Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben
29. Juli 2011
Hier haben wir eine Methode zur Wirksamkeit von Medikamenten-Tests mit chirurgischen Proben von Hirntumoren, sogenannte "Tumor-Explantat-Methode". Mit dieser Methode können wir Wirksamkeit von Medikamenten ohne die Mikroumgebung von soliden Tumoren zu bewerten. Zur Validierung Zuverlässigkeit dieser Methode beschreiben wir repräsentative Daten mit unseren Gliom Probe mit der gängigen First-Line Chemotherapeutikum Temozolomid behandelt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine neuartige Methode zur Wirksamkeitsprüfung von Arzneimitteln mit chirurgischen Proben von Gehirntumoren, die als Tumor-X-Explan-Methode bezeichnet wird, zu etablieren. Dies wird zunächst erreicht, indem frisch entnommene chirurgische Proben von malignen Gliomen während einer Operation für präklinische Experimente gesichert werden. Anschließend werden die Proben an die zentrale Einrichtung für Gewebebeschaffung transportiert, um sie für klinische Diagnosen und Forschungszwecke aufzubereiten.
Dann werden im Forschungslabor Tumorexplantate in mehrere kleinere Gewebestücke sezieren und in ein optimiertes Medium überführt. Schließlich werden intratumorale Injektionen mit Wirkstoffkandidaten durchgeführt und die Explantate für 16 Stunden inkubiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Wirksamkeit der Behandlung mittels Hämatin- und Ein-Färbung sowie mittels Immunhistochemie mit zelltypspezifischen Markern aufzeigen.
Die Wirksamkeit von Wirkstoffen kann ebenfalls in vitro mithilfe der Durchflusszytometrie und Neurosphären-Bildungs-Assays bewertet werden. Die meisten derzeit verfügbaren Assays zur Bewertung der Wirkstoffwirksamkeit lassen eine Lücke zwischen der Wirksamkeit in aktuellen präklinischen Versuchsmodellen und der Wirksamkeit bei stationär behandelten Patienten bestehen. Insbesondere wenn Wirkstoffkandidaten an soliden Tumoren wie malignen Gliomen getestet werden, dürfen die zellulären sowie intrazellulären Signalübertragungen nicht unterschätzt werden.
Um die Unterbrechung des Mikromilieus von soliden Tumoren zu vermeiden, haben wir eine Anty-Kulturmethode mit unserem Tumor-Explantat etabliert. Nachdem die Tumoren von den Patienten entfernt wurden, werden die Proben an oder vom Institut für Pathologie übermittelt. Wir teilen die Tumorstücke in zwei Teile. Die Tumorprobe aus einem Teil wird für die Gefrierschnitttechnik und die Paraffineinbettung zur klinischen Diagnose verwendet, und der restliche Tumor gewebe wird an die Forschungslabore gesandt, um von den Forschern genutzt zu werden.
Mithilfe dieser Methode können wir das Mikroumfeld des Tumors mit benachbarten tumorassoziierten endothelialen und Immunzellen sowie normalen Gehirnzellen erhalten, die entweder den Tumor umgeben oder in Tumorkavitäten einwandern. Vor der Aufbereitung von Glioblastomgewebe flüssige Medien- und Agarlösung herstellen. Diese im Verhältnis eins zu eins mischen.
Gegeben Sie dann ein Milliliter in jede Vertiefung von sechs-Vertiefungs-Platten. Nach Erhalt von frischem Glioblastom-Multiforme-Gewebe überführen Sie es mit einer Pinzette in eine Petrischale und waschen es sorgfältig dreimal mit je fünf Milliliter eiskalter 1×-PBS unter Verwendung des chirurgischen Skalpells und der Pinzette. Schneiden Sie serielle Schnitte mit einem Durchmesser von etwa 10 Millimetern aus den präparierten Proben, um Tumorblöcke herzustellen, und überführen Sie jeden Block in eine Vertiefung einer sechs-Vertiefungs-Platte, die Agar-Medium enthält, wobei sichergestellt werden muss, dass ausreichend Luftkontakt besteht, um die Vitalität aufrechtzuerhalten.
