Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine gezielte Markierung von Nierenzellen in der embryonalen Zebrafischniere, dem Pronephros, durchzuführen, um die Regeneration renaler epithelialer Zellen nach einer akuten Nierenschädigung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zebrafischembryonen mit einem fluoreszierenden Dextrankonjugat mikroinjiziert werden. Während einer Übernachtinkubation werden die Konjugate selektiv von den proximalen Tubuluszellen des Nephrons aufgenommen.

Am nächsten Tag werden die Zellen unter Epifluoreszenz untersucht und ausgewählte Zellen mithilfe eines gepulsten Lasersystems ablatiert. Später werden morphologische und molekulare Veränderungen mittels Histologie, Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie analysiert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der akuten Nierenschädigung durch das nephrotoxische Antibiotikum Gentamicin besteht darin, dass solche Behandlungen katastrophale Schäden verursachen und letal sind, wodurch eine Analyse der renalen Regenerationsvorgänge über die Zeit ausgeschlossen wird.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Nierenforschungsbereich beantworten, beispielsweise die Identifizierung molekularer Signalereignisse, die während der epithelialen Regeneration auftreten. Die Idee zu dieser Technik entstand, als wir eine detaillierte Analyse der renalen epithelialen Regeneration in Petrischalen entwickeln wollten. Sammeln Sie befruchtete Zebrafischeier in modifizierter E3-Lösung ohne Methylenblau.

Züchten Sie die befruchteten Embryonen bei 28,5 Grad Celsius, bis sie sich zwischen 48 und 55 Stunden nach der Befruchtung befinden, zu einem Zeitpunkt, zu dem das Nierensystem des Embryos bereits funktioniert. Bevor Sie mit den Injektionen beginnen, stellen Sie einen aros-Injektionshalter mit Hilfe einer Form mit dreieckigen Vertiefungen her, um die Embryonen zu fixieren. Bereiten Sie anschließend Standard-Mikroinjektionsnadeln und eine Injektionslösung zur Markierung des proximalen Tubulus vor. Beginnen Sie das Experiment mit der Vorbereitung der Embryonen.

Entfernen Sie zuerst mit feiner Pinzette den Corian aus ungeschlüpften Eiern. Spülen Sie anschließend die Corian-Reste sowie die Reste aus der Petrischale ab und füllen Sie die Schale erneut mit 30 Milliliter modifizierter E-drei-Lösung auf. Als Zweites betäuben Sie die Larven mit fünf Milliliter Trica.

Stellen Sie sicher, dass die Larven vollständig anästhesiert sind, indem Sie auf eine Berührungsreaktion prüfen. Falls sie nicht vollständig anästhesiert sind, würden sie während der Injektion zucken. Drittens geben Sie die Larven mithilfe einer Plastik-Transferpipette in die Form.

Platzieren Sie die Tiere mit dem Kopf im tiefsten Teil der Vertiefung und dem Rumpf entlang der Seite des Wells. Führen Sie nun mikroinjektionen in den Muskel durch, indem Sie eine vorbereitete Nadel mit zwei bis drei Mikrolitern Dextran-Fluorescein beladen, die Nadel positionieren und etwa ein Nanoliter der Lösung in den Rumpf jedes Tieres injizieren. Die Dextran-Konjugate werden leicht durch den proximalen Tubulus des Nephrons endozytiert, wodurch diese epitheliale Zellpopulation bevorzugt markiert wird.

Streben Sie den oberen Bereich der Somit und vermeiden Sie die Ausdehnung des Dottersacks an, andernfalls werden die Nephronentubuli gestört, wie bei diesem falsch injizierten Tier. Nach der Injektion der Larven überführen Sie diese in eine saubere Petrischale und spülen Sie dreimal mit frischem E3-Medium, um alle Rückstände von Trica zu entfernen. Nun bedecken Sie den Deckel mit Folie und inkubieren die Tiere über Nacht bei 28 Grad Celsius.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie das Immobilisierungsmedium vor und bewahren Sie einige Aliquote davon zur sofortigen Verwendung bei Raumtemperatur auf, während die restlichen Aliquote bei vier Grad Celsius zur Langzeitlagerung aufbewahrt werden. Beginnen Sie damit, die Zebrafischlarven mit fünf Millilitern Trica in 30 Millilitern E3 zu anästhesieren. Wie zuvor sicherstellen, dass die Fische nicht auf taktile Reize reagieren.

Untersuchen Sie nun die injizierten Tiere unter Fluoreszenz, um Larven mit leicht sichtbaren proximalen Tubuli auszuwählen. Überführen Sie bis zu 12 Larven in eine neue Petrischale, die die gleiche Konzentration von Trica enthält, an einem fluoreszierenden Mikroskop, das mit einem Fitzy-Filter, Hellfeldbeleuchtung und einem Laser ausgestattet ist. Die Ablation beginnt mit dem Überführen und Anästhesieren der Larven in eine Schale mit Immobilisierungsmedium.

Warten Sie zwei Minuten, dann überführen Sie die Larve auf eine Objektträgermulde mit einem Tropfen Immobilisierungsmedium. Positionieren Sie das Tier vorsichtig mit einer feinen Sonde dorsal nach oben und fokussieren Sie auf die Dorsalseite. Verwenden Sie nun ein kalibriertes gepulstes Mikrolasersystem, um einen der Nephridien zu ablatieren, während der andere als Kontrolle intakt bleibt.

Sie werden eine Streuung der Fluoreszenz beobachten, während die Nierenepithelzellen ablatiert werden. Überführen Sie das Tier dann vorsichtig in eine Vertiefung einer 12-Loch-Platte und spülen Sie es dreimal mit E3-Medium aus, um das Methylcellulose zu entfernen. Fahren Sie mit der Ablation von Nephronen fort, bis die erste 12-Loch-Platte gefüllt ist.

Dann betäuben Sie weitere 12 Tiere und wiederholen Sie den Vorgang. Dextra Fitzy wurde injiziert, um den proximalen Tubulus bevorzugt zu markieren. Drei Tage nach der Befruchtung wurde das Nephron jedes Tieres mittels Laser ablatiert.

Ein Tag nach der Ablation. Vier Tage nach der Ablation ist keine Regeneration erkennbar, jedoch hat eine Regeneration nach der Ablation von Zellen *in situ* zwei stattgefunden. Die Hybridisierung wurde verwendet, um Veränderungen in fixierten Proben zu einzelnen Zeitpunkten zu analysieren.

Dieses Embryo wurde keiner Ablation unterzogen. Im Gegensatz dazu wurde bei diesem Embryo ein großer Abschnitt des tubulären Epithels ablatiert, und bei diesem Embryo wurde ein kurzer Abschnitt des tubulären Epithels ablatiert. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Ganzpräparat-In-situ-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise nach der Identität von Genexpressionsänderungen während der Nephronregeneration.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Chemikalien äußerst gefährlich sein kann. Es wird empfohlen, während dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, beispielsweise eines Laborkittels und von Handschuhen, zu beachten.