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Dienstleistungen </td><td> 19210 </td></tr></tbody></table>

präparation des adult zebrafisch kidney

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Die Forscher arbeiten in dem aufstrebenden Gebiet der adulten Stammzellen Biologie versuchen, die Signale, die das Verhalten und die Funktion von Stammzellen während der normalen Homöostase und Krankheit Staaten regeln zu verstehen. Das Verständnis von adulten Stammzellen hat breite reichende Folgen für die Zukunft der Regenerativen Medizin 1. Zum Beispiel kann ein besseres Wissen über adulte Stammzellen Zellbiologie erleichtern die Gestaltung der therapeutischen Strategien in welchen Organen ausgelöst werden, um sich selbst oder auch die Schaffung von Verfahren für den Anbau von Organen in vitro, die in Menschen 1 transplantiert werden können heilen. Der Zebrafisch hat sich zu einem leistungsstarken Tiermodell für die Untersuchung von Wirbeltieren Zellbiologie 2. Es hat eine umfangreiche Dokumentation und Analyse der embryonalen Entwicklung im Zebrafisch 3 wurde. Erst vor kurzem haben Wissenschaftler versucht, erwachsene Anatomie und chirurgische Dissektion Techniken 4-Dokument, da es eine progressive Bewegung innerhalb der Zebrafisch-Community, um die Anwendungen dieser Forschung Organismus Studien mit Erwachsenen zu erweitern wurde. Zum Beispiel gibt es den Ausbau Interessen bei der Nutzung Zebrafische, um die Biologie von adulten Stammzell-Populationen zu untersuchen und anspruchsvollen Erwachsenen-Modelle von Krankheiten wie Krebs 5. Historisch gesehen hat die Isolierung des Zebrafisch erwachsenen Nieren wurden für die Untersuchung Hämatopoese instrumental, als die Niere der anatomischen Lage der Blutkörperchen in Fischen 6,7 ist. Die Niere ist von Nephron Funktionseinheiten in arborized Regelungen gefunden, um hämatopoetische Gewebe, das in den Zwischenräumen verteilt ist umgeben sind. Die hämatopoetischen Komponente besteht aus hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) und ihre Nachkommen, dass die Niere leben, bis sie unheilbar unterscheiden 8. Darüber hinaus ist es nun klar, dass eine Gruppe von renaler Stamm / Vorläuferzellen (RPCs) bewohnen auch der Zebrafisch Nieren Orgel und ermöglichen sowohl Nieren-Erneuerung und Wachstum, wie in anderen Fischarten 9-11 beobachtet. Im Lichte dieser neuen Entdeckung ist die Zebrafisch-Niere ein Organ, dass der Standort von zwei spannende Möglichkeiten für adulte Stammzellen Zellbiologie Studien Häuser. Es ist klar, dass viele offene Fragen und konnte mit diesem experimentellen System bedient werden. Zur Förderung Expansion auf diesem Gebiet, ist es von Vorteil, um detaillierte Methoden der Sichtbarmachung Dokument und dann die Isolierung des erwachsenen Zebrafisch Niere Organ. Dieses Protokoll Einzelheiten unseres Verfahrens zur Dissektion der erwachsenen Nieren von beiden fixierten und fest Tieren. Dissection der Niere Organ kann zur Isolierung und Charakterisierung von hämatopoetischen und renalen Stammzellen und ihren Nachkommen mit etablierten Techniken wie Histologie, Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) 11,12, expression profiling 13,14 und 11,15 Transplantation werden. Wir hoffen, dass die Verbreitung dieses Protokolls werden die Forscher mit dem Wissen, dass die breitere Verwendung von Zebrafisch-Studien, die letztlich für die Anwendung beim Menschen übersetzt werden kann umzusetzen.