Anschließend die Tumorproben dreimal mit einer Ein-Milliliter-Insulinspritze und einer 28-Gauge-Halbzoll-Nadel mit 5 % DMSO oder mit 2,5 Nanomolar Temozolomid oder einem neuartigen, kandidatenhaften Antikrebswirkstoff injizieren und 16 Stunden bei 37 Grad Celsius in feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach der Inkubation die Proben dreimal mit je fünf Milliliter einmaligem PBS waschen. Danach die Proben in 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Milliliter 10 %iger (Volumen pro Volumen) Formalinlösung vier Milli für 24 Stunden fixieren.
Paraffinieren Sie das Gewebe und schneiden Sie Vier-Mikrometer-Schnitte, um die Schnitte zu deparaffinisieren, anzuwärmen und zu rehydrieren. Legen Sie die Objektträger in eine Halterung und inkubieren Sie sie in den folgenden Lösungen. Spülen Sie dreimal für jeweils fünf Minuten.
Mehrfach mit 100 % Ethanol, jeweils fünf Minuten lang, dreimal. Einmal mit 95 % Ethanol für fünf Minuten und einmal mit 70 % Ethanol für fünf Minuten. Abschließend dreimal mit fließendem Leitungswasser für jeweils drei Minuten spülen.
Details zur Antigen-Retrieval und Hemmung interner Peroxidase finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Zum Blockieren der Schnitte decken Sie das Gewebe mit 10 % normalem Ziegenserum ab, geben die Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1× PBS je fünf Minuten lang.
Fügen Sie anschließend primäre Antikörper hinzu, wie beispielsweise human-spezifisches Caspase-3 oder KI-67, die mit 1× PBS verdünnt wurden, und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius am folgenden Tag. Spülen Sie die Objektträger dreimal mit 1× PBS, jeweils zehn Minuten lang. Bedecken Sie danach das Gewebe mit zwei bis drei Tropfen sekundärem Antikörper, der mit HRP markiert ist.
Legen Sie die Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie dreimal für jeweils fünf Minuten mit 1× PBS. Entwickeln Sie die Proben mithilfe eines Chromogen-DAB-Kits gemäß den Herstelleranweisungen zur Kontrastfärbung.
Die Objektträger 10 bis 15 Sekunden in Hämatin eintauchen. Anschließend drei Minuten lang mit fließendem Leitungswasser abspülen. Die Proben durch Eintauchen der Objektträger in die folgenden Lösungen dehydrieren und dann mit einem Montagemedium und einem Deckglas aufziehen.
Verwenden Sie anschließend ein Fluoreszenzmikroskop, um die Objektträger abzubilden. Das T1-gewichtete MRT-Bild mit Gadolinium-Kontrastmittelverstärkung in dieser Abbildung zeigt einen kontrastmittelverstärkten Glioblastom-multiforme- oder GBM-Tumor im rechten Frontallappen eines Patienten vor der Operation. Das postoperative Bild bestätigte die subtotale Entfernung der Läsion nach der Operation.
Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung zeigt das Vorhandensein von Nekrosen, Pseudopalisadenzellen und mikrovaskulärer Proliferation. Daher wurden diese Tumoren histopathologisch als Glioblastom (GBM) diagnostiziert, um zu untersuchen, ob diese Tumor-Explantat-Proben zuverlässig verwendet werden können. Für einen Wirkstoff-Effizienztest prüften wir die Wirkung des Medikaments Temozolomid oder TMZ. Die immunhistochemische Färbung von mit TMZ behandeltem GBM-Gewebe zeigt eine deutliche Verringerung der KI-67-positiven Tumorzellen im Vergleich zu den Kontrollproben.
Im Gegenzug ergab die Immunhistochemie mit dem Apoptose-Marker Caspase-3 keinen signifikanten Unterschied zwischen den mit TMZ behandelten Gliomproben und den Kontrollproben. Der Behandlungseffekt mit Temozolomid kann weiter charakterisiert werden, indem man diesen ex-plantierten Assay entweder mit einer In-vitro-Kultur oder mit der Durchflusszytometrie kombiniert. Wir können diese ex-plantierte Methode mit der Xenotransplantation und dem In-vitro-Sphärenbildungs-Assay zum Screening neuartiger Antikrebsmittel vergleichen.
Nachdem Sie die Tumorgewebe im Labor erhalten haben, kann der Vorgang für dieses Experiment innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden. Dieser neue Test ist nach der Dissoziation behandelnder Tumorimplantate relativ einfach durchzuführen und reproduzierbar. Wir können ihn mit In-vitro-Experimenten kombinieren.
Ein wesentlicher Vorteil dieses Assays besteht darin, dass er das Tumormikromilieu erhält. Wir erhalten positive Daten mit Temodar-behandelten Tumor-Explantaten, die mit dem Behandlungsergebnis derselben Patienten übereinstimmten, die nach der Operation eine Temodar-Behandlung erhielten. Schließlich ist dieser Ansatz auf andere solide Tumore anwendbar und könnte daher das Auffinden neuer chemotherapeutischer Wirkstoffe zur Behandlung solider Tumore beschleunigen.
Übersicht
Diese Studie stellt eine neuartige Methode zur Testung der Wirkstoffwirksamkeit unter Verwendung chirurgischer Proben von Hirntumoren, die als Tumor-Explantat-Methode bezeichnet wird, vor. Dieser Ansatz ermöglicht die Beurteilung der Wirkstoffwirksamkeit, während das Tumormikromilieu erhalten bleibt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Pharmakologie
Hintergrund
- Aktuelle Wirkstofftests versagen oft beim Überbrücken der Kluft zwischen präklinischen Modellen und Patientenergebnissen.
- Festes Tumorgewebe, wie maligne Gliome, erfordert eine sorgfältige Berücksichtigung der interzellulären Signalübertragung.
- Die Aufrechterhaltung des Tumormikromilieus ist entscheidend für eine genaue Wirkstoffprüfung.
- Die Tumor-Explantat-Methode erhält benachbarte Tumorzellen und normale Hirnzellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Prüfung der Wirksamkeit von Arzneimitteln bei Hirntumoren.
- Validierung der Tumor-Explantat-Methode an Gliomproben, die mit Temozolomid behandelt wurden.
- Beurteilung der Auswirkungen von Arzneimittelbehandlungen unter Erhaltung des Mikromilieus des Tumors.
Verwendete Methoden
- Frisch entnommene chirurgische Proben von malignen Gliomen wurden während der Operation gewonnen.
- Tumor-Explantate wurden präpariert und mit Wirkstoffkandidaten inkubiert.
- Die Wirkstoffwirksamkeit wurde mittels Immunhistochemie und Durchflusszytometrie bewertet.
- Eine histopathologische Analyse wurde zur Beurteilung der Behandlungseffekte durchgeführt.
Hauptergebnisse
- Die Immunhistochemie zeigte eine Verringerung der Ki-67-positiven Tumorzellen nach Behandlung mit Temozolomid.
- Zwischen behandelten und Kontrollproben wurden keine signifikanten Unterschiede bei Apoptosemarkern beobachtet.
- Die Tumor-Explantat-Methode erwies sich als vielversprechend für zuverlässige Wirksamkeitstests von Arzneimitteln.
- Die Ergebnisse können mit anderen präklinischen Modellen zum Zweck der weiteren Validierung verglichen werden.
Schlussfolgerungen
- Die Tumor-Explant-Methode ist ein aussichtsreiches Verfahren zur Prüfung der Wirkstoffwirksamkeit bei Gliomen.
- Diese Methode erhält das Tumormikromilieu bei, wodurch die Aussagekraft der Ergebnisse erhöht wird.
- Weitere Studien sind erforderlich, um dieses Verfahren für klinische Anwendungen zu optimieren und zu validieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Aktuelle präklinische Modelle für maligne Gliome sagen die klinische Wirksamkeit von Arzneimitteln häufig aufgrund des Verlusts der Tumormikroumgebung in vitro und aufgrund von interartlichen Unterschieden bei Xenotransplantaten nicht zuverlässig voraus. Die Tumor-Explantat-Methode schließt diese Lücke, indem sie die ursprünglichen Tumor-Stroma-Interaktionen erhält und dadurch die Beurteilung von Arzneimittelwirkungen unter physiologisch relevanteren Bedingungen ermöglicht. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominderung und erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen onkologischen Arzneimittelentwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die interzellulären und intrazellulären Signalübertragungen innerhalb des nativen Tumormikroumfelds erhalten bleiben.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen unter Verwendung frisch resektierter chirurgischer Proben ohne Dissoziationsartefakte.