Der Zebrafisch Niere ist die Heimat sowohl Nieren-und blutbildenden adulten Stammzellen / Vorläuferzellen, und stellt eine hervorragende Gelegenheit, diese Zelltypen und ihre Nachkommen in einem Wirbeltier Modell-Organismus zu studieren. Hier zeigen wir eine detaillierte Analyse Verfahren, dass der Forscher ermöglicht zu erkennen und operativ zu entfernen, die erwachsenen Zebrafisch Niere, die für Anwendungen wie Zellisolation, Transplantationsmedizin und Expressionsstudien von Nieren-und / oder Blut Zellpopulationen verwendet werden können.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Forscher, die im expandierenden Bereich der Biologie adulter Stammzellen arbeiten, versuchen, die Signale zu verstehen, welche das Verhalten und die Funktion von Stamm...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Niere eines adulten Zebrafisches zu identifizieren und chirurgisch zu entfernen, die beispielsweise für Anwendungen wie Zellisolierung, Transplantation und Expressionsstudien von Nieren- und/oder Blutzellpopulationen verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst ein drei bis sechs Monate alter adulter Zebrafisch für die Sektion ausgewählt wird. Das Tier wird anschließend in 0,2 % Trica euthanasiert, wobei der Tod durch das Stillstehen der Kiemenbewegungen und das Einstellen des Herzschlags bestätigt wird.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, mit einer Schere die Bauchhöhle zu öffnen und die darin befindlichen Organe zu entfernen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist dann, mit feinen anatomischen Pinzetten die Niere aus dem darunterliegenden Bindegewebe zu lösen. Abschließend Genexpressionsprofile hämatopoetischer oder Nierenzellsubpopulationen, Isolierung spezifischer Zellpopulationen durch Ganzpräparat.Die in-situ-Zwei-Hybridisierung, immunhistochemischen Analysen und/oder die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung können an dem isolierten Organgewebe und/oder den Zellen durchgeführt werden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Dissektionsschritte schwer zu erlernen sind. Denn die Niere eines Zebrabärblings ist ein empfindliches Organ, das über dichtes Bindegewebe an der Körperwand verankert ist.Die Auswirkungen dieser Technik können in der Therapie oder Diagnose von Nieren- und Blutkrankheiten beim Menschen genutzt werden, da biologische Prozesse zwischen Zebrafischen und höheren Säugetieren stark konserviert sind. In den letzten Jahren wurden zahlreiche molekulargenetische Werkzeuge beim Zebrafisch entwickelt, wodurch er zu einem nützlichen Tiermodell geworden ist. Leider reichen 0,2 % Trica aus, um einen erwachsenen Zebrafisch im Alter von drei bis sechs Monaten in einer Schale abzudecken.Wählen Sie anschließend einen Zebrafisch für die Dissektion aus und legen Sie ihn etwa fünf Minuten lang in die Schale, wobei Sie sorgfältig beobachten, ob die Kiemenbewegungen und der Herzschlag zum Stillstand kommen. Heben Sie danach den Fisch mit einem Löffel zusammen mit einer geringen Menge Lösung aus dem Trica-Bad heraus. Gießen Sie die Lösung ab und legen Sie das Tier vorsichtig mit einer scharfen Schere für die Dissektion auf ein Papiertuch.Führen Sie einen Schnitt direkt hinter der Kieme durch, um den Kopf des Tieres zu entfernen, und entsorgen Sie den Kopf in einem Behälter für biohazard-Abfall. Beginnen Sie dann am Kopf und führen Sie mit der Präzisionsschere einen langen ventralen Schnitt bis zum Schwanzende durch, um den Körper des Tieres zu öffnen. Entfernen Sie nun die inneren Organe des Tieres mit einer Präparationspinzette und legen Sie sie in den Bioabfallbehälter.Achten Sie darauf, die dorsale Körperwand nicht zu berühren, da sich dort die Niere befindet. Wenn Sie einen weiblichen Fisch ausgewählt haben, heben Sie die sich entwickelnden Eier mit einer gebogenen Pinzette oder Zange aus der Körperhöhle heraus. Befestigen Sie die Körperwände mit Dissektionsnadeln an einem Dissektionsbrett. Stellen Sie die Nadeln so ein, dass die Niere sichtbar wird. Die Niere weist eine charakteristische Form mit einem Kopf, einem Rumpf oder Sattel, einem Schwanz sowie eine typische Färbung auf, die durch schwarze Pigmentierung unterbrochen ist. Lösen Sie die Niere mit zwei Paar feiner Pinzetten von der dorsalen Körperwand.Verwenden Sie ein Paar Pinzetten, um die Niere anzuheben, und ein weiteres Paar, um das darunterliegende Bindegewebe festzuhalten. Während Sie das Organ aus der Körperhöhle des Zebrafisches entfernen, legen Sie die Niere vorsichtig in das gewünschte Medium. Für weitere Untersuchungen an lebenden Zellen, wie beispielsweise ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1× PBS. Für die Fixierung füllen Sie ein Präparierröhrchen mit ausreichend frisch zubereiteter Fixierungslösung, um einen drei bis sechs Monate alten Zebrafisch während der Präparation vollständig zu bedecken.Danach ausreichend 0,02 % Trica pH sieben in eine Schale geben. Um den Zebrafisch abzudecken, einen Zebrafisch für die Dissektion auswählen und in die Schale mit Trica zur Euthanasie legen. Kopf des Tieres wie zuvor gezeigt entfernen und verwerfen, diesmal jedoch das Tier sofort in die mit PFA gefüllte Dissektionswanne legen.Nach der Entfernung, wobei der Körper während des gesamten Vorgangs teilweise in der Fixierlösung untergetaucht bleibt, den Körper des Tieres mit einer ventralen Inzision wie zuvor mit einer Präzisionsschere öffnen. Erneut darauf achten, die dorsale Körperwand nicht zu berühren, und die inneren Organe des Tieres mit einer Präzisionspinzette entfernen. Die Organe in einen Bioabfallbehälter geben.Wie zuvor verwenden Sie Dissektionsnadeln, um die Körperwände zu fixieren, und richten Sie die Nadeln so aus, dass die Niere sichtbar wird. Danach fixieren Sie die Probe über Nacht. Stellen Sie das Tablett am nächsten Tag bei vier Grad Celsius ab, entfernen Sie die Fixierungslösung aus dem Tablett und ersetzen Sie sie durch einmalige PBST.Danach vorsichtig die Niere mit einer Pinzette von der Rückenwand lösen, wobei die gesamte Niere als ein einziges Stück angehoben wird, während sie von dem darunterliegenden Bindegewebe getrennt wird. Anschließend die Niere mit einer Pipette mit großem Durchmesser in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen, um sie weiter zu verarbeiten. Wie hier gezeigt, erscheint nach der Entnahme der Organe aus der Körperhöhle die Niere als ein einzelnes, abgeplattetes Organ, das über Bindegewebe mit der Rückenwand verbunden ist.In dieser Abbildung wurde die Niere schematisch vergrößert, um ihre charakteristische anatomische Form darzustellen. Hier sind Kadin-17-Transkripte, die durch Whole-Mount-C2-Hybridisierung der Niere nachgewiesen wurden, in den Tubuli adulter Nephronen sichtbar, wobei die rechte Ansicht eine vergrößerte Darstellung der Tubulusfärbung zeigt. In dieser Abbildung ist auf der linken Seite zu erkennen, dass M-A-F-B-A-Transkripte in proximalen Nephron-Zelltypen der adulten Niere lokalisiert sind.Die vergrößerte Ansicht der M-A-F-B-A-Expression, wie rechts dargestellt, zeigt, dass die Transkripte spezifisch in den Podocyten-Zellen der Gliome lokalisiert sind, wie durch das p und den Pfeil angegeben, sowie im proximalen gewundenen Tubulus, gekennzeichnet durch die Abkürzung PCT und die eckige Klammer. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die inneren Organe des adulten Zebrafisches vorsichtig zu entfernen, um die Niere vor ihrer chirurgischen Isolierung nicht zu beschädigen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Histologie oder die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung eingesetzt werden, um die ultrastrukturellen Merkmale von Blut- und Nierenzellpopulationen zu untersuchen oder spezifische Populationen für die Zelltransplantation oder die primäre Zellkultur zu isolieren.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung und seziert Organe von den erwachsenen Zebrafisch.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Zell-Transplantation ist eine wesentliche Technik zur Untersuchung der Geweberegeneration sowie für die Entwicklung zellbasierter Therapien von Krankheiten. Wir zeigen hier eine mikrochirurgische Technik, dass die Transplantation von genetisch markierten Zellen ermöglicht direkt in der Niere der erwachsenen Zebrafisch Fisch.