- Prädiktiver Wert: Liefert frühzeitige Wirksamkeitsaussagen, die mit den Patientenergebnissen korrelieren, wie durch TMZ-behandelte Explantate gezeigt, die eine verminderte Ki-67-Proliferation aufweisen, was klinischen Ansprechen entspricht.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative histopathologische und immunhistochemische Ergebnisse (z. B. Ki-67, Caspase-3) für die Wirkstoff-Screening-Untersuchung in einem krankheitsrelevanten System.
- Operativer Wert: Standardisiert die Gewebepräparation und die Wirkstoffapplikation mittels intratumoraler Injektion und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Explantat-Chargen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Durchflusszytometrie und Neurokugel-Assays, wodurch multiparametrische Endpunkte für die Identifizierung von Leitverbindungen ermöglicht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem echte, vom Patienten stammende Tumorgewebe verwendet werden, wodurch die Aussagekraft für Go/No-Go-Entscheidungen erhöht wird.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Ermöglicht die Bewertung von Arzneimittelwirkungen auf Proliferations- und Apoptosemarker innerhalb der intakten Gewebearchitektur und verringert so falsch-positive Ergebnisse aus vereinfachten Modellen.
- Prädiktive Zuverlässigkeit: Ermöglicht den direkten Vergleich mit Xenotransplantat- und In-vitro-Modellen, um die tatsächliche Arzneimittelwirkung zu verifizieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Tumor-Explant-Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die Identifizierung von Leadsubstanzen, bevor aufwändige präklinische Modelle zum Einsatz kommen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Aufklärung von Signalwegen und die Validierung von Zielstrukturen, indem stromalepitheliale Wechselwirkungen erhalten bleiben, die für die Gliombiologie entscheidend sind.
- Screening: Liefert quantitative, histologiebasierte Messgrößen, die eine zuverlässige Bewertung von Substanzen in einem dreidimensionalen Gewebekontext ermöglichen.
- Analytik: Bietet multiplexe Auswertungen (Proliferation, Apoptose, Immuninfiltration) mittels Immunhistochemie und Durchflusszytometrie zur Analyse vergleichender Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verwendet Patientenproben, um die klinische Relevanz zu bewahren, und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern sowie die Kontinuität in der präklinischen Forschung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für das Wirkstoffscreening bei soliden Tumoren, die an verschiedene therapeutische Kandidaten und Institutionen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die Tumormikroumgebung erhalten bleibt, was das Vertrauen in die Zielstruktur und die Vorhersagekraft verbessert.
- Operationaler Wert: Steigert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Protokolle zur Explantatpräparation und Wirkstoffinkubation.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen, indem Diskrepanzen zwischen präklinischer und klinischer Wirksamkeit reduziert und das Risiko spätzeitiger Fehlschläge verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Antikrebskandidaten basierend auf menschlich relevanten Gewebereaktionen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit neurochirurgischen Proben, in der histopathologischen Färbung und in der Immunhistochemie.
- Hängt vom Zugang zu frischen chirurgischen Proben und einer koordinierten Gewebeentnahme in Zusammenarbeit mit Pathologieabteilungen ab.
- Erfordert standardisierte Mediumzubereitung, intratumorale Injektionstechniken und kontrollierte Inkubationsbedingungen (37 °C, 5 % CO2).
- Beinhaltet die Optimierung über verschiedene Tumortypen hinweg; für solide, nicht-gliomartige Krebserkrankungen ist eine Validierung erforderlich, um die Erhaltung des Mikromilieus sicherzustellen.
- Eingeschränkt durch das Zeitfenster der Gewebeviabilität nach der Resektion, das eine schnelle Verarbeitung zur Aufrechterhaltung der Integrität der Explantate erfordert.