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Dieses Video zeigt das Sezieren und Vorbereiten einer flachen Halterung der adulten Zebrafischniere. Die vorbereitete flache Halterung kann für die Probenanalyse unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden.

Preparation of Kidney Flat Mount: Ein Verfahren zum Präparieren und Vorbereiten eines Flat Mount für die mikroskopische Analyse der Niere eines adulten Zebrafisches

In diesem Video zeigen wir die Depigmentierung der adulten Zebrafischniere und ihre anschließende Vorbereitung für Färbeverfahren. Nach der Färbung kann die adulte Zebrafischniere zur Untersuchung der Nierenregeneration, zur phänotypischen Charakterisierung von Nierenerkrankungsmodellen und zur Nephronfunktionalität verwendet werden.

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Der Zebrafisch adulten Niere ist ein ausgezeichnetes System für Nierenregeneration und Krankheit Studien. Ein wesentlicher Aspekt dieser Forschung ist die Beurteilung der nephron Struktur und Funktion. Dieses Protokoll beschreibt mehrere Methoden, die implementiert werden, um Nephron Tubuli Zusammensetzung zu beurteilen und renale Reabsorption zu bewerten.

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Hier stellen wir eine zuverlässige Methode vor, um die Nierenregeneration bei Erwachsenen zu untersuchen, indem eine akute Nierenschädigung durch Gentamicin-Injektion induziert wird. Wir zeigen, dass die Schädigung von der Gentamicin-Dosierung und der Umgebungstemperatur abhängt, indem wir in situ Hybridisierung verwenden, um lhx1a+ zu markieren und neue Nephrone zu entwickeln.

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Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Induzieren akute Nierenverletzung (AKI) bei erwachsenen Zebrafischen mit Cisplatin als Nephrotoxisches Mittel. Wir haben die Schritte zur Bewertung der Reproduzierbarkeit der Technik und zwei Techniken zur Analyse von Entzündungen und Zelltod im Nierengewebe, Durchflusszytometrie bzw. TUNEL detailliert beschrieben.

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